אינדוקציה והערכה של דיסקינזיות הנגרמות על ידי לבודופה במודל חולדות של מחלת פרקינסון

Summary

מאמר זה מתאר שיטות להשרה ולהערכה של דיסקינזיות הנגרמות על ידי לבודופה במודל חולדה של מחלת פרקינסון. הפרוטוקול מציע מידע מפורט לגבי העוצמה והתדירות של מגוון התנהגויות דיסקינטיות, הן דיסטוניות והן היפרקינטיות, ומספק כלי אמין לבדיקת טיפולים המכוונים לצורך רפואי זה שטרם קיבל מענה.

Abstract

לבודופה (L-DOPA) נותרה הטיפול הסטנדרטי המשמש לטיפול בתסמינים מוטוריים של מחלת פרקינסון (PD). עם זאת, תנועות לא רצוניות לא רצויות הידועות בשם דיסקינזיות הנגרמות על ידי L-DOPA (LIDs) מתפתחות עם שימוש ממושך במבשר דופמין זה. ההערכה היא כי שכיחות ה-LIDs עולה לכ-90% מהאנשים עם מחלת פרקינסון תוך 10-15 שנות טיפול. הבנת המנגנונים של מחלה זו ופיתוח טיפולים אנטי-דיסקינזיים חדשניים ויעילים כאחד דורשת מודלים עקביים ומדויקים לבדיקה פרה-קלינית של התערבויות טיפוליות. שיטה מפורטת לאינדוקציה אמינה ודירוג מקיף של LIDs בעקבות נגעים ניגרליים הנגרמים על ידי 6-OHDA במודל חולדה של מחלת פרקינסון מוצגת כאן. הערכת LID מהימנה בחולדות מספקת כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו בקלות במעבדות שונות כדי לבחון טיפולים מתפתחים המתמקדים בהפחתת או ביטול הנטל הנפוץ הזה המושרה על ידי טיפול עבור אנשים עם מחלת פרקינסון.

Introduction

למרות שעברו יותר מ -50 שנה מאז שלבודופה (L-DOPA) הוצגה לראשונה כטיפול באנשים עם פרקינסון ^1,2, היא נותרה באופן מדהים הטיפול היעיל ביותר לתסמינים מוטוריים של פרקינסון. הסימפטומים המוטוריים הקליניים הקשורים לפרקינסון נובעים מאובדן של נוירוני דופמין (DA) ב- substantia nigra (SN) pars compacta, וכתוצאה מכך הירידה הדרמטית בדופמין הזמין בסטריאטום. L-DOPA משחזר ביעילות את רמות ה-DA של הסטריאטים, וכתוצאה מכך התועלת המוטורית בשלב מוקדם של המחלה ^3,4. באופן לא מתאים, עם טיפול ארוך טווח, רוב האנשים עם מחלת פרקינסון יפתחו דיסקינזיות המושרות על ידי L-DOPA (LID), כולל כוריאה, דיסטוניה ואטתוזיס, שלעתים קרובות משפיעות באופן משמעותי על פעילויות של חיי היומיום ^5,6,7.

בעוד שקיימים מספר מודלים התנהגותיים של LID במכרסמים, הבדלים במודלים ובהערכה התנהגותית של LIDs הטילו ספק ביכולת השכפול של התוצאות בין מעבדות, כמו גם באמינותם של כלים ניסיוניים אלה למחקרי PD פרה-קליניים. הפרוטוקול הנוכחי, שפותח בשיתוף עם מומחה להפרעות תנועה קליניות⁸, הוא שיטה פשוטה לאינדוקציה ודירוג של LID והוא מתאים לשימוש במודל חולדות של מחלת פרקינסון המשתמשת ב-6-הידרוקסידופאמין (6-OHDA) המושרה על ידי נגע ניגרלי חד-צדדי ^9,10. סולם דירוג LID המסופק כאן כולל ניקוד הן עבור העוצמה והן עבור התדירות של התנהגות דיסקינטית בחלקי גוף בודדים שונים. כמו כן, ניתן מידע רלוונטי לגבי אופטימיזציה של תהליכי עבודה של ניסויים וטיפול נאותים בבעלי חיים פרקינסון ודיסקינטיים.

Protocol

בעלי החיים שהוצגו כאן נשמרו וטופלו בהתאם להנחיות המוסדיות. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן (IACUC) בהתאם לתקנות הפדרליות והמדינתיות.

1. אישור ללא תרופות על מצב הנגע 6-OHDA

1. מבחן לתליית זנב יציב 11,12,13
   הערה: הערך את מצב הנגע לפחות שבוע לאחר אינדוקציה של נגע 6-OHDA (ראה ^9,10,35 לפרטים על הנגע) בנבדקים ניסיוניים (למשל, זכר או נקבה, ספראג דאולי בוגר או פישר 344 חולדות).
   1. תלו את החולדה כ-6 ס"מ מעל הכלוב שלה, כשהיא אוחזת בחוזקה בבסיס הזנב, במשך כ-5 שניות.
   2. רשום את כיוון ההתפתלות של הגוף כ+ עבור בעל חיים שנגע בהצלחה מתפתל בניגוד לצד הנגע ו - מחוסר פיתול או פיתול לשני הכיוונים.
   3. הערה: בדיקות אלה הן אופציונליות אך מומלצות. ראה 14,15,16,17 לאפשרויות/וריאציות נוספות של בדיקה ללא סמים.
2. בדיקת גרירה להתאמת שלבים (מותאמת^מ-16)
   הערה: הערך את מצב הנגע לפחות שבוע אחד לאחר אינדוקציה חד-צדדית של נגע 6-OHDA בנבדקים ניסיוניים (למשל, זכר או נקבה, ספראג דאולי בוגר או פישר 344 חולדות).
   1. החזיקו את החולדה על בסיס הזנב שלה, והרימו את הרגליים האחוריות מעל פני השטח בכ-6 ס"מ; גרור אחורה על פני משטח שטוח, חלק אך לא חלקלק, ~ 75 ס"מ, מעל 5-10 שניות.
   2. שימו לב ותעדו את מספר תנועות ההקשה/התאמת הצעדים של כל אחת מהן במשך שלוש בדיקות חוזרות ונשנות.
   3. דרג את הנבדק כ+ עבור נגע חד-צדדי מוצלח כאשר נצפו 0-2 ברזים קדמיים נגדיים לצד הנגע, יחד עם הקשה מהירה (כ-10 ברזים) מה-ipsilateral הקדמי לצד הנגע (לדוגמה, בעלי חיים הנגעים באופן חד צדדי בצד שמאל מראים גירעון הקשה (0-2 ברזים) עם הפנס הימני הקונטרה-צדדי).
   4. לעומת זאת, ציון הקשה בינוני עד מהיר (5-10 הקשות) משני המבשרים כמו - כדי להצביע על מצב נגע לא שלם או לא ידוע.
      הערה: בעל חיים חרד יכול להראות הקשה מהירה / התאמת צעדים גם אם נגע בהצלחה. אם יש חשד לכך, הניחו את החולדה בחזרה בכלוב הביתי שלהם ובדקו שוב ≥30 דקות מאוחר יותר.

2. הכנת ריאגנטים ואספקה

1. קביעת L-3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין מתיל אסטר הידרוכלוריד (לבודופה או L-DOPA) ובנסרזיד הידרוכלוריד, מינון מעכב דקרבוקסילאז היקפי (ראו טבלת חומרים), תדירות דירוג וציר זמן ניסיוני המתאים לשאלה הניסיונית 12,18,19,20 (איור 1).
   הערה: ניתן להציג שאלות ניסיוניות כדי לחפש כל מספר של שאלות, החל מלשאול אם טיפול מסוים עשוי להפחית את ה- LID הקיים או למנוע אינדוקציה של LID. הם יכולים גם לחקור אם היעילות הטיפולית תלויה במינון של לבודופה או האם ביטוי LID ו /או יעילות טיפולית משתנים בהתאם למין, למין ולגיל של הנושא.

איור 1: דוגמה לציר הזמן של הטיפול. ציר זמן לדוגמה של הסלמת מינון L-DOPA של 12 שבועות באורך כולל, עם 8 שבועות של זריקות L-DOPA המתחילות 3 שבועות לאחר נגע 6-OHDA ו-4 שבועות לאחר טיפול ניסיוני. בדוגמה זו, L-DOPA מוזרק באופן תת עורי 5x בשבוע (שני עד שישי) בערך באותה שעה בכל יום, במשך שבועיים בכל מינון L-DOPA שנקבע (3, 6, 9 ו-12 מ"ג/ק"ג). דירוגי LID התנהגותיים מתקיימים בימים 1, 6 ו-10 של כל רמת מינון L-DOPA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. שקלו חולדות מדי שבוע כדי לחשב את כמות התרופות המתאימה על סמך השינויים המתמשכים במשקל במהלך המחקר.
   הערה: בשל פעילות מוגברת בחולדות LID+, קיים פוטנציאל לירידה במשקל עם טיפולי L-DOPA ארוכי טווח. אם מתרחשת ירידה במשקל, ספקו לחולדות פינוקים מלאים מבחינה תזונתית וטעימים מאוד (ראו טבלת חומרים) לאחר זריקות L-DOPA.
3. חשב את כמות ה- L-DOPA וה- benserazide הנדרשת עבור כל ריכוז שבועי, שקילת אליקוטים ליופיליים לכל יום של הזרקה, ואחסון בשילוב למשך 1-2 שבועות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בבקבוקוני ענבר זכוכית עד ליום הטיפול.
   הערה: מינון היעד הוא 12 מ"ג/ק"ג או 12 מ"ג L-DOPA/1000 גרם משקל גוף. דוגמה לחישובים לקביעת כמות ה-L-DOPA והמלח הדרושים לכל יום בשבוע באמצעות משקל גוף של 12 מ"ג L-DOPA/kg בנפח הזרקה של 1 סמ"ק/ק"ג של משקל חולדה ניתנת בקובץ משלים 1.

3. הקמת חדר וכלוב

1. ביום הראשון של טיפול L-DOPA 3-4 שבועות לאחר ניתוח נגע 6-OHDA, להעביר חולדות לדיור יחיד, כולל העשרה שאושרה על ידי IACUC.
2. שמור על דיור יחיד לאורך כל המחקר כדי למנוע התערבות עמיתים בהערכות התנהגותיות.
3. בימי דירוג LID, הניחו את הכלובים הביתיים על מתלה חוטי פלדה, שהופעלו בזווית של כ-45^° לצפייה מיטבית בחולדה (איור 2A). הפכו את תגי הזיהוי (איור 2B) כלפי מעלה והסירו בקבוקי מים, מדפי מזון וכל סוגי ההעשרה בכלוב (איור 2C) כדי למנוע הפרעה להערכות התנהגותיות.

איור 2: דוגמה לכלוב שהוגדר עבור דירוגי LID של ניסויי חולדות בקנה מידה גדול. (A) ניתן להגדיר מספר כלובים לדירוג LID באמצעות מתלי מתכת גדולים המאפשרים צפייה אופטימלית של כל בעל חיים. יש לפרוס את הכלובים זה מזה בזווית של 45° עם תעודות זהות הפוכות כלפי מעלה (B), מזון, בקבוקי מים, חומרי קינון והעשרה אחרת כדי להגביל את הטשטוש החזותי של החולדה ואת הסחות הדעת של החולדה תוך בחינת התנהגויות דיסקינטיות (C). מתלי המתכת צריכים להיות במרחק מטרים ספורים מכל קיר כדי לאפשר למקצב לבחון את החולדה בחלק הקדמי או האחורי של הכלוב לפי הצורך. חיוני לסמן מנגנוני העשרה (למשל, C - בתי נסיגה של חולדות אדומות) עם תעודות זהות בודדות של בעלי חיים כדי להחליף אותם באותו כלוב שממנו הם הגיעו. זה חשוב במיוחד כאשר משתמשים בבעלי חיים ממינים שונים לא כדי להגביר את הלחץ על הנבדקים הניסיוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. זריקות לבודופה ודירוג דיסקינזיה

1. זריקות תת עוריות של L-DOPA ^21,22
   1. מיד לפני ההזרקה היומית של L-DOPA, הוסיפו את הנפח המתאים של מלח סטרילי לתערובת L-DOPA ובנסרזיד במשקל מראש בבקבוקון הענברי וניערו היטב במשך 10 שניות (שלב 2.3).
      הערה: נפח הזרקת המטרה הוא 1 מ"ל / 1000 גרם משקל גוף (עם 12 מ"ג L-DOPA לכל מ"ל). נפח המלוח הסטרילי יהיה תלוי במספר בעלי החיים בכל מחקר.
   2. מלאו מזרקים בודדים (למשל, 1.0 או 0.5 מ"ל במחט של 26 גרם) בנפח הנדרש עבור כל חיה (משקל חולדה של 1 מ"ל/ק"ג) ותייגו כל מזרק בזיהוי בעלי חיים בודדים.
      הערה: שמור על המזרקים הממולאים מוגנים מפני אור בשקיות סטריליות עד למועד ההזרקה. L-DOPA מתחמצן במהירות בנוכחות חמצן ואור בסביבה מימית 23,24,25,26.
   3. הביאו את הכלוב הראשון לספסל ההזרקה.
   4. מוציאים את החולדה מהכלוב שלה ומניחים אותה על משטח ההזרקה.
   5. לרסן בעדינות את הראש והכתפיים כנגד המשטח שעליו מונחת החולדה עם כף היד הלא דומיננטית.
   6. בעדינות, יש לקשקש את העור על הגב תוך שמירה על עצם השכמה עם האגודל והאצבע הקדמית של היד הלא דומיננטית, להזריק נפח L-DOPA עם היד הדומיננטית לתוך הרווח התת עורי שבין / מתחת לאצבעות, תוך שמירה על המחט מקבילה ככל האפשר לגוף כדי למנוע הזרקה תוך שרירית.
      הערה: החולדות אינן מורדמות לפני ההזרקה.
   7. השליכו כל מזרק משומש במיכל של שארפ.
   8. החליפו את החולדה בכלוב האינדיבידואלי שלה והוסיפו חטיפים מלאים מבחינה תזונתית למעט בימי דירוג LID כדי למנוע הפרעה להערכות ההתנהגותיות עד לאחר השלמת הדירוגים.
   9. הגדר את הטיימר למשך 1-2 דקות בהתאם לזמן הדירוג הרצוי ולמספר החולדות במחקר בימי הדירוג. שלפו את הכלוב הבא והזריקו את החולדה הבאה כאשר הטיימר מציין.
   10. חזרו על כך, וזרקו חולדה אחת כל 1-2 דקות, עד שכל החולדות מוזרקות.
2. דירוג דיסקינזיה המושרה על ידי לבודופה לאחר ההזרקה
   1. דרג את העוצמה (טבלה 1) והתדירות (טבלה 2) של תנועות דיסקינזיה דיסטוניות והיפרקינטיות במספר הרצוי של נקודות זמן, אשר אמורות לכלול את ההתחלה הראשונית של התנהגות LID, התנהגות שיא ושלב הירידה (ראה קובץ משלים 2 לדוגמה של גיליון יומן דירוג LID).
   2. עבור חולדות ספראג דאולי או פישר 344 בוגרות זכר ונקבה, וגודל מדגם של N = 40 חולדות, התחילו את דירוגי הדיסקינזיה 20 דקות לאחר הזרקת L-DOPA הראשונה, ולאחר מכן במרווחים של 50 דקות עד 220 או 270 דקות לאחר ההזרקה, תלוי מתי התנהגויות ה-LID הופסקו ב-90%-100% מהחולדות.
   3. אם אתה משתמש במרווחי דירוג של דקה אחת, הגדר טיימר למשך דקה אחת. דרגו את החולדה הראשונה למשך דקה אחת. עברו לחולדה הבאה ודרגו אותה במשך דקה אחת. המשך דרך כל החולדות, דירוג עבור מרווחים של דקה אחת.
   4. יש טיימר ממוקם ליד הכלוב באופן גלוי כך שניתן יהיה לצפות בעוצמת ההתנהגות של LID (טבלה 1) תוך הערכת התדירות של כל התנהגות נתונה (טבלה 2) במהלך תקופת הדירוג.
   5. לאחר השלמת הדירוגים של נקודת הזמן הראשונה, התחילו שוב עם החולדה הראשונה בנקודת הזמן הבאה (למשל, 70 דקות לאחר ההזרקה) והמשיכו במרווח הרצוי (למשל, כל 50 דקות) עד להשלמת כל נקודות הזמן.
      הערה: בשל החפיפה של הזרקת L-DOPA ומשימות דירוג LID, יש צורך בשני אנשים בימי הדירוג, אחד להזרקה ואחד לדירוגים התנהגותיים.

תוצאות

LIDs בחולדות פרקינסון יכולות להתבטא כמגוון של תנועות לא רצוניות חריגות (AIMs), כולל התנהגויות דיסטוניות, היפרקינטיות וסטריאוטיפיות. קריטריוני דירוג LID עבור התנהגויות כאלה מוצגים כאן כדי לכלול הן את העוצמה (טבלה 1) והן את התדירות (טבלה 2). זה מספק ציון חומרת LID כולל עבור כל חולדה ...

Discussion

מוצגים כאן פרטים על אינדוקציה הניתנת לשחזור ודירוג של LIDs במודל של חולדה פרקינסון בעקבות נגע חד צדדי 6-OHDA של מערכת DA nigrostriatal. בעוד שבעבר חשבו כי מכרסמים אינם מפתחים LID וכי אסימטריה סיבובית עשויה להיות האנלוגיה של LID בחולדות³¹, מודלים של חולדות ועכברים אופיינו במהלך שני העשורים הא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Minutes Digital Timer	Staples	1111764
Compass CX Compact Scale	Ohaus	30428202
5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide	Cayman Chemicals	25330	6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents.
Allentown cages	Allentown, LLC	Rat900	Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides.
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle	BD	BD 305540	For subcutaneous L-DOPA injections
Benserazide hydrochloride	Sigma-Aldrich	B7283	Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD.
Glass amber scintillation vials	Thermo Scientific	B7921	Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline.
L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	D1507	L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents.
Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils	Staples	107250
Rodent nutritionally complete enrichment treats	Bio-Serv	F05478
Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L	Corning	432129
Standard Plastic Clipboard	Staples	1227770
Steel wired 6' long movable shelving units	Uline	H9488	Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment
Sterile Saline 0.9%	Covidien/Argyle	1020	For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections.