תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

Johannes Groen; Andrea Sorrentino; Lucía Aballe; Robert Oliete; Ricardo Valcárcel; Chidinma Okolo; Ilias Kounatidis; Maria Harkiolaki; Ana Joaquina Pérez-Berná; Eva Pereiro

doi:10.3791/62190

Summary

כאן, מוצג פרוטוקול המתאר את שלבי הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים הנדרשים בטומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של cryo (SXT) כדי לדמות את מבנה האולטרה-מבנה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו ברזולוציה של 25 ננומטר חצי גובה.

Abstract

טכניקות הדמיה הן בסיסיות על מנת להבין את ארגון התאים והמנגנונים במחקר הביולוגי ובתחומים הקשורים אליו. בין הטכניקות הללו, טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של קריו (SXT) מאפשרת הדמיה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו בטווח אנרגיית קרני הרנטגן של חלון המים (284-543 eV), שבה למבני פחמן יש ספיגה גבוהה יותר במהותה מאשר למים, מה שמאפשר שחזור תלת-ממדי של מקדם הקליטה הליניארי של החומר הכלול בכל ווקסל. מידע מבני כמותי ברמה של תאים שלמים בעובי של עד 10 מיקרומטר ניתן להשגה בדרך זו, עם תפוקה גבוהה ורזולוציה מרחבית עד לחצי גובה הצליל של 25-30 ננומטר. Cryo-SXT הוכיחה את עצמה כרלוונטית למחקר הביו-רפואי הנוכחי, מספקת מידע תלת-ממדי על תהליכי זיהום תאיים (וירוסים, חיידקים או טפילים), שינויים מורפולוגיים עקב מחלות (כגון מחלות גנטיות רצסיביות) ומסייעת לנו להבין את פעולת התרופה ברמה התאית, או איתור מבנים ספציפיים בסביבה התאית התלת-ממדית. בנוסף, על ידי ניצול אורך הגל הניתן לכוונון במתקני סינכרוטרון, ספקטרו-מיקרוסקופיה או מקבילתה התלת-ממדית, ספקטרו-טומוגרפיה, יכולה לשמש גם כדי לדמות ולכמת אלמנטים ספציפיים בתא, כגון סידן בתהליכי ביו-מינרליזציה. Cryo-SXT מספק מידע משלים לטכניקות הדמיה ביולוגיות אחרות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים, פלואורסצנציה של קרני רנטגן או פלואורסצנציה של אור נראה, והוא משמש בדרך כלל כשיטה שותפה להדמיה מתאמית דו-ממדית או תלת-ממדית בתנאים קריוגניים על מנת לקשר בין תפקוד, מיקום ומורפולוגיה.

Introduction

Cryo-SXT יכול למלא תפקיד מרכזי במחקר ההדמיה הביולוגית מכיוון שהוא מספק נפחים ברזולוציה בינונית תלת-ממדית (25-30 ננומטר חצי גובה הצליל) של תאים שלמים מיובשים 1,2,3,4,5,6. בטווח האנרגיה של חלון המים, בין קצוות K של ספיגת הפחמן והחמצן (4.4-2.3 ננומטר), מבנים תאיים עשירים בפחמן סופגים פי 10 יותר מהתווך העשיר בחמצן המחלחל ומקיף אותם. בטווח אנרגיה זה, ניתן לצלם תאים בעלי עובי של עד 10 מיקרומטר ללא צורך בחתך או בכתמה, מה שמוביל להקרנות ניגודיות ספיגה גבוהות כמותיות, אשר בשילוב עם יכולות סיבוב הדגימה, מאפשרות שחזור טומוגרפי של מבנה התא. Cryo-SXT ממלא נישה במונחים של ממדי דגימה ורזולוציה מרחבית שאינה נגישה בקלות על ידי שום טכניקת הדמיה אחרת.

בקצרה, ניגודיות הקליטה של cryo-SXT היא כמותית, שכן הנחתת הפוטונים באמצעות דגימת העובי t מצייתת לחוק באר-למברט באופן הבא: figure-introduction-1023 , כאשר I₀ מייצג את עוצמת האירוע μ_l מקדם הקליטה הליניארי, התלוי באורך הגל λ ובחלק הדמיוני β של מקדם השבירה של הדגימה ( figure-introduction-1279 ). הנחתה היא פונקציה של ההרכב הביוכימי ועובי המבנים המצולמים, כאשר לכל רכיב ביוכימי יש מקדם ספיגה ליניארי ספציפי של קרני רנטגן μ_l (LAC). משמעות הדבר היא שכל ערך ווקסל טומוגרפיה תלוי ביסודות הכימיים ובריכוזם באותו ווקסל⁷. זה מאפשר אפליה טבעית של אברונים שונים כגון גרעינים, גרעין, גופי שומנים או מיטוכונדריה, או מצבי דחיסה שונים של כרומטין אך ורק על סמך ערכי LAC הטבועים בהם משוחזרים ^2,8,9.

בנוסף, cryo-SXT היא טכניקת תפוקה גבוהה עם טומוגרמות שנאספות תוך מספר דקות. זה מאפשר באופן ספציפי הדמיה מזוקלית של אוכלוסיות תאים שניתן ללכוד בנקודות זמן מרכזיות כגון חלוקה, התמיינות ואפופטוזיס, אך גם במצבי תגובה שונים כגון אלה המושרים על ידי חשיפה כימית לטיפולים תרופתיים ספציפיים או לזיהומים פתוגניים. נתונים שנאספו בנקודות מפתח אלה יספקו תיאור תלת-ממדי של המערכת עם תיעוד נאמן של הארגון המרחבי של האברונים התאיים השונים באותם רגעים ספציפיים.

בדרך כלל, cryo-SXT משמש בשילוב עם טכניקות אחרות בעקבות גישות מתאמות המאפשרות איתור תכונות ספציפיות, אירועים או מקרומולקולות בתוך הסביבה התאית התלת-ממדית 4,10,11,12,13,14,15,16, או נתוני פלואורסצנציה של קרני רנטגן קשיחות ^17,18 . גישות קורלטיביות בתנאים קריוגניים הן בעלות חשיבות עליונה על מנת לקבל את התמונה השלמה והיקרה ביותר של מערכת העניין. סיכום תמציתי של זרימת העבודה האופיינית בקווי הקרן של מיסטרל (אלבה) ו-B24 (יהלום) משורטט באיור 1.

יתר על כן, תוך ניצול יכולת כוונון אורכי הגל במתקני סינכרוטרון, ניתן לקבל מידע ספקטרוסקופי בנוסף למבנה באמצעות הקליטה הדיפרנציאלית הספציפית של אלמנטים מסוימים הכלולים בדגימה. דוגמה לכך תהיה המיקום של סידן בחקר תהליכי ביומינרליזציה בתאים ^19,20,21. על ידי צילום תמונות דו-ממדיות באנרגיות פוטונים שונות (ספקטרה) או טומוגרמות מתחת ובקצה העניין של בליעת קרני הרנטגן, ניתן לזהות את הפיקסלים או הווקסלים המכילים את האלמנט שנבחר. ספקטרה גם מאפשרת הבחנה בין מצבים כימיים (כלומר, אבולוציה של סידן אמורפי להידרוקסיאפטיט כמו בדוגמה הקודמת של ביו-מינרליזציה²⁰). כימות של אלמנטים שונים אפשרי בדו-ממד ובתלת-ממד. הדמיה ספקטרוסקופית של תאים מרוטשים נעשית בדרך כלל בחלון המים, אך היא אפשרית גם בטווחי אנרגיה אחרים אם תכולת המים נמוכה מספיק או אם נעשה שימוש בפרוטוקולים אחרים להכנת דגימה, כולל התייבשות,²². פרוטוקול ספקטרוסקופי מפורט שלב אחר שלב הוא מעבר למוקד הפרוטוקול כאן.

בהמשך, הפרוטוקול מתמקד בסיכום קצר של שלבי הכנת הדגימה העיקריים, אם כי כל מערכת עשויה להזדקק לעידון אישי, ולאחר מכן הליך איסוף נתונים מפורט שלב אחר שלב עבור טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות cryo.

Protocol

1. הכנה לדוגמה

הכנת התמיכה ברשת
1. הקרינו את הרשתות עם UV במשך 3 שעות כאשר סרט הפחמן פונה כלפי מעלה לצורך עיקור.
2. אופציונלי: במקרה של בעיות בתאים שאינם מתחברים לרשת, השתמש באחד מהשלבים הבאים.
  1. הידרופיליזציה של רדיד תומך הפחמן על ידי טיפול פלזמה ברשתות כדי להגביר את התפשטות הדגימה ולהידבקות טובה יותר של התאים.
    1. מקם את הרשתות בצד הפחמן בציוד תא הפריקה הזוהר וחשוף את הרשת לפלזמה למשך 30 שניות עד 15 דקות (באמצעות Ar או / ו- O₂) בהתאם לציוד.
  2. פונקציונליזציה של הרשתות באמצעות Poly-L-lysine (PLL)
    1. הוסיפו טיפות בודדות של 60 μL PLL בצלחת פטרי והניחו את הרשת על גבי טיפת ה-PLL כשסרט הפחמן פונה כלפי מטה. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והכתימו את ה-PLL באמצעות נייר סינון.
  3. פונקציונליזציה של הרשתות עם סרום בקר עוברי (FBS).
    1. טבלו את הרשתות ב-FBS במהלך הלילה. טבלו את הרשתות בתמיסת חיץ כדי לשטוף והשאירו את הרשת על נייר מסנן כדי להסיר עודפי נוזלים.
גידול תאים דביקים ברשתות
1. לגדל תאים בצלחת תרבית תאים של 100 מ"מ כדי להגיע ל-80%-90% מפגש (איור 2A).
2. זרע 1-5 x 10⁵ תאים/מ"ל (התאם את הערך למערכת) על גבי רשתות Au בצלחת P60 Petri (3 מ"ל בסך הכל).
  הערה: התוספת של תרחיף התא צריכה להיעשות בזהירות רבה עם סרט הפחמן של הרשת הפונה כלפי מעלה בצלחת תרבית תאים של 60 מ"מ. הכינו מספר רשתות לכל תנאי, תנאי אחד לכל צלחת פטרי P60 (איור 2B).
3. אפשרו לתאים להתיישב עד שהמפגש ברשת יגיע למספר תאים (1 עד 10 בהתאם לגודל התא) בכל ריבוע רשת (תלוי בקו התא, זה יכול לקחת עד 24 שעות).
  הערה: לפני ההקפאה, יש לבדוק את הרשתות באמצעות מיקרוסקופ אור נראה (VLM), המעריך את שלמות סרט הפחמן וכן את מפגש התאים בכל רשת (איור 2C). המתן עד שתגיע לצפיפות התאים המתאימה ברשת. אם הרשת מתמזגת מדי או שרדיד הפחמן שבור, התחילו מחדש.
תצהיר תאים בתרחיף ברשתות
1. בחרו רשת Au או Cu מוכנה באמצעות הפינצטה מהמקפיא (ראו סעיף 1.6).
2. הכינו תרחיף של 1-5 x 10⁵תאים (ספיגת צפיפות אופטית של 0.3 במקרה של חיידקים) והוסיפו 4 μL של התרחיף המוכן לרשת.
3. דגירו את הרשת עם הצניחה למשך מספר דקות אופקית כדי לאפשר תצהיר של התאים ולאחר מכן הניחו את הפינצטה המחזיקה את הרשת בתוך תא הוויטריפיקציה מבוקר האקלים המותאם לתנאי הטמפרטורה והלחות המתאימים (שלב 1.6.1).
אופציונלי: תיוג פלואורסצנטי של הדגימות
הערה: זה יכול להיות מועיל לתייג באופן פלואורסצנטי כמה אברונים של המדגם. בהתאם לעניין, ניתן להשתמש בפלואורופורים או בתאים ספציפיים המבטאים ביציבות חלבון פלואורסצנטי או טרנספקט לביטוי חולף של חלבון בעל עניין. זה מאפשר זיהוי קל של תאים באמצעות מיקרוסקופיה קריו-אפיפלואורסצנטית ומסייע במציאת תאים בעלי עניין להדמיית רנטגן לאחר מכן. בהמשך, הפרוטוקול מפרט רק את השימוש בפלואורופורים.
1. הכינו פתרון עבודה לפלואורופור (ראו המלצת היצרן) ועקבו אחר הפרוטוקול הספציפי.
2. מוסיפים את הפלואורופורים לצלחת הפטרי המכילה את הרשתות ומערבבים בעדינות.
3. השאירו לדגירה בסביבה חשוכה ולכו ישירות לשלב 1.6 לאחר סיום הדגירה.
  הערה: חשוב להיות מוכנים לוויטריזציה לאחר סיום הדגירה כדי למנוע תיוג לא ספציפי וכתוצאה מכך אות פלואורסצנטי מטושטש.
הכנת ננו-חלקיקים Au (NPs) ליישור היטל טומוגרמה
1. קח אליקוט אחד של 1 מ"ל של תמיסת המניות Au fiducial (100 ננומטר במיסטרל או 250 ננומטר ב- B24) וצנטריפוגה במהירות נמוכה (כדי למנוע צבירה) למשך דקה אחת כדי לאפשר ל- NPs לכדור.
  הערה: במידת האפשר, עדיף להשאיר את הפידוקיאלים להתיישב באופן טבעי בן לילה או יותר, כדי למנוע צבירה.
2. הסר את ה-supernatant. מיד לפני ההקפאה, השעו מחדש את ה-NPs בתמיסת 20 μL ללא סרום או בתמיסת מאגר כדי להשיג תמיסה הומוגנית.
  הערה: מומלץ לסוניקציה ולמערבולת כדי לסייע בהומוגניזציה של הפתרון.
רשתות הקפאה צוללות
אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לכוויות קרות ויש ללבוש ציוד מגן מתאים (מעיל מעבדה ארוך, משקפי בטיחות, כפפות, מכנסיים ארוכים ונעליים סגורות). אתאן הוא נפיץ מאוד ויש להרחיק אותו מכל ניצוצות או לפתוח באש.
1. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להכין ולהשתמש במכשיר ההקפאה.
  הערה: הלחות נקבעת בדרך כלל על 80%-90%; הטמפרטורה תהיה תלויה בסוג התא (שמרים 30 מעלות צלזיוס לכל היותר, תאי יונקים 37 מעלות צלזיוס, תאי חרקים 28 מעלות צלזיוס וכו').
2. קחו רשת עם הפינצטה המורכבת מצלחת פטרי ליד החישוק, נזהרו מאוד לא לכופף את הרשת ולהרכיב אותה על מכשיר המקפיא. ודא שהתאים פונים הרחק מנייר הכתם.
3. אופציונלי: לשטוף את הרשת שלוש פעמים במאגר במקרה של תאים דביקים.
4. הוסיפו 1.5 μL של fiducials Au NP על גבי התאים (דרך החור בצד ימין של התא) והשאירו להסתפק ב-30 שניות לפני שאתם מכתימים וצוללים את הרשת.
  הערה: במקרה של תאים בהשעיה, הוסיפו את ה-Au NP fiducials לרשת בזמן שהיא עדיין במצב אופקי לפני הרכבת הפינצטה ותנו להם להסתפק ב-30 שניות. כתם הוא קריטי עבור רשתות באיכות גבוהה. יש לכייל את מרחק הכתם לפני שמתחילים; שטוחות של נייר כתם חשובה לכתם הניתן לשחזור (בצע הוראות של היצרן). יש להעריך את זמן הכתם עבור כל סוגי התאים.
5. הכן מספר רשתות לכל תנאי. מעבירים את הרשת ומאחסנים בטמפרטורות קריוגניות כדי לשמר את הוויטריפיקציה.
רשתות הקרנה עם מיקרוסקופיית אור נראה קריו
1. העבר את הרשתות מתחת לחנקן נוזלי מקופסאות הקריו לקלטת קריו סטנדרטית (שלושה מיקומים עבור רשתות TEM של 3 מ"מ) בתוך שלב קריו מקורר מראש (ראה הוראות מהיצרן).
2. הקריו-קסטה מונחת על גשר שלב הקריו ושלב הקריו מותקן על מיקרוסקופ אור אפיפלואורסצנטי רחב שדה.
3. דמיינו את הרשתות בטמפרטורה של -196.5 מעלות צלזיוס באמצעות מטרה למרחק עבודה ארוך (10x, 50x, 100x) על מנת לאתר תאים מתאימים להדמיית cryo-SXT ולהעריך את איכות הרשת (נוכחות של קרח עבה, שלמות סרט התמיכה בפחמן, נוכחות של אות פלואורסצנטי וכו ').
4. למקם את התאים המעניינים באמצעות הדמיית שדה בהיר או/ו פלואורסצנטי.
  הערה: בשלב זה, צלם את התמונות אם מצלמה מקושרת נמצאת במיקרוסקופ. השתמש בו למתאם תמונה.
5. לאחר ההקרנה, החזירו את הרשתות לקופסאות הקריו במחסן חנקן נוזלי.
  הערה: אם לא נמצאו דגימות טובות, חזור על שלבי ההכנה לדוגמה המשנים כל אחד מהפרמטרים. בדרך כלל, הפרמטרים הדורשים שינוי הם זמן כתם, במקרה שהקרח עבה מדי או המפגש, אם יש יותר מדי תאים לכל ריבוע רשת.

2. טעינה למיקרוסקופ הרנטגן (TXM)

מקררים את תא ההעברה בחנקן נוזלי עד שהוא מגיע <100 K, מקררים את תחנת העבודה (איור 3A) ומפעילים את תנור החימום של שפת תחנת העבודה. המתן עד שהוא יפסיק לרתוח.
הכניסו את תיבות ה-cryo הדרושות המכילות רשתות למיקומים המתאימים בתחנת העבודה (איור 3A). שימו לב להעביר אותם בבטחה בתנאי קריו.
טען את הרשתות שנבחרו למחזיקי הדגימות שהתקררו בעבר (איור 3B); העמיסו את המחזיקים על המעבורת והגנו עליהם באמצעות הכיסויים (איור 3C).
טען את המעבורת לתא ההעברה במהירות של <100 K ושאב אותה לשואב ואקום נמוך (איור 3D).
חברו את תא ההעברה ל-TXM (איור 4A) וטענו את המעבורת מתא ההעברה לתוך ה-TXM לאחר הליך הוואקום שעל המסך (איור 4B).
ברגע שהמעבורת נמצאת בפנים עם הדגימות, זרוע הרובוט TXM יכולה להביא מחזיק דגימה אחד בכל פעם לשלב הדגימה (איור 4C).

3. הדמיה באמצעות תוכנת TXM

הערה: הרשתות בשלב הדגימה מצולמות תחילה באמצעות מיקרוסקופ אור נראה מקוון (VLM) כדי למפות את הרשת במצב שדה בהיר ו/או פלואורסצנטי לפני שהן מצולמות באמצעות קרני רנטגן. השתמש בסמל הג'ויסטיק המתאים לכרטיסיה בקרת תנועה בחלונית השמאלית העליונה כדי לפתוח את בקרת התנועה.

הדמיית הרשת באמצעות ה-VLM המקוון.
1. רכישת פסיפס שדה בהיר
  1. בחר את מצלמת ה- VLM (עדשה מגדילה > VLM) והפעל את מקור ה- LED של VLM להדמיית שדה בהיר (מיקרוסקופ > רכישת > > הגדרות רכישה > הגדרות מקור ובחר שידור).
  2. סובב את הדגימה ל-60- מעלות כדי להתמודד עם מטרת ה-VLM (בקרת תנועה > דגימה > מדגם θ) והעביר את הדגימה למיקומים הממורכזים הצפויים (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה X, מדגם Y).
  3. בעת רכישת תמונות בשלבים של 20 עד 50 מיקרומטר תחילה כדי להביא את הרשת בערך למיקוד (מיקרוסקופ > > רכישת > הגדרות רכישה > מצבי רכישה > התחלה רציפה >; בקרת תנועה > דגימה ושינוי מדגם Z).
  4. מקד את המיקוד בצעדים קטנים יותר עד 5 מיקרומטר עד שהתאים ו/או החורים של סרט התמיכה בפחמן יהיו בפוקוס (מיקרוסקופ > > > > הגדרות רכישה > מצבי רכישה > > רציף התחלה; בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה Z) ולהתחיל ברכישת מפת פסיפס מלאה של הרשת במצב שדה בהיר. השתמש בערכי ברירת המחדל של הפסיפס. (מיקרוסקופ > > > רכישה > מצבי רכישה > Mosaic > Start).
    הערה: מפת פסיפס עשויה מתמונות בודדות. יש להגדיר את מספר התמונות (מספר העמודות, השורות וגודל הצעד ב- X ו- Y) כדי להציג באופן חזותי את הרשת כולה. גודל הצעד תלוי בגודל שדה הראייה (FoV). ערכי ברירת המחדל משמשים כאן. אם הרשת אינה ממורכזת היטב במישור X-Y ביחס לפסיפס המלא FoV, עצרו את הרכישה, תקנו את הקואורדינטות של דגימת X ו-Y וחזור על הרכישה.
2. רכישת פסיפס מצב פלואורסצנטי
  1. כבה את המקור בהובלת VLM להדמיית שדה בהיר (מיקרוסקופ > רכישת > > הגדרות רכישה > הגדרות מקור ותיבת הילוכים ללא בחירה) ובחר את מקור אור ה- LED המתאים לאורך הגל הרצוי של עירור (אדום, ירוק או כחול) ואת המסנן האופטי המתאים באופן ידני בהגדרה.
  2. חדד את ההתמקדות בתמונת הפלואורסצנציה ( מיקרוסקופ > > רכישה > הגדרות רכישה > מצבי רכישה > התחלה > רציפה; בקרת תנועה > דגימה ושינוי של דוגמה Z), ולאחר מכן לרכוש מפת פסיפס השומרת על פרמטרי המיקום (X ו- Y) מפסיפס השדה הבהיר (מיקרוסקופ > רכישה > הגדרות רכישה > מצבי רכישה > Mosaic > Start).
  3. כבה את מקור הנורית LED
  4. אופציונלי: בהתבסס על מפות השדה הבהיר והפסיפס הפלואורסצנטי, ביאור אזורי העניין (ROI) שזוהו קודם לכן (שלב 1.7.4) או ROI חדש (מיקומי X-Y בתמונה).
פסיפס רנטגן
1. בחר את גלאי קרני הרנטגן CCD (עדשה מגדילה > בחר Pixis), הבא את הדגימה לסיבוב של 0 מעלות (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה θ) והזז את אופטיקת קרני הרנטגן (מעבה ולוח אזור) למיקומים המיושרים (בקרת תנועה > מעבה > שינוי מעבה z; בקרת תנועה > לוחית אזור ושינוי לוחית אזור Z).
  הערה: צמצם את שבב ה- CCD ל- -65 °C לפני ההדמיה (מיקרוסקופ > טמפרטורת המצלמה > Pixis ושנה את הטמפרטורה שנקבעה ל -65 °C ולחץ על החל).
2. הזז את הדגימה למרכז ריבוע הרשת של אחד מהחזרי ההשקעה שנבחרו (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה X, מדגם Y).
3. השתמש ב- binning 2 וביציאה מחריץ ב- 5 μm כדי למזער הקרנה וחשיפה של 1 שניות ב- Mistral, ובחיבור 1 ו- 60 μm ב- B24, התאם את המיקוד באמצעות תרגום Z לדוגמה (מיקרוסקופ > רכישה > הגדרות רכישה > הגדרות מצלמה ושינוי חיבור; בקרת תנועה > XS ושינוי XS; מיקרוסקופ > רכישת > > הגדרות רכישה> מצבי רכישה > > התחלה > רציפה; בקרת תנועה > לדוגמה ושינוי מדגם Z). התחילו בשלבים של 5 מיקרומטר ושכללו אותו עד למדרגות של 0.5 מיקרומטר, עד שהתא או חורי רדיד הפחמן נמצאים במיקוד טוב.
4. רכשו מפת פסיפס של ריבוע הרשת (מיקרוסקופ > רכישה > הגדרות רכישה > מצב רכישה > Mosaic > Start).
  הערה: פרמטרים של רכישת פסיפס יכולים להיקבע באותו אופן כמו עבור פסיפסי VLM (סעיף 3.1.1.1.4). גודל הצעד תלוי בהגדלה שנבחרה מראש על ידי צוות קו הקרן.
5. העבר את הדגימה למצב שדה שטוח (FF) (אזור ריק בתוך הרשת, רצוי חור בתמיכת הפחמן) (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה X, מדגם Y).
6. הגדר את זמן החשיפה ל-1 שניות במיסטרל ו-0.5 שניות ב-B24 (מיקרוסקופ > > רכישה > הגדרות רכישה > הגדרות מצלמה > הגדרות מצלמה ושנה את זמן החשיפה) ורכוש תמונה אחת (מיקרוסקופ > רכישה > מצבי רכישה > התחלה > יחיד).
7. נרמל (חלק) את הפסיפס הנרכש על-ידי תמונת ה-FF כדי לקבל את השידור (עם ערכים בין 0 ל-1) ושמור את הפסיפס המנורמל (לחץ על סמל הפינה הימנית העליונה הימנית הראשונה בצד ימין של התמונה כדי לפתוח את התפריט>כרטיסיית הפניה> לחץ על הפניה יחידה ועיין ב- FF הספציפי).
הכנה לאיסוף סדרת הטיה של קרני רנטגן
הערה: מצא את ציר הסיבוב עבור כל אזור מעניין המוצג בתמונה.
1. בצע מבחר של אזורים בתוך הפסיפסים כדי לבצע טומוגרפיה, כלומר, על ידי הצבת צורה מרובעת (לחץ על כלי בצד שמאל של חלון התמונה) עם גודל ה- FoV במפת פסיפס הרנטגן.
  הערה: בעת בחירת אזורים, שקול את המרחק מהגבול (≥10 מיקרומטר) ותאים אחרים, כדי למנוע חפיפה של תאים במהלך הסיבוב. בנוסף, בדקו את מצבו של התא (צורת התא הצפויה, עובי הקרח, הצלחת הוויטריפיקציה, התפשטות הפידוקיאלית וכו').
2. יישור לדוגמה בציר הסיבוב
  הערה: ההליך המדווח הוא איטרטיבי. האיטרציה מתכנסת מהר יותר באמצעות זוויות ± של 60° כזוויות סיבוב מרביות (θ_M). אם הם אינם נגישים, השתמש בזוויות קרובות ככל האפשר כדי ± 60°.
  1. הגדר את המצלמה ל- binning 2, זמן חשיפה 1 s (מיקרוסקופ > רכישה > הגדרות רכישה > הגדרות מצלמה ושינוי זמן חשיפה; שנה את Binning; מיקרוסקופ > רכישה > מצבי רכישה > התחלה רציפה של >), קבעו את חריץ היציאה ל-5 מיקרומטר.
    הערה: למזער את המינון ככל האפשר על ידי עבודה עם צמצם מינימלי של חריץ יציאה.
  2. עם הסיבוב ב-0°, עבור לאזור שנבחר בעבר באמצעות מדגם X ותרגום מדגם Y והתמקד בתכונה של התא כדי להכניס את ציר הסיבוב באמצעות תרגום מדגם Z (בקרת תנועה > לדוגמה ולשנות דגימה x; מדגם y; דוגמה z).
  3. סובב את הדגימה ל- + θ_M (בקרת תנועה > לדוגמה ושנה דגימה θ) וצייר קו (L+) (לחץ על כפתור כלי הקו בצד ימין של חלון התמונה) על התכונה של התא כדי לשים על ציר הסיבוב.
  4. סובב ל- -θ_M (בקרת תנועה > לדוגמה ושנה דגימה θ) וצייר קו (L-) (לחץ על כפתור כלי הקו בצד ימין של חלון התמונה) על התכונה של התא שברצונך לשים על ציר הסיבוב.
  5. בעוד שב- +θ_M או -θ_M, השתמש בתרגום לדוגמה Z כדי להזיז את התכונה שנבחרה למיקום המרכזי בין שתי השורות (בקרת תנועה > לדוגמה ושינוי דגימה Z).
  6. חזור על ההליך משלב 3.3.2.3 באופן איטרטיבי עד להגעה למרחק מינימלי L+ ל- L.
    הערה: המרחק בין שני הקווים L+ ו-L- צריך להיות קטן יותר ביחס לאיטרציה הקודמת.
  7. בדוגמה θ = 0 (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה θ), הזז דגימה X מרחק כפול מהמרחק הדרוש כדי לשים את התכונה שנבחרה במרכז שני הקווים (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה X). הזז את לוחית האזור (ZP) X כדי להחזיר את התכונה למרכז ה- FoV (בקרת תנועה > ZP ושינוי ZP X). בצע שלב זה פעם אחת בלבד בכל רשת.
  8. אופטימיזציה מחדש של מיקום ZP Z ביחס לציר הסיבוב החדש על ידי הקלטת סדרת מוקד ZP Z (אוספים של תמונות במיקומי ZP Z שונים, בדרך כלל בשלבים של 0.3 מיקרומטר) (מיקרוסקופ > רכישה > > הגדרות רכישה > מצבי רכישה > סדרת מוקד > התחלה) והזיזו את ZP Z למיקום שבו המדגם נמצא בפוקוס (בקרת תנועה > לוחית אזור ושינוי לוחית אזור z).
  9. הגדר את הפרמטרים לרכישת סדרת ההטיה.
    הערה: הטווח הזוויתי המרבי מוגבל בסופו של דבר על ידי אורך המוקד של ZP (±70 או ±65 מעלות עבור ZP של 40 ננומטר או 25 ננומטר עבור מדגם שטוח, בהתאמה). מטב את יחס האות לרעש (S/N) ואת נזקי הקרינה כדי להגדיר את זמן החשיפה. עבור טומוגרפיה, השתמש בזמני חשיפה שונים בטווחים זוויתיים שונים.
  10. קבע את טווח הסיבוב הזוויתי הגבוה ביותר, במקרה שמתרחשת הצללה לפני שמגיעים לזווית הסיבוב המרבית.
  11. הגדר את חיבור המצלמה ל- 1 (מיקרוסקופ > רכישת > הגדרות רכישה > הגדרות מצלמה ושנה את Binning), פתח את חריץ היציאה ל- 15 מיקרומטר ב- Mistral (בקרת תנועה > XS ושנה XS) והגדר את הסיבוב ל- 0° (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה θ).
  12. רכשו תמונה בודדת עם זמן חשיפה של 1 שניות (מיקרוסקופ > רכישת > הגדרות רכישה > מצבי רכישה > התחלה > יחיד) והעריכו את זמן החשיפה הנדרש עבור כל זווית הטיה של הטומוגרפיה.
רכישת טומוגרפיה
1. עבור לזווית המרבית השלילית +0.1 (לדוגמה, עבור ZP 25 ננומטר עבור אל -65.1°) (בקרת תנועה > דגימה ושינוי דגימה θ).
2. הגדר את מספר התמונות כמספר הכולל של הזוויות (תוך התחשבות בתמונה בזווית 0) ואת הטווח הזוויתי (מיקרוסקופ > > רכישת > הגדרות רכישה > מצבי רכישה > טומוגרפיה ושנה את מספר התמונות; לאחר מכן, שנה את זווית ההתחלה ואת זווית הסיום).
3. הגדר את זמן החשיפה המוגדר והתחל ברכישה (מיקרוסקופ > > > הגדרות רכישה > הגדרות המצלמה ושנה את זמן החשיפה ולאחר מכן לחץ על התחל).
4. עבור למצב FF (בקרת תנועה > לדוגמה ושנה מדגם X; לאחר מכן, שנה את מדגם Y) ורכוש 10 תמונות FF (מיקרוסקופ > רכישת > מצבי רכישה > ממוצע ושנה את מספר התמונות ולאחר מכן לחץ על התחל).
  הערה: במיסטרל, ספקטרומיקרוסקופיה או מיקרוסקופיה תלוית אנרגיה אפשרית בעת רכישת הקרנות תוך כדי סריקת האנרגיה על פני קצה ספיגה של עניין. הפלט הסופי הוא ערימה של הקרנות דו-ממדיות, אשר יכילו ספקטרום קליטת קרני רנטגן (XAS) בכל פיקסל, כלומר תמונות עם מידע כימי. הרחבה לתלת-ממד המשלבת ספקטרוסקופיה עם טומוגרפיה אפשרית באופן עקרוני. המינון הכולל הנדרש עשוי להיות מגבלה ואז ניתן לדרוש אסטרטגיות ספציפיות כגון הדמיית ספיגה דיפרנציאלית.

4. ניתוח נתונים

הערה: כל ניתוח הנתונים נעשה באמצעות תוכנה פתוחה זמינה וסקריפטים שפותחו עם צינורות אוטומטיים.

במיסטרל
1. Pipeline ממירה ערימות טומוגרפיה מהרחבת txrm (הרחבת תוכנת TXM) ל-hdf5 (פורמט נתונים היררכי בקוד פתוח) עם כל המטא-נתונים הדרושים, לאחר מכן מנרמלת את המחסנית לפי ממוצע ה-FF וזרם המכונה, ולבסוף מפרקת את הערימות על ידי פונקציית התפשטות הנקודות הנמדדת של המערכת האופטית עבור עדשת לוחית אזור פרנל ספציפית (ZP) ואנרגיה²³^,²⁴. עבור פירוק, מצא את הערך המתאים k = 1/SNR (תלוי בעובי הדגימה). עבור הסקריפט שפותח ב- Mistral, הקלד את הפקודה: txrm2deconv "קלט tomo" "קלט FF" -zp = "ZP בשימוש" - e = " אנרגיה " - dx = " גודל פיקסל " - k = " 1/SNR " - t = -1.
2. עבור הסקריפט שפותח ב- Mistral ליישור אוטומטי, הקלד את הפקודה: ctalignxcorr "stack מנורמלים deconvolved stack.mrc" "מחסנית מנורמלת.hdf5".
  הערה: ניתן להשתמש במספר יישומי תוכנה ליישור התחזיות לציר סיבוב משותף באמצעות Fiducials Au NP^25,26. יישור ההקרנות דורש דיוק תת-פיקסלים. יישור אוטומטי יכול להיות משביע רצון רק כאשר fiducials Au NP מספיקים (>7) ומפוזרים היטב בשדה הראייה. יישור ידני נחוץ לעתים קרובות ל-posteriori כדי לתקן יישור אוטומטי להשגת הדיוק הגבוה ביותר האפשרי.
3. כדי לשחזר את המחסנית המנורמלת המיושרת, השתמש בכל אחד מכמה אלגוריתמים זמינים.
  הערה: ניתן לשחזר את הערימה המיושרת באמצעות הקרנה לאחור משוקללת (WBP) או טכניקות שחזור איטרטיביות סימולטניות (SIRT) תוך מספר דקות. עם זאת, על מנת לשמר את מקדמי הקליטה הליניאריים (LAC), טכניקות שחזור אלגבריות (ART) עדיפות²⁷. ART דורש יותר זמן מחשוב, ולכן SIRT²⁸ נעשה תחילה לשחזור מהיר של סדרת הטיה המיושרת אוטומטית (30 איטרציות תוך מספר דקות). ברגע שהיישור משביע רצון, ייעשה שימוש ב- ART.
ב-ב-ב24
1. צינור שנבנה בהתאמה אישית ממיר קבצי נתונים txrm ל- Tiffs סטנדרטיים עם כל המטא-נתונים הדרושים ולאחר מכן שולח אותם לזרימת עבודה של אצווה runtomo המעבדת את ערכות הנתונים בשלוש דרכים: WBP, SIRT ותיקון.

תוצאות

הכנת דוגמאות עבור cryo-SXT יכולה להיות מאתגרת. אפילו בתוך אותה רשת דגימה, ניתן לכלול אזורים שהם אידיאליים, ואזורים שאינם אידיאליים, כפי שניתן לראות באיור 5, המציג שני ריבועים מאותה רשת מאתר Au. הדגימה האידיאלית צריכה לכלול תאים בודדים במרכזה של רשת מרובעת, משובצים בשכבה דקה של קרח ומוקפת בסמנים Au fiducial מפוזרים היטב המשמשים ליישור הקרנות הטיה לפני שחזור טומוגרפיה. איור 5A מראה תא דמוי פיברובלסט (NIH 3T3) שעומד ברבים מהקריטריונים האלה. פרוסה בודדת משחזור תלת-ממדי באמצעות ART²⁷ של האזור המסומן בתיבה האדומה המציינת את שדה הראייה (FoV) מוצגת באיור 5B. ניתן להבחין באברונים רבים ושונים כגון מיטוכונדריה (M), רשתית אנדופלסמית (ER), שלפוחית (V) והגרעין (N) הודות לשחזור כמותי של ה- LACs. בנוסף, יחס האות לרעש של השחזור הוא גבוה מאוד ומאפשר להשיג ניגודיות גבוהה של התכונות התאית. מצד שני, איור 5C מראה ריבוע עם צפיפות תאים גבוהה יותר. מסיבה זו, הכתם הוא בדרך כלל פחות יעיל, מה שמוביל לשכבת קרח עבה יותר, או אפילו לבעיות ויטריפיקציה. במקרים מסוימים, ניתן כבר לראות זאת בעת סינון הרשת באמצעות מיפוי אפיפלואורסצנטי לפני הדמיית הרנטגן, ויש להימנע מרשתות אלה בכל מחיר. באיור 5C, ניתן לראות סדק בתוך הרשת ואת הקרח המחוספס עובר דרך כל ריבוע הרשת (המסומן על ידי החצים האדומים). יש להימנע מכל הדמיה ליד סדקים בשל חוסר יציבות סביר של הרשת כאשר נחשפים לקרן. בנוסף, סדקים יכולים להיות סימן לקרח סמיך, כפי שהיה במקרה באזור זה. סדרת הטיה נרשמה באזור המסומן בתיבה האדומה. באיור 5D מוצגת פרוסה בודדת מהשחזור התלת-ממדי המתאים. אף על פי שניתן לזהות כמה מבנים גדולים יותר, פרטים עדינים הולכים לאיבוד בתוך הרעש והמרקם הגרגרני בשל איכות הוויטריפיקציה הירודה של הקרח העבה, כפי שניתן לראות באופן ספציפי, למשל, על המיטוכונדריה העליונה המצביעה על ידי החץ.

figure-results-1922
איור 1: זרימת עבודה. זרימת עבודה סכמטית בוצעה לפני איסוף הנתונים של cryo-SXT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2339
איור 2: תאים גדלים ברשתות. (A) תאים הגדלים בצלחת פטרי P100 עם מפגש סביב 80%-90%. (B) צלחת פטרי P60 עם מספר רשתות לאחר זריעת התאים. (C) תאים הגדלים על גבי רשת לאחר 24 שעות. סרגלי קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2923
איור 3: רשתות העמסה על מחזיקי הדגימות ולתוך תא ההעברה. (A) תחנת עבודה מלאה בחנקן נוזלי עם המעבורת והקריובוקסים מוכנים לטעינת הרשתות. (ב) בעל דגימה שהוכנס לתוך המטעין עם טעינת הרשת. (ג) הסעה עם בעל המדגם בעמדה 3 ללא הכיסוי. (ד) תחנת עבודה עם תא ההעברה מחובר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3586
איור 4: טעינת דגימות לתוך TXM (A) חיבור תא ההעברה ל-TXM. (B) מעבורת בתוך TXM. (C) זרוע רובוט TXM המכניסה את מחזיק הדגימה לשלב הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4108
איור 5: דוגמה לטומוגרמות קרני רנטגן רכות של cryo. שורה עליונה: דגימה אידיאלית, (A) תצוגת פסיפס דו-ממדית של ריבוע רשת המציגה תא מבודד במרכז. (B) פרוסה אחת מנפח התלת-ממד המשוחזר המציג את האזור המסומן בתיבה האדומה (A). בהשוואה ל-(D) התמונה חלקה הרבה יותר וניתן לראות יותר פרטים. שורה תחתונה: דגימות לא אידיאליות, (C) תצוגת פסיפס דו-ממדית של ריבוע רשת המציגה מפגש תאים גבוה מדי וסדקים ברדיד הקרח והרשת (חצים אדומים). (D) פרוסה אחת מתוך הכרך התלת-ממדי המשוחזר המציגה את האזור המסומן בתיבה האדומה ב- (C). ניתן לזהות את הויטרינה הלקויה או הלא אופטימלית על ידי המרקם הגרגרני של התמונה. N: גרעין; M: מיטוכונדריה; ER: רשתית אנדופלסמית; MV: גופים רב-ווסקולריים; V: Vacuole; סרגלי קנה מידה: A ו- C 20 מיקרומטר; B &D 2 μm.Vאנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

הכנת הדגימה היא צעד קריטי להשגת טומוגרמות רנטגן רכות באיכות גבוהה, שכן איכותן תלויה ישירות באיכות הוויטריפיקציה של הדגימה ובעובי שכבת הקרח שבה מוטבע התא. תחזיות עם יחס אות לרעש גבוה ייאספו באזורים עם שכבת קרח דקה, מה שיאפשר למזער את מינון הקרינה הנדרש כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. בנוסף, מפגש התאים ישפיע גם על איכות הטומוגרמה הסופית, שכן יש להימנע מכך שתאים שכנים ייכנסו ל-FoV בעת הסיבוב. לבסוף, הפיזור הנכון של סמני Au fiducial יקבע את הדיוק של יישור ההקרנה ולאחר מכן יקבע בסופו של דבר את האיכות של הנפח המשוחזר התלת-ממדי הסופי. שים לב כי התפשטות נכונה של Au fiducials על הרשת מאפשרת אוטומטיזציה של שלב יישור ההקרנה, שבלעדיו נדרשת מומחיות גבוהה לצעד כה קריטי.

הפרוטוקול כאן מתאר רק אסטרטגיית הכנת דגימה אפשרית אחת, שיש לה קווי דמיון לאלה המשמשים בטומוגרפיה של אלקטרוני קריו (cryo-ET). בשני המקרים, פרוטוקולים המשפרים את הכנת המדגם התובענית לשכפול טוב יותר יהיו בסיסיים להצלחתן של טכניקות אלה, ונעשים מאמצים לקראת מטרה זו²⁹. ראוי להזכיר כי בנוסף להדמיה של תאים מבודדים, ניתן גם לדמיין קטעי רקמות בתנאי שאות השידור דרך הקטע יספיק בזוויות הטיה גבוהות. בדרך כלל, זה מרמז על קטעים של כמה מיקרונים (מתחת ל-10 מיקרומטר).

כדי לדמות מבנה או אירוע מסוים בתוך תא מסוים, יש לוודא שתכונה מסוימת זו נמצאת בתוך ה-FoV של סדרת ההטיה. מכיוון שה-FoV ב-cryo-SXT מוגבל ל-10 x 10 μm² עד 15 x 15 μm² בהתאם לעדשה ומביא בחשבון דגימת יתר של פיקסלים של הרזולוציה לפחות לגורם של 2, הוא לעתים קרובות קטן יותר מהרחבת התא המלאה (ראו את הריבועים האדומים המצוינים באיור 5). לכן, יש למצוא את ההחזר על ההשקעה ולתייג אותו כראוי. זה נעשה בדרך כלל באמצעות תגים פלואורסצנטיים וגישות קורלטיביות של אור נראה. אסטרטגיות דו-ממדיות המשלבות אפיפלואורסצנציה הן פשוטות מכיוון שלמיקרוסקופ העברת קרני הרנטגן הרך יש מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של אור נראה בקו, אך גישות אחרות לאות פלואורסצנטי דו-ממדי או תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה זמינות גם^הן 4,12,13,15,16 . במקרים אלה, יש לצלם את הרשת תחילה במכשירים ספציפיים כגון מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה במיוחד. שים לב שהגישות המתאמות היעילות ביותר הן אלה הכרוכות באיסוף נתונים בתנאים קריוגניים. הסיבה לכך היא שהפסקת הזמן בין טמפרטורת החדר (RT), הדמיה פלואורסצנטית של אור נראה, לבין ויטריפיקציה של דגימה, למשל, תעכב את תפיסת האירוע הסלולרי הנכון בזמן; בנוסף, הליך הוויטריפיקציה עשוי לנתק את תא העניין שצולם ב-RT מהרשת. גם אם רוב גישות ההדמיה המתאמות עשויות לרמוז שיש לתמרן את רשתות הדגימה ולהעביר אותן ממכשיר אחד למשנהו, ולמרות הסיכון המוגבר לזיהום ברשת או לנזק שזה גורם, התגמול ברור: כדי להיות מסוגל לאתר אירועים או מולקולות ספציפיים בתוך הנוף התאי.

כאשר נדרשת הדמיית תאים שלמים, תפירת טומוגרמות שונות אפשרית בתנאי שהמינון הכולל המיושם אינו חורג ממגבלת הנזק לקרינה. בדרך כלל, המינון שהופקד לאיסוף מעט טומוגרמות על אותו תא הוא הרבה מתחת לגבול ברזולוציה הניתנת להשגה (10⁹ Gy), ולכן, אין צורך באסטרטגיה ספציפית כדי להוריד את המינון, אם כי זה תלוי מדגם וניסוי. במקרה של איסוף נתונים אינטנסיבי כגון ספקטרו-טומוגרפיה, אכן יידרש מזעור המינון ויהיה צורך ליישם איסוף נתונים נוח ואסטרטגיות עיבוד ספציפיות.

Cryo-SXT יש כמה מגבלות, אשר צריך להיות מוזכר כאן. הראשון הוא הטריז החסר הידוע, שהוא מהותי לשימוש בתמיכות מדגם שטוחות. תמיכות דגימה נימיות המאפשרות סיבוב של 180 מעלות שימשו בעבר ועדיין נעשה בהן שימוש במתקנים מסוימים, אך הן גם מציגות חסרונות כגון ניגודיות מרוששת בשל ספיגת הזכוכית והגבלת השימוש בתאים בהשעיה. דרך להפחית את ההשפעה של הטריז החסר היא על ידי ביצוע טומוגרפיה של הטיה כפולה. זה אכן אפשרי בקו הקרן של מיסטרל בימינו. המגבלה השנייה נקבעת על ידי עדשת לוחית אזור פרנל המשמשת במיקרוסקופים כאלה. עדשה זו קובעת את הרזולוציה האולטימטיבית הניתנת להשגה ואת עומק השדה (DoF), שניהם קשורים זה לזה באופן הדוק. משמעות הדבר היא שהגדלת הרזולוציה תפחית את ה-DoF בעוד שעובי התא יהיה לעתים קרובות גדול יותר. לדוגמה, עדשה של 40 ננומטר תהיה בתיאוריה DoF של 3 μm ורזולוציה של 24.4 ננומטר חצי גובה. הפשרה בין רזולוציה ל-DoF היא אפוא אסטרטגית ובחירת העדשה תהיה תלויה בסוג התא ^30,31. לבסוף, TXMs תפעוליים ברחבי העולם רחוקים מלהיות מיקרוסקופים אידיאליים ונעשים מאמצים לשפר את המערכות האופטיות כדי להגיע לציפיות התיאורטיות. לבסוף, ניתן לבצע את ההדמיה והפילוח של הכרכים המשוחזרים עם כלי תוכנה ספציפיים 25,32,33,34.

לסיכום, cryo-SXT מאפשר הדמיה של תאים באופן כמותי ברזולוציה בינונית (25-30 ננומטר חצי גובה) ובמספרים סטטיסטיים (כמה עשרות טומוגרמות ביום). זה מאפשר להשיג את הארגון, ההפצה והממד של אברונים בתנאים ספציפיים, למשל, במהלך זיהום פתוגנים או מחלות, בנקודות זמן מדויקות או לאחר טיפולים מסוימים. זוהי, אם כן, טכניקת הדמיה ביולוגית משלימה שימושית למיקרוסקופיות האלקטרונים והאור הנראה הנפוצות יותר, שכל אחת מהן מתמודדת עם טווח מסוים של ממדי דגימה ורזולוציה. Cryo-SXT משמש לעתים קרובות בגישות קורלטיביות המערבות פלואורסצנציה של אור נראה, אך אסטרטגיות קורלטיביות אחרות של cryo אפשריות גם כן.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

פרויקט זה קיבל מימון מפרויקט ה-iNEXT-Discovery של הנציבות האירופית Horizon 2020 ומתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק של מארי סקלודובסקה-קירי מס' 75439.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira	Thermo Fisher		Software for segmentation
Au Holey Carbon Films finder grids	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2 Au G200F1	Au Holey Carbon Films finder grids
Au nanoparticles	BBI Group, Cardiff, UK	Au nanoparticles 100nm	100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba)
Au nanoparticles	BBI Group, Cardiff, UK	Au nanoparticles 250nm	250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond)
Axio Scope A1	Zeiss	430035 9060	Fluorescence microscope
Blotting No.1 filter paper	Whatman	WHA10010155	Blotting filter
Bsoft			Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008)
Chimera			Software for segmentation (Pettersen et al. 2004)
Cryo-EM Glow Discharge Set	PELCO easiGlow	91000S	Glow Discharge Cleaning System
Cu Holey Carbon Films finder grids	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2Cu G200F1	Cu Holey Carbon Films finder grids
Fetal calf serum	Sigma	F9665	Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture
ImageJ			Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)
IMOD			Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996)
Leica EM GP Grid Plunger	Leica	16706401	Automatic Plunge Freezer EM
LINKAM cryo-stage	Linkam Scientific Instruments	CMS 196	Cryo-Correlative Microscopy Stage
MIB			Software for segmentation (Belevich et al. 2016)
P100 Petri dish	Sigma	P6106	Treated for cell culture and sterile
P60 Petri dish	Sigma	D8054	Treated for cell culture and sterile
Polylysin	Sigma	P4707	Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered
Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV	Xradia	NCT-SB	Transmission soft X-Ray microscope
SURVOS			Software for segmentation (Luengo et al. 2017)
Tomo3d			Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)
TomoJ			Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007)
XM Data Explorer	Zeiss		TXM software

References

Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
Natterer, F. . The mathematics of computerized tomography. , (1986).
Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
Cinquin, B., et al. Putting molecules in their place. Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).
Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
Attwood, D. . Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , (2000).
Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. . Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , (2007).
Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: