הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Jana Moravcová; Matyáš Pinkas; Radka Holbová; Jiří Nováček

doi:10.3791/62351

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

Abstract

כיום, טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryo-ET) היא הטכניקה היחידה שיכולה לספק נתונים מבניים ברזולוציה כמעט אטומית על מתחמי מאקרומולקולריים במקום. בשל האינטראקציה החזקה של אלקטרון עם החומר, מחקרי cryo-ET ברזולוציה גבוהה מוגבלים לדגימות בעובי של פחות מ -200 ננומטר, מה שמגביל את תחולת ה- cryo-ET רק לאזורים ההיקפיים של תא. תהליך עבודה מורכב הכולל הכנת חתך תאי דק על ידי מיקרוכינינג קרן יונים ממוקד קריו (cryo-FIBM) הוצג במהלך העשור האחרון כדי לאפשר רכישה של נתוני cryo-ET מהפנים של תאים גדולים יותר. אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamellae הסלולר מדגם vitrified על ידי הקפאת צלילה ניצול Saccharomyces cerevisiae כדוגמה טיפוסית של תא אאוקריוטי עם ניצול רחב במחקר ביולוגיה תאית ומולקולרית. אנו מתארים פרוטוקולים לvitrification של S. cerevisiae לתוך טלאים מבודדים של כמה תאים או monolayer רציף של התאים על רשת TEM ולספק פרוטוקול להכנת lamella על ידי cryo-FIB עבור שתי דגימות אלה.

Introduction

ההתפתחויות הטכנולוגיות והתוכנה האחרונות הפכו את אלקטרון קריו-מיקרוסקופיה (cryo-EM) של דגימות ביולוגיות מלוטשת לאחת הטכניקות המרכזיות במחקר ביולוגיה מבנית בעשור האחרון¹^,². הכנת דגימה עבור cryo-EM בדרך כלל מורכב יישום של חלבון מטוהר או קומפלקס של חלבון עם חומצת גרעין על נושא המדגם (רשת TEM), ואחריו הסרת רוב הנוזל עם נייר מסנן, וצלילה הקפאה של הרשת עם שכבה דקה שיורית של מדגם לתוך אתאן נוזלי או פרופן³ . המדגם קבוע לפיכך בשכבה דקה (בדרך כלל <80 ננומטר) של חוצץ אמורפי במצב של לחות מלאה, בתנאים כמעט מקומיים, וללא צורך בשום קיבעון כימי או מתכת כבדה מנוגדת. הדמיה של הדגימה ההומוגנית מבחינה מבנית במיקרוסקופ אלקטרוני השידור גורמת לנתונים שניתן להשתמש בהם לקביעת המבנה התלת מימדי של המאקרו-קול ברזולוציה כמעט אטומית באמצעות פרוטוקול ניתוח חלקיקים יחיד². מבנה במבחנה כזו מתאים לייצוג של המקרומולקול בתנאים ובטיפול המשמשים במהלך הכנת המדגם. למרות המבנים שנקבעו בתנאי במבחנה בדרך כלל תואמים את המצב התפקודי המלא של macromolecule, היכולת לדמיין יחסים מרחביים בין מקרומולקולקולים שונים בתוך התא יספק הקשר פונקציונלי נוסף לנתונים המבניים.

טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryo-ET) משמשת לשחזור כרכים תלת-ממדיים של עצמים pleomorphic או מתחמים מקרומולקולריים במקום^4,⁵. היתרון של cryo-ET הוא שהמידע התלת מימדי מתקבל על ידי הדמיה של ישות אחת. עם זאת, הרזולוציה שבה נצפים מתחמים מקרומולקולריים בודדים או אברונים מוגבלת מאוד. לכן, ממוצע של macromolecules (תת טומוגרפיה ממוצעת, STA) עם אותו מבנה ממספר גדול יותר של טומוגרמה יש צורך להגיע 4-8 מודלים ברזולוציה Å מנתוני cryo-ET⁶^,⁷. לאחרונה הוכח כי cryo-ET ו STA ניתן להחיל גם כדי לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של מכונות macromolecular כגון ריבוזומים בהקשר של הסביבה התאית⁷. עם זאת, ניצול מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור מוגבל על ידי עובי הדגימה. באופן כללי, זה לא בעיה עבור קריו-EM חלקיק יחיד שבו אופטימיזציה של תנאי vitrification יכול בסופו של דבר לגרום להטמעה של המדגם בשכבה דקה של קרח. מצד שני, רוב התאים אינם למעשה שקופים אלקטרונים עבור קרן האלקטרונים 300 keV. הנתיב החופשי הממוצע הבלתי-אלסטי בדגימות הביולוגיות המשובצות עבור 300 האלקטרונים של KEV הוא כ-395 ננומטר⁸, מה שאומר שמחקרי קריו-ET מוגבלים לפריפריה התאית עבור רוב התאים.

טכניקות שונות פותחו כדי לדלל את המדגם עד לעובי מספיק עבור cryo-ET. קריו-אולטרה-מיקרוטומיה משתמשת בצילום מכני של המדגם עם סכין יהלום בטמפרטורת החנקן הנוזלי (-196 °C)-C) כדי לספק קטעים בעובי 60-80 ננומטר המתאימים להקפאה-ET^9,¹⁰^,¹¹. ניתן להכין מקטעים מרובים מתא בודד וניתוח הנתונים יכול בסופו של דבר להפיק מידע מבני תלת-ממדי עבור החלק הגדול יותר של התא. עם זאת, חיתוך מכני יכול לגרום למספר חפצים כגון קטעים מעוקלים, סדקים או דחיסת מדגם, אשר עשוי להשפיע על המבנה המתקבל ולהטיה את נתוני cryo-ET¹⁰^,¹¹^,¹². מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו (cryo-FIBM) מייצגות גישה חלופית שבה מקטע תאי דק מוכן על ידי אבלציה הדרגתית של הדגימה באמצעות קרן ממוקדת של יונים Ga + (FIB) בתהליך רב שלבי, אשר יכול לגרום 80-300 ננומטר חתך סלולרי בעובי (lamella)¹³^,¹⁴^,¹⁵ . בניגוד להקפאה-אולטרה-מיקרוטומיה, רק לאמלה אחת מוכנה מתא בודד, המייצג כ-0.3%-3% מהנפח שלו, ומיקרומכינינג של תאים מרובים נחוץ בדרך כלל כדי למצוא אזור מעניין בחתך הטחון. בנוסף, התפוקה של זרימת העבודה כולה היא עדיין נמוכה למדי, לעתים קרובות מוגבלת 6-8 lamellae באיכות גבוהה מהפעלה של 8 שעות cryo-FIBM. מצד שני, חתך ה-cryo-FIBM נטול כל ממצאי דחיסה ומספקים קלט מתאים להקפאה-ET ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, העברת lamella למנשא מדגם עבור cryo-ET אינו הכרחי כמו המדגם נשמר על רשת TEM במהלך כל תהליך הכנת lamella ואת אותה רשת ניתן להעביר לאחר מכן TEM. אנו מצפים כי התפוקה של cryo-FIBM ישתפר באופן משמעותי בקרוב, בעיקר מתוך זמינות של תוכנה עבור כרסום lamella ללא^{פיקוח 16}^,¹⁷ וניצול של FIBs הפועלים על העיקרון של תשלום-זוג פלזמה, אשר יאפשר אבלציה חומר מהר יותר.

Saccharomyces cerevisiae (שמרים) הם תאים אאוקריוטים בעלי צורה כדורית וקוטר של ~ 2-5 מיקרומטר. הודות לגודלו, נגישותו, גנטיקה, זמן הדור והמניפולציה הפשוטה, השמרים נחקרים בהרחבה כאורגניזם מודל אאוקריוטי במחקר ביולוגיה תאית ומולקולרית בדומה לאשריצ'יה קולי, הנחקר היטב כאורגניזם מודל פרוקריוטי בבקטריולוגיה. שמרים ניתן לתאם בקלות השעיה כמות גבוהה של תאים נוצר בתוך זמן קצר (הכפלת זמן 1 – 2 שעות). חשוב מכך, שמרים חולקים מבנה תאי פנימי מורכב עם תאים בעלי חיים וצמחים תוך שמירה על גנום קטן המורכב מתוכן נמוך של דנ"א שאינו קידוד. אפיון מבני של פרוטאום השמרים מהרזולוציה הגבוהה בנתוני ה- situ יכול אפוא לסייע לספק תיאור מכני לכמות הנרחבת של נתונים פונקציונליים הזמינים בספרות.

להלן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף לרכישת נתוני in situ cryo-ET על דגימת השמרים, המכסה את כל השלבים מהטיפוח לדוגמה ועד להכנת cryo-FIBM lamella, והעברת הדגימה ל- TEM לרכישת נתוני cryo-ET.

Protocol

1. טיפוח והכנת תאי סרביסיה סכרומיצ'יס להתחדשות

הכן בינוני צמיחה נוזלית עבור Saccharomyces cerevisiae.
1. Autoclave בקבוק זכוכית 500 מ"ל להכנת מדיום צמיחה.
2. שוקלים 2.2 גרם של תמצית שמרים (1.1%) ו-4.4 גרם פפטון (2.2%) ומערבבים 200 מ"ל של מים.
3. לחטא על ידי autoclaving במשך 15 דקות ב 121 °C (50 °F).
4. שוקלים 10 גרם אבקת גלוקוז ומערבבים 50 מ"ל של מים כדי לקבל 20% תמיסה גלוקוז. להעביר את הפתרון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן אותו ב 4 °C (50 °F).
הכן מדיום מוצק עבור Saccharomyces cerevisiae.
1. שוקלים 4 גרם אבקת אגר ומערבבים עם 200 מ"ל של מדיום צמיחה.
2. לחטא ב autoclave במשך 15 דקות ב 121 °C (50 °F).
3. מצננים את המדיום עד 40-50 מעלות צלזיוס ומוסיפים 20 מ"ל של 20% גלוקוז סטרילי (מוכן בשלב הקודם). יוצקים ~ 20 מ"ל של המדיום המלא לתוך צלחת פטרי ולתת לו להתמצק בטמפרטורת הסביבה.
4. עוטפים את צלחות אגר בפרפילם כדי להגן מפני ייבוש ולאחסן ב 4 °C (70 °F).
תרבות סכרומיצס סרביסיה בהשעיה
הערה: הפרוטוקול מותאם להכנת מדגם עבור cryo-FIBM מהשעיה של קו התא Saccharomyces cerevisiae זן BY4741 [ATCC 4040002] או זנים דומים.
1. תאט-ערב בקבוקון ארלנמאייר (או דומה) באורך 50 מ"ל.
2. עבוד במכסה המנוע או בקופסת זרימה למינארית. פיפטה 10 מ"ל של מדיום הצמיחה לבקבוק ארלנמאייר סטרילי 50 מ"ל.
3. להשלים את המדיום עם 1 מ"ל של מסונן 20% גלוקוז. בחר מושבה אחת של שמרים מצלחת אגר עם לולאת חיסון סטרילית וחד פעמית (1-10 μL).
4. מניחים את בקבוקון ארלנמייר באינקובטור ובתרבות ב 30 °C (30 °F) עם עצבנות (150-200 סל"ד) עד לשלב המעריכי הוא הגיע (כ 7 שעות).
  הערה: ראינו כי השלב המעריכי מגיע לאחר ~ 15 שעות כאשר מושבות נקטפות מלוחות אגר כי כבר תרבית בטמפרטורת הסביבה במשך 4 שבועות. ראה גם הערה להלן.
תרבות סכרומיצס סרביסיה על צלחת אגר ממלאי גליצריל.
1. השתמש בצלחת אגר חדשה מאחסון של 4 מעלות צלזיוס.
2. קח את מלאי S. cerevisiae מהמקפיא העמוק של -80 מעלות צלזיוס והכניס אותו לעמדה קפואה כדי למנוע הפשרה מלאה של המניה.
3. לגרד ולהעביר תרבות קטנה עם לולאת חיסון סטרילית (1-10 μL) כדי 50 μL של מדיום צמיחה. מערבבים כמו שצריך.
4. מעבירים את כל הנפח של תרבות S. cerevisiae מעורבת ומתפזרים עם מקל מתפשט סטרילי על פני השטח של צלחת אגר.
5. דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך כ 48 שעות עד 1.5-2 מ"מ מושבות קוטר נוצרים.
  הערה: מומלץ לתרבות המושבות טרי לפני הניסוי. מושבות מעל שבוע ידרוש תקופה ממושכת לגידול במדיה נוזלית כדי להגיע לשלב הצמיחה המעריכי.
תרבות סכרומיצ'ס סרביסיה על צלחת אגר.
1. השתמש לוחות אגר מוכן עם מושבות S. cerevisiae גדל.
2. Pipette 10 מ"ל של בינוני צמיחה סטרילית ו 1 מ"ל של מסונן 20% גלוקוז לבקבוק ארלנמאייר 50 מ"ל.
3. בחר מושבה אחת של תרבות S. cerevisiae עם לולאת חיסון סטרילית ומערבבים עם מדיום גדילה בבקבוקון.
4. דגירה 50 דקות ב 30 °C עם עצבנות (150-200 סל"ד).
5. לדלל את תרבות ההשעיה עשר פעמים עם מדיום הצמיחה ולפזר 50 μL של השעיה על צלחת אגר עם מקל מתפשט סטרילי.
6. דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך כ 48 שעות עד 1.5-2 מ"מ מושבות נצפו.
7. עוטפים את קצות צלחת הפטרי בפרפילם כדי למנוע ממנו להתייבש. יש לאחסן בטמפרטורת החדר ולהשתמש בו למשך 4 שבועות לכל היותר.
הכן Saccharomyces cerevisiae להקפאת צלילה באשכולות תאים.
1. הכן את תרבית התא S. cerevisiae על פי הפרוטוקול בסעיף טיפוח של Saccharomyces cerevisiae בהשעיה (סעיף 1.3) ודגרה ~ 7 שעות ב 30 °C עם תסיסה (150-200 סל"ד).
2. למדוד את OD של תסיבת השעיית תאי S. cerevisiae ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV / Vis.
3. מרכז את השעיית התא ל OD₆₀₀ = 1.
הכן את ס. סרביסיה להקפאת צלילה בשכבת תאים.
1. הכן את תרבית תאי S. cerevisiae על פי הפרוטוקול בסעיף טיפוח של תסיסה cerevisiae saccharomyces השעיית תרבית תא ודגרה ~ 7 שעות ב 30 °C עם תסיסה (150-200 סל"ד).
2. למדוד את OD של תסבית השעיית תאי S. cerevisiae ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV / Vis.
3. מעבירים את התאים לבינוני לצינור הצנטריפוגה ומסתובבים בעדינות במשך 2 דקות בכוח צנטריפוגלי יחסי (900 x גרם).
4. להשליך את המדיום מכדור התא על ידי pipetting.
5. מוסיפים מדיום טרי לכדור התא. חשב את עוצמת הקול של בינוני כדי לקבל השעיית תא של OD₆₀₀ שווה 30 עד 60.
6. הוסף גליצלול (50% תמיסת מלאי) להשעיית התא לריכוז סופי של 5% זמן קצר לפני vitrification.
  הערה: גליסול עובד כסוכן מגן, אשר משפר את איכות הקרח באזורים שבין התאים. גליצרול מתווסף לתאים רק זמן קצר לפני vitrification כדי למזער את ספיגתו לתוך התא.

2. ויטריפיקציה של דגימת הסרביזיה של סכרומיצ'ס

רשתות TEM פריקה זוהרת עם צד סרט הפחמן פונה כלפי מעלה עבור 30-45 s (לחץ: 6-9 Pa, הנוכחי: 7 mA).
הגדר את הרובוט vitrification לפרמטרים הבאים: טמפרטורה: 18 °C (70 °F), לחות: 100%, זמן כתם: 6 s, זמן המתנה: 5 s, מחזור סופג: 1x, וכוח כתם: 5.
הערה: כוח כתם הוא ערך ספציפי למכשיר וערכי כוח כתם אופטימליים עשויים להיות שונים בין מחשבים שונים. הערך האופטימלי עבור בוכנה מסוימת חייב להיות מאושר באופן ניסיוני.
הכן אתאן נוזלי עבור vitrification.
הר את משטח השטח שאינו סופג על משטח הכתם הפונה לדגימה. השתמש בנייר המסנן עבור משטח הכתמים האחר.
בחר את הרשת המשוחררת הזוהרת עם פינצטה והר את פינצטה לכלי הקפאת הצלילה.
החל 3.5 μL של השעיית S. cerevisiae על הצד הפחמני של הרשת בתוך תא האקלים בוכנה. ערבבו כראוי לפני כל יישום ברשת.
לצלול להקפיא את הרשת לתוך האתאן הנוזלי.
העבר את הרשת מאתאן נוזלי ל LN₂. אחסן רשתות עם תאים מנוטרלים בתנאי LN₂ או טען אותן במחסנית הרשת TEM לטעינה במיקרוסקופ FIB-SEM.

3. הרכבת רשתות TEM לתוך מחסנית הרשת

הערה: זרימת העבודה המתוארת כאן משתמשת ברשתות TEM המותקנות במחסנית הרשת כדי להקל על טיפול לדוגמה והעברה בין מיקרוסקופי SEM ו- TEM. הרכבת המחסנית מורכבת מטבעת C, רשת TEM וטבעת C-clip. אפשרויות אחרות זמינות בעת עבודה עם מכשור מיצרני מיקרוסקופ אחרים. תחנת העבודה להרכבת מחסנית הרשת מלאה ב- LN₂. רמת LN₂ מכסה את תיבת הרשת עם רשתות TEM, אך ההרכבה של רשתות TEM לתוך המחסנית מתבצעת באדים LN_2. מומלץ מאוד ללבוש מסכת פנים מגן או מגן במהלך הליך vitrification כדי למנוע זיהום לנשום לדגימה. אל תעבוד עם הכלים שצברו זיהום קרח.

שים את תחנת העבודה הרכבת מחסנית הרשת יחד והכן כלים יבשים לחיתוך.
קרר את תחנת העבודה הרכבה למטה עם LN_2. מצננים את כלי החיתוך לטמפרטורת LN_2.
מקם תיבת רשת עם דגימה מנומקת בתחנת העבודה של ההרכבה.
מקם רשת TEM עם הדגימה עם תאים הפונים כלפי מטה אל טבעת C ומאובטח באמצעות C-clip.
מקם את המחסניות החתכים בתיבת הרשת וסגור כראוי.
אחסן מחסניות בדואר LN₂ או טען אותן למיקרוסקופ FIB-SEM.

4. טעינה ומניפולציה של המדגם למיקרוסקופ FIB-SEM

הערה: ההוראות נכתבו לשימוש במיקרוסקופ קרן כפולה Versa 3D המצויד במערכת ההכנה PP3010 cryo-FIB / SEM. פתרונות חלופיים עשויים לדרוש פרמטרים ספציפיים שונים; עם זאת, הרעיון הכללי של זרימת העבודה צריך עדיין להיות חוקי.

מצננים את המיקרוסקופ לטמפרטורת החנקן הנוזלי.
1. לשאוב את תא המיקרוסקופ ותא ההכנה (אם קיים) לוואקום גבוה לפני תחילת הקירור (< 4 x 10^-4 Pa) כדי למנוע צמיחת זיהום.
2. הגדר את זרימת גז החנקן ל 5 L / min עבור תא ההכנה, שלב מיקרוסקופ, מיקרוסקופ, מיקרוסקופ אנטי לזהם. המתן עד שכל הרכיבים יגיעו לטמפרטורה של < -180 °C (50 °F).
  הערה: מערך המיקרוסקופ FIB-SEM המשמש במחקר זה משתמש בגז חנקן מקורר כדי לקרר את הבמה שלו ואת האנטי-לזהם. מערכות אחרות עשויות להשתמש בשיטה אחרת לקירור במה. הלחץ התאי מגיע ~ 3 x 10^{- 5} Pa ברגע הבמה ו anticontaminator הם ב -190 °C (50 °F) על המכשיר המשמש כאן. קצב הצמיחה של שכבת זיהום פחמימנים על פני השטח של lamella עם ההתקנה הניסיונית המשמשת במחקר זה הוא ~ 15 ננומטר / שעה.
טען את מחסנית הרשת עם הדגימה למיקרוסקופ.
1. להרכיב ולקרר את תחנת הטעינה לטמפרטורת LN_2.
2. מניחים את המעבורת (מחזיק מדגם), את תיבת הרשת עם הדגימה, פותחן תיבת הרשת ופינצטה לתוך תחנת הטעינה מקוררת.
3. העבירו בזהירות את מחסנית הרשת כשהדגימה פונה כלפי מעלה אל המעבורת.
4. הפוך את המעבורת בתוך תחנת הטעינה לעמדת הטעינה.
5. טען לתוך המיקרוסקופ.
לחלופין, יש לצפות את הדגימה בשכבות מגן ממתכת.
הערה: אפקט טעינה חזק ניתן לראות בעת הדמיה קפוא חומר ביולוגי hydrated SEM. בנוסף, הדמיית דגימות ביולוגיות עם FIB (אפילו בזרמים נמוכים) גורמת לנזק מדגם מהיר. לכן, ציפוי נוסף של המדגם עשוי להתבצע בתוך מיקרוסקופ FIB-SEM, כדי להגן על פני הדגימה.
1. הפקד את שכבת המגן עם פלטינה אורגנומטלית על ידי מערכת הזרקת הגז (GIS).
  1. הגדר את המדגם לגובה האוצנטרי (נקודת צירוף מקרים להדמיה עם אלקטרונים ויונים).
  2. הטה את הבמה בחזרה ל-45° (דגימה מוטה ב-90° ביחס לקרן אלקטרונים).
  3. הזז את השלב בציר z4 מ"מ מתחת לגובה האוצנטרי.
  4. הגדר את מחט GIS ל 26-30 °C (50 °F).
  5. הפקדה ~ 300-1000 ננומטר של שכבת פלטינה אורגנומטלית לרשת עם הדגימה הביולוגית (מתאים 30-120 s של תצהיר GIS).
    הערה: בדרך כלל אנו מיישמים GIS עבור 30 s עבור דגימות עם אשכולות סלולריים קטנים ו 45 s עבור דגימות עם monolayer של התאים.
2. משטח המפוטם מכסה את משטח הדגימה בשכבת מתכת מוליכת.
  1. הפקד ~ 10 ננומטר של שכבת המתכת (Ir, Au, Pt) לרשת עם דגימה ביולוגית.
הגדרת פרמטרי מיקרוסקופ להכנת lamella
1. עבור FIB, השתמש בפרמטרים הבאים: מתח גבוה = 30 kV, זרם = 10 pA (הדמיה), 10 pA–3 nA (כרסום FIB)
2. עבור SEM, השתמש בפרמטרים הבאים: מתח גבוה = 2-5 kV, גודל ספוט = 4.5, זרם = 8-27 pA.
3. הגדר את סיבוב הסריקה ל- 180° עבור שתי הקורות.
4. הגדר את הטיית הבמה: זווית כרסום 6-11° (תואמת להטיית שלב של 13°-18° עבור המעבורת לדוגמה עם הטיה מראש של 45° ומיקרוסקופ FIB/SEM עם זווית של 52° בין עמודת SEM ו- FIB).

5. הכנת הסרביזיה של סכרומיצ'ס למלה

בדוק את איכות הרשת ובחר אשכול מתאים של cerevisiae Saccharomyces.
1. ודא כי רשת TEM נמחקת כראוי משני הצדדים ללא מים נוספים סביב אשכול התאים או בצד האחורי של הרשת.
  הערה: כדי לבדוק את החלק האחורי של הרשת, לסובב את הבמה כדי -10° ולצלם את הרשת עם FIB.
2. בחר את אשכולות התאים האופטימליים להכנת lamella בהתאם להמלצות הבאות.
  1. מקם את אשכולות התאים במרכז הרשת. אזור הטחינה לא צריך להתרחב מחוץ לכיכר עם ממדים 1100 x 1100 מיקרומטר ממוקם במרכז הרשת (550 מיקרומטר בכל כיוון ממרכז הרשת).
  2. מקם את אשכולות התאים בחלק המרכזי של ריבוע הרשת ללא חפיפה לסרגל הרשת.
  3. מקם את אשכולות התאים בריבוע הרשת עם רדיד פחמן חורי קומפקטי ללא סדקים.
  4. ודא שהצביר אינו מוקף בזיהום קרח.
בחר את מיקום הטחינה האופטימלי בשכבת הסרביזיה Saccharomyces.
1. ודא שפסי הרשת המקיפים את שכבת התא בריבוע הרשת שנבחרה גלויים.
2. בחר את המיקום האופטימלי במונו-שכבתית התאית בהתאם להמלצות הבאות. האזורים שנבחרו עבור כרסום צריכים לעמוד בקריטריונים הבאים:
  1. יש אזור העניין במרכז הרשת. אזור הטחינה לא צריך להתרחב מחוץ לריבוע הממדים 1100 x 1100 מיקרומטר הממוקם במרכז הרשת (550 מיקרומטר בכל כיוון ממרכז הרשת).
  2. עורר את אזור העניין בחלק המרכזי של ריבוע הרשת ללא חפיפה עם סרגל הרשת.
  3. אין להקיף את מחסל התאים בזיהום קרח.
הכן את ס. סרביסיה למלה עם קריו-FIB.
הערה: תבנית הטחינה נוצרת ומרוכזת ביחס לאזור העניין. Cryo-FIBM מבוצע ברצף עם שלבי כרסום מרובים המבוצעים בהגדרות FIB שונות. ה lamella עם בערך 2 מיקרומטר עובי הוא טחון בתחילה באמצעות זרם גבוה (0.3-3 nA). לאחר מכן, הלמלה מדוללת בהדרגה ל-500 ננומטר. שלב הטחינה בזרמים נמוכים (10-30 pA) משמש להשלמת lamella לעובי ~ 100-200 ננומטר.
1. הגדר אזור עניין (ROI) לגובה האוצנטרי ושמור עמדה זו.
  הערה: נקודת צירוף המקרים צריכה להיקבע ושמר עבור כל עמדה בנפרד. הגובה האוצנטרי מוגדר על ידי הטיית הבמה ל- 0° ומרכז על ה- ROI על-ידי הזזת הבמה בכיוון x ו- y. השלב מוטה ל-25° וההחזרה על ההשערה מוחזרת למרכז האזור הסרוק על-ידי שינוי מיקום ציר zשלב. לבסוף, הבמה מוטה בחזרה ל 13°-18° עבור כרסום.
2. הגדר תבנית כרסום מלבנית מעל החזר על ההחזר על תנאי עם כיוון סריקה מלמעלה למטה.
3. הגדר תבנית כרסום מלבנית מתחת ל- ROI עם כיוון סריקה מלמטה למעלה.
4. הגדר את דפוס הטחינה המלבנית הלא פעיל המכסה את אזור העניין להערכה גסה של עובי lamella. דפוס זה אינו טחון במהלך הכנת lamella.
5. סמנו את כל התבניות והגדירו את רוחב המלה(x dimension). רוחב תבנית הטחינה לא יעלה על 2/3 מרוחב האשכול. זה מתאים 8-15 מיקרומטר ברוב המקרים.
6. הגדרת פרמטרים עבור שלבי כרסום גסים
  1. זרם FIB: 0.3-3.0 nA ; עובי lamella סופי: 1.5-2 מיקרומטר; רוחב אזור FIBM: 8-12 um; הטיית שלב: 13-17°; משך: 8 דקות; דפוסי כרסום פעילים: עליון ונמוך.
  2. זרם FIB: 0.3-1.0 nA; עובי lamella סופי: 1 מיקרומטר; רוחב שטח FIBM: 7.5-11.5 מיקרומטר; הטיית שלב: 13-17°; משך: 8 דקות; דפוסי כרסום פעילים: עליון ונמוך.
  3. זרם FIB: 100-300 pA; עובי lamella סופי: 0.5 מיקרומטר ; רוחב שטח FIBM: 7.5-11.5 מיקרומטר; הטיית שלב: 13-17°; משך: 8 דקות; דפוסי כרסום פעילים: עליון ונמוך.
  4. זרם FIB: 30-100 pA; עובי lamella סופי: 0.3 מיקרומטר ; רוחב שטח FIBM: 7.5-11.5 מיקרומטר; הטיית שלב: 13-17°; משך: 8 דקות; דפוסי כרסום פעילים: עליון ונמוך.
7. הגדר פרמטרים עבור שלב הטחינה העדינה:
  1. זרם FIB: 10-30 pA; עובי lamella סופי: <0.2 um; רוחב אזור FIBM: 7-11 מיקרומטר; הטיית שלב: 13-17° (+1°); משך: 12 דקות; דפוסי כרסום פעילים: עליון.
    הערה: שלבי הטחינה הגסים (5.3.6) מתבצעים ברצף עבור כל lamella. לעומת זאת, שלב הטחינה העדין (5.3.7) אינו עוקב ישירות אחר הטחינה המחוספסת, אך צעדי כרסום עדינים מתבצעים ברצף עבור כל lamellae בסוף הפגישה כדי למזער את זיהום פחמימנים על פני השטח lamella. הטיית שלב נוספת +1° משמשת במהלך שלב כרסום עדין כדי להגדיל את אחידות עובי lamella לאורך אורכו.

6. העברת סכרומיצס סרביסיה למלה להקפאה-TEM

הכן דיואר מיובש כראוי ומלא אותו ב- LN₂.
פרק את הדגימות עם lamellae ממיקרוסקופ FIB / SEM בתנאי קריו, העבר אותם לתיבת רשת, ולאחסן אותם ב- Dewar אחסון LN₂ לאחסון לטווח ארוך. לחלופין, טען את הרשתות ישירות לתוך cryo-TEM.
הכיוון הנכון של המלה ביחס לציר הטיית הבמה cryo-TEM חשוב (ראו סרטון נלווה בשעה 8:10 לקבלת פרטים נוספים). ודאו שכיוון הטחינה של lamellae מוכן הוא מאונך לציר הטיית שלב cryo-TEM.
הטה מראש את שלב ההקפאה-TEM כדי לפצות על הטיית lamella ביחס למישור הרשת ולאסוף את סדרת הטיה באמצעות מינון סימטרי ערכה¹⁹.
הערה: הגודל של ההטיה מראש (בדרך כלל 6-8°) נקבע לפי הזווית בין מישור הרשת TEM לכיוון ה- FIB במהלך המיקרו-מכונות. ניתן להשתמש במיקום הקצה הקדמי של lamella בתמונה ב- cryo-TEM כדי לקבוע את הסימן של זווית טרום ההטיה. בשביל זה, התחושה של סיבוב שלב המיקרוסקופ חייב להיות ידוע. במערך הניסיוני שלנו, המיקום של הקצה הקדמי של lamella בצד ימין של התמונה שצולמה במצב SA ננו גשוש מתאים להטיה שלילית מראש.

תוצאות

תרבות הסרביזיה של סכרומיצס נקצרה באמצע שלב הצמיחה המעריכי. הכנו שני סוגים של דגימות שבהם התאים חולקו כאשכולות קטנים של מספר תאים על פני השטח של רשת TEM (איור 1A,C)או יצרנו מונו-שכבתית רציפה מעל ריבועי רשת בודדים של רשת TEM (איור 1B,D). הגורם המפלה להכנת המדגם עם איוני תאים נפרדים או המונו-שכבתית התאית הוא ריכוז תרבית התא המוחלת על רשת TEM. תרבית התא שנקטפו התרכזה ב- OD₆₀₀ = 1.0 עבור המקרה הקודם, או ל- OD₆₀₀ = 30 עד 60 במקרה האחרון, בהתאמה. המדגם להכנת monolayer הסלולר היה נוסף עם 5% v / v גליצריל לפני vitrification. הגליצרל הוא קריטי עבור vitrification של פתרון המאגר, אשר ממלא את הרווח בין התאים (איור 2) כמו השתקפויות מן המאגר הגבישי יכול להיות מזיק למעקב מיקום הנכון ומיקוד במהלך איסוף נתונים cryo-ET.

בנוסף, תרבות השעיית השמרים נמחקה כנגד החומר שאינו סופג כגון משטח הכתם של PTFE או הפנקס המודפס בתלת-ממד המותאם אישית העשוי מחומר FlexFill 98A. נייר הכתמים הוצב רק בחלק האחורי של הרשת ביחס ליישום לדוגמה (כתם אחורי). אסטרטגיית הכתם האחורית מומלצת להקפאת תרבות ההשעיה, שכן חבטה בנייר המסנן משני הצדדים גורמת להידבקות התאים בנייר הכתמים (איור 1E).

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש ברשתות TEM החתכות במחסנית הרשת, היוצרת תמיכה יציבה ברשת ומאפשרת טיפול לדוגמה של המדגם לאחר ה- vitrification. פעולה זו אוכפת הכרח כי מחזיקי מדגם אחרים ומעבורות במיקרוסקופ FIB / SEM ו- TEM יכולים לקבל מחסנית רשת כזו.

עם העברת המדגם למיקרוסקופ FIB/SEM, הדגימה הייתה מצופה לראשונה בשכבה של 0.3-1.0 מיקרומטר של מתילציקלופנטיניל פלטינה באמצעות מערכת הזרקת גז המיקרוסקופ (GIS). שכבה נוספת של האירידיום האנאורגני התנדנדה על משטח המדגם כדי להקשיח את שכבת GIS ולהפוך את פני השטח מוליכים. הלמלה נטחנו במספר שלבים (איור 3) שם (I) זרם הטחינה, (II) רוחב המלה, ו- (III) המרחק של אזור הטחינה מעל ומתחת לדגימות הופחת באופן צעד. שלב הטחינה האחרון ("ליטוש") בוצע בזרם נמוך (10-30 pA) רק מהצד העליון של lamella ועם המדגם נוטה על ידי 1° נוסף לכיוון קרן Ga + . ניצול הפרוטוקול המתואר הביא בממוצע 8-10 lamellae מוכן על שתי רשתות TEM בתוך הפעלה אחת 6-8 שעות.

רשתות TEM עם lamellae הועברו לאחר מכן לתוך מיקרוסקופ אלקטרוני שידור. המלה הוקרנו לראשונה ורק אלה שהראו וילונות מינימליים (חפצים הנובעים מטחינה לא אחידה על פני השטח של lamella), רמת זיהום פני שטח נמוכה וניגודיות תאית טובה (שבדרך כלל נצפתה עבור lamellae עם עובי של <200 ננומטר) נבחרו לרכישת נתוני cryo-ET. בנוסף, lamellae המכיל סדקים לאורך כל הדרך נמחקו מאיסוף נתונים. באופן כללי, כ-50% מה-lamellae שהועברו ל-TEM היו מתאימים לרכישת נתונים. סדרת הטיה נאספו בגלאי האלקטרונים הישירים K2 לאחר GIF עם חריץ בחירת אנרגיה מוגדר ל-20 eV. איסוף הנתונים בוצע בתוכנת SerialEM¹⁸ וסדרת ההטיה נאספו באמצעות ערכה סימטרית מינון¹⁹ עם טווח הטיה של ±60° וההפרש של 3°. הנתונים נרכשו בהגדלה המתאימה לגודל הפיקסלים של 3.47 A/px. המינון הכולל של 65 e /Å² הופץ באופן אחיד על פני תת מסגרות בודדות. תמונות ההטיה נאספו כסט של שלוש פריימים, אשר תוקנו לאחר מכן לנזק התנועה והקרינה במהלך רכישת נתונים באמצעות תוכנית MotionCor2^20. פרמטרים של פונקציית העברת הניגודיות הוערכו באמצעות Ctffind4²¹. סדרת הטיה עובדה eTomo¹⁸. שגרת המעקב אחר התיקונים שימשה ליישר את התמונות. טומוגרמה שוחזרה באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורי משוקלל לאחר 2x binning של התמונות, ולאחר מכן מסונן באמצעות מסנן דמוי SIRT (מוגדר 8 איטרציות) ב- IMOD¹⁸. פילוח טומוגרמה בוצע באופן ידני בתוכנת אמירה²². טומוגרמה משוחזרת מספקת ייצוג ברזולוציה גבוהה של פנים תאי השמרים ומאפשרת לנו להתבונן אברונים כגון vacuoles או מיטוכונדריה ברמה גבוהה של פירוט או ללמוד מתחמים מקרומולקולריים כגון microtubules, או מתחמי נקבוביות גרעיניות במקום ובתנאים כמעט מקומיים(איור 4).

figure-results-4030
איור 1: תמונות FIB ו- SEM של סרביסיה מנומרת
תמונות FIB (A) ו- SEM (C) של אשכולות השמרים הקטנים המתומחים ברשת TEM. תמונות FIB (B) ו- SEM (D) של השמרים היוצרות מונו-שכבתית רציפה על משטח הרשת. המדגם היה מצופה בשכבת GIS ו- Irridium לפני ההדמיה. סרגלי קנה המידה בחלוניות A-B תואמים ל- 10 מיקרומטר. דגימת השמרים נמחקת כנגד חומר שאינו סופג כגון PTFE או FlexFill 98A (ירוק) ועם נייר סופג ממוקם מהחלק האחורי של הרשת (לבן, E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4850
איור 2: ס. סרביסיה למלה
תמונת TEM של micromachined lamella מהדגימה עם שמרי monolayer מתמשכים על פני הרשת. ההשתקפויות שנצפו בין התאים הכילו בינוני/חיץ לא מנוטרל כראוי (A, מודגש עם עיגולים אדומים). תמונת TEM של lamella שנוצר על השמרים vitrified לתוך monolayer רציף עם תוספת של 5% גליצריל לתוך בינוני / חוצץ (B). סרגל קנה המידה מתאים ל- 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5548
איור 3: זרימת עבודה של קריו-FIBM
תיאור סכמטי של תהליך כרסום lamella. שלבי הטחינה הגסים הראשוניים מבוצעים בזרמי FIB גבוהים משני צידי תנוחת lamella מהוססת (מודגש בירוק) ואילו שלב הליטוש הסופי מתבצע רק מהצד העליון ובזרם FIB נמוך (מודגש בכתום, ראה וידאו נלווה בשעה 6:33). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6125
איור 4: אברוני שמרים ומתחמים מקרומולקולריים המתוארים על ידי cryo-ET
פרוסות טומוגמות משוחזרות המתארות vacuole (A, סרגל קנה מידה: 200 ננומטר), ריבוזומים (B, סרגל קנה מידה: 200 ננומטר), ליבה פרדריסטלינית של פרוקסיום(C,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר), microtubule (חץ לבן) בסמיכות של מבנה סיבי לא מזוהה (חץ שחור, D,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר), פרטים של microtubules מרובים (E,סרגל קנה מידה: 50 ננומטר), קרום גרעיני עם נקבוביות המצוינות על ידי חצים (F, סרגל קנה מידה 200nm), מיטוכונדריון(G,H,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר, החצים מצביעים על קריסטה בודדת), חבילה של מבנים חוטיים לא מזוהים(I,סרגל קנה מידה: 100 ננומטר). לוחות B, C, D, E, G מכילים קטע של טומוגרמה שהוכנה מאשכולות קטנים של תאים ואילו מקטעי טומוגרמה שנאספו על lamellae מ monolayer של התאים מוצגים לוחות A, F, H, I. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הכנת הדגימות הסלולריות עבור cryo-ET היא זרימת עבודה מורכבת הדורשת ניצול של מספר מכשירים מתקדמים. איכות המדגם יכולה להיות בסכנה במהלך כל שלב הכנה המשפיע על התפוקה של הפרוטוקול כולו. בנוסף, הצורך של העברת המדגם בין מכשירים בודדים מהווה סיכון נוסף של זיהום מדגם או devitrification. לכן, אופטימיזציה של שלבים בודדים בזרימת העבודה של הכנת המדגם היא בעלת חשיבות גבוהה כדי להגדיל את התפוקה ואת השחזור של זרימת העבודה להכנת lamella. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההכנה הממוטבת של Saccharomyces cerevisiae לאפיון מבני של מתחמי מקרומולקולרים במקום על ידי cryo-ET.

הפרוטוקול מתאר את הכנת שני סוגים של דגימות שמרים הנבדלות בעיקר בריכוז התאים ברשת TEM. שתי דגימות שמרים הניבו lamellae באיכות גבוהה עבור cryo-ET ובחירה של סוג הדגימה ניתן לעשות בהתאם למטרות המחקר המסוים. השמרים יוצרים אשכולות מבודדים של תאים מעטים הפזורים באופן אקראי על פני הרשת במקרה הראשון, בעוד מונו-שכבתית רציפה של תאים קיים על משטח רשת TEM עבור סוג המדגם השני. הראשון מתאים להכנת lamella מהירה הודות לנפח הקטן של החומר שיש לטחון משם. lamella הסופי הוא קצר למדי, ולכן, מכיל רק 2-4 חתך סלולרי. האזורים המתאימים להכנת מדגם מופצים באופן אקראי על פני הרשת כולל ריבועי הרשת, אשר עשויים להגביל חלקית את האוטומציה של זרימת העבודה להכנת lamella. הסוג האחרון של הדגימה דורש ניצול של זרמים גדולים יותר במהלך שלב הטחינה הראשוני כדי לשמור על זמן הטחינה הכולל. בנוסף, סוג זה של מדגם נוטה יותר חפצים הנובעים כרסום לא אחיד (וילונות). לכן, GIS הוא מקרטעת על משטח המדגם לתקופה ארוכה ב -50% מאשר במקרה של המדגם עם אשכולות סלולריים קטנים כדי ליצור שכבת הגנה עבה יותר. לאחר מכן, המדגם הוא מקרטעת עם שכבה נוספת של אירידיום (לחלופין פלטינה או זהב) כדי לרפא את שכבת GIS, להפוך אותו נוקשה יותר, ולהגדיל את מוליכות פני השטח מדגם. FIBM של אזורים נוספים בכל צד של lamella (~ 2-5 מיקרומטר מקצה lamella) במהלך הצעד הראשון של כרסום lamella מחוספס נמצא מועיל כדי להפחית את מספר lamellae שבור ככל הנראה בשל מתח ירד בחתך האחרון²³. המלה הסופי ארוך ומכיל ~ 10 חתך סלולרי, אשר מגדיל את מספר האזורים המתאימים cryo-ET. ניתן להחריף בקלות את ההחייאה הלא נכונה של המדיום או החיץ בין התאים על ידי הוספת מגן הקריו לפתרון החיץ (5% גליצל המשמש במחקר זה). מכיוון שרוב הריבועים מתאימים להכנת lamella, המדגם עם תאים המאורגנים לתוך monolayer רציף מתאים היטב להכנת lamella ללא פיקוח.

היבט חשוב נוסף בתהליך הכנת lamella הוא העברה למיקרוסקופ אלקטרונים השידור ומיצוב נכון של lamella לציר הטיית שלב המיקרוסקופ. באופן אופטימלי, הציר הראשי למלה מאונך לציר ההטיה של המיקרוסקופ המאפשר מעקב והתמקדות בגובה האזור המבומם ומונע מהקצוות המלה להגן על שדה הראייה בזוויות הטיה גבוהות. בעת איסוף נתוני cryo-ET באמצעות ערכת המינון-סימטרי,¹⁸ המדגם צריך להיות סובב בתחילה במיקרוסקופ כדי לפצות על הטיה של lamella ביחס למישור הרשת.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה Instruct-Ultra (גרנט 731005), iNEXT-Discovery (מענק 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית, ותשתית המחקר CIISB, מרכז Instruct-ERIC (LM2018127). אנו מכירים בתמיכה שהתקבלה מתרמו פישר סיינטיפיק ברנו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Himedia	MB053
Glucose	PENTA	12020-31000
Glycerol	Merck	G5516-1L
ethane	Messer	1007
LN2	Lineq	LN2-1L
Peptone	Merck	P5905-1KG
Saccharomyces cerevisiae	ATCC	201388	strain BY4741
Tweezers	Dumont	T539
Yeast extract	Duchefa Biochemie	Y1333.1000
Disposable
Blotting papers	Ted Pella	47000-10
C-clip	ThermoScientific	9432 909 97551
C-clip ring	ThermoScientific	9432 909 97561
Spreading sticks	Merck	Z376779-1PAK
Sterile inoculation loops	BRAND	BR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishes	Sigma	SIAL0166
TEM grids	Quantifoil	4420G-XA
Equipment
Autoclave	Systec	101291545
balances	BEL	M124A
Cryo-FIB/SEM microscope	ThermoScientific	1006123
Cryo-TEM microscope	ThermoScientific	9432 057 03301
Laminar flow box	Telstar	AH5
Plasma cleaner	Gatan	955.82001
Shaking incubator	New Brunswick	M1282-0002
UV/VIS spectrophotometer	WPA	S800
Vitrification robot	ThermoScientific	9432 053 50621

References

McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy. Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).
Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, (2018).
Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).
Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
Schur, F. K. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369, 554-557 (2020).
Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).
Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).
Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).
Pierson, J., et al. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).
Dubochet, J., et al. How to "read" a vitreous section. Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).
Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).
Schaffer, M., et al. Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography. Bio-protocol. 5, (2015).
Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography. eLife. e52286, (2020).
Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).
Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).
Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -. C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).
Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208, 107389 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: