Индукция и оценка дискинезий, вызванных леводопой, в крысиной модели болезни Паркинсона

Резюме

В этой статье описываются методы индуцирования и оценки дискинезий, вызванных леводопой, на крысиной модели болезни Паркинсона. Протокол предлагает подробную информацию об интенсивности и частоте диапазона дискинетического поведения, как дистонического, так и гиперкинетического, обеспечивая надежный инструмент для тестирования методов лечения, направленных на эту неудовлетворенную медицинскую потребность.

Аннотация

Леводопа (L-DOPA) остается золотым стандартом терапии, используемой для лечения двигательных симптомов болезни Паркинсона (БП). Однако нежелательные непроизвольные движения, известные как L-DOPA-индуцированные дискинезии (LIDs), развиваются при длительном использовании этого предшественника дофамина. По оценкам, заболеваемость LID возрастает примерно до 90% людей с БП в течение 10-15 лет лечения. Понимание механизмов этого заболевания и разработка как новых, так и эффективных методов лечения антидискинезии требует последовательного и точного моделирования для доклинического тестирования терапевтических вмешательств. Здесь представлен подробный метод надежной индукции и всесторонней оценки ЛИД после 6-OHDA-индуцированного нигрального поражения на крысиной модели БП. Надежная оценка LID на крысах обеспечивает мощный инструмент, который может быть легко использован в лабораториях для тестирования новых методов лечения, ориентированных на снижение или устранение этого общего бремени, вызванного лечением, для людей с БП.

Введение

Хотя прошло более 50 лет с тех пор, как леводопа (L-DOPA) была впервые введена в качестве лечения для людей с БП ^1,2, она удивительно остается наиболее эффективной терапией двигательных симптомов паркинсонизма. Клинические двигательные симптомы, связанные с БП, связаны с потерей дофаминовых (DA) нейронов в черной субстанции (SN) pars compacta, что приводит к резкому снижению доступного дофамина в полосатом теле. L-DOPA эффективно восстанавливает стриатальный уровень DA, что приводит к двигательной пользе на ранних стадиях заболевания ^3,4. Некстати, при длительном лечении у большинства людей с БП развиваются дискинезии, вызванные L-DOPA (LID), включая хорею, дистонию и атетоз, которые часто значительно влияют на повседневную деятельность ^5,6,7.

Хотя существует несколько поведенческих моделей LID у грызунов, различия в моделировании и поведенческой оценке LID поставили под сомнение воспроизводимость результатов между лабораториями, а также надежность этих экспериментальных инструментов для доклинических исследований БП. Разработанный совместно со специалистом по клиническим двигательным расстройствам⁸, текущий протокол является простым методом индукции и рейтинга LID и подходит для использования в крысиной модели БП с использованием 6-гидроксидотамина (6-OHDA), индуцированного односторонним нигральным поражением ^9,10. Шкала оценки LID, представленная здесь, включает оценку как интенсивности, так и частоты дискинетического поведения в различных отдельных частях тела. Также предоставляется соответствующая информация об оптимизации рабочего процесса экспериментов и надлежащем уходе и обращении с паркинсоническими и дискинетическими животными.

протокол

Животные, представленные здесь, содержались и обрабатывались в соответствии с институциональными руководящими принципами. Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Мичиганского государственного университета (IACUC) в соответствии с федеральными и государственными правилами.

1. Безмедикаментозное подтверждение статуса поражения 6-OHDA

1. Тест на повешение постурального ^{хвоста 11,12,13}
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените статус поражения по крайней мере через 1 неделю после индукции поражения 6-OHDA (см. ^9,10,35 для получения подробной информации о поражении) у экспериментальных субъектов (например, самца или женщины, взрослых Крыс Sprague Dawley или Fisher 344).
   1. Подвешивайте крысу примерно на 6 см выше своей клетки, крепко держась у основания хвоста, в течение ~5 с.
   2. Запишите направление искривления тела как + для успешно пораженного животного, скручивание контралатерально к пораженной стороне и - за отсутствие скручивания или скручивания в обе стороны.
   3. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти тесты являются необязательными, но рекомендуются. Смотрите 14,15,16,17 для дополнительных вариантов / вариаций тестирования без наркотиков.
2. Тест перетаскивания с регулировкой шага (адаптирован из¹⁶)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените статус поражения по крайней мере через 1 неделю после односторонней индукции поражения 6-OHDA у экспериментальных субъектов (например, самцов или самок, взрослых крыс Sprague Dawley или Fisher 344).
   1. Держите крысу за основание ее хвоста, поднимая задние лапы от поверхности на ~6 см; перетащите назад по ровной, гладкой, но не скользкой поверхности, ~75 см, более 5–10 с.
   2. Наблюдайте и записывайте количество движений постукивания/шага регулировки каждой передней лапы в течение трех повторных тестов.
   3. Оцените испытуемого как + для успешного одностороннего поражения, когда 0-2 постукивания передней лапы наблюдаются контралатерально к пораженной стороне, вместе с быстрым постукиванием (~ 10 постукиваний) от ипсилатеральной передней лапы к пораженной стороне (например, животные, в одностороннем порядке пораженные с левой стороны, демонстрируют дефицит постукивания (0-2 постукивания) с контралатеральной правой передней лапой).
   4. И наоборот, оцените умеренное или быстрое постукивание (5–10 постукиваний) от обеих передних лап как - для указания неполного или неизвестного статуса поражения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тревожное животное может показать быстрое постукивание / регулировку шага, даже если оно успешно повреждено. Если это подозревается, поместите крысу обратно в домашнюю клетку и повторно протестируйте ≥30 минут спустя.

2. Подготовка реагентов и расходных материалов

1. Определяют L-3,4-дигидроксифенилаланина метиловый эфир гидрохлорид (леводопа или L-ДОФА) и бенсеразида гидрохлорид, дозу периферического ингибитора декарбоксилазы (см. Таблицу материалов), номинальную частоту и экспериментальную временную шкалу, подходящую для исследуемого вопроса 12,18,19,20 (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследуемые вопросы могут быть поставлены для поиска любого количества вопросов, начиная от вопроса о том, может ли конкретная терапия уменьшить существующую LID или предотвратить индукцию LID. Они также могут изучить, зависит ли терапевтическая эффективность от дозы леводопы или экспрессия LID и / или терапевтическая эффективность варьируется в зависимости от пола, вида и возраста субъекта.

Рисунок 1: Пример временной шкалы лечения. Пример временной шкалы эскалации дозы L-DOPA составляет 12 недель в общей продолжительности, при этом 8 недель инъекций L-DOPA начинаются через 3 недели после поражения 6-OHDA и через 4 недели после экспериментального лечения. В этом примере L-DOPA подкожно вводят 5 раз в неделю (с понедельника по пятницу) примерно в одно и то же время каждый день, в течение 2 недель при каждой предписанной дозе L-DOPA (3, 6, 9 и 12 мг / кг). Поведенческие рейтинги LID проводятся в дни 1, 6 и 10 каждого уровня дозировки L-DOPA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Взвешивайте крыс еженедельно, чтобы рассчитать соответствующее количество препарата на основе текущих изменений веса во время исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за повышенной активности у крыс LID+ существует потенциал для потери веса при долгосрочном лечении L-DOPA. Если происходит потеря веса, обеспечьте крыс питательно полными, очень вкусными лакомствами (см. Таблицу материалов) после инъекций L-DOPA.
3. Рассчитайте количество L-ДОФА и бенсеразида, необходимое для каждой недельной концентрации, взвешивая лиофилизированные аликвоты за каждый день инъекции и храня в комбинации в течение 1–2 недель при -20 °C в стеклянных янтарных флаконах до дня обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целевая доза составляет 12 мг/кг или 12 мг L-DOPA/1000 г массы тела. Пример расчетов для определения количества L-DOPA и физиологического раствора, необходимых для каждого дня недели с использованием 12 мг L-DOPA/кг массы тела при объеме инъекции 1 куб.см/кг массы крысы приведен в Дополнительном файле 1.

3. Установка комнаты и клетки

1. В первый день лечения L-DOPA через 3-4 недели после операции по поражению 6-OHDA переведите крыс в одиночное жилье, включая обогащение, одобренное IACUC.
2. Содержание в одном жилье на протяжении всего исследования, чтобы избежать вмешательства сверстников в поведенческие оценки.
3. В дни рейтинга LID поместите домашние клетки на стальную проволочную стойку, повернутую под углом примерно 45^° для оптимального обзора крысы (рисунок 2A). Переверните идентификационные бирки (рисунок 2B) вверх и удалите бутылки с водой, стойки для еды и все виды обогащения в клетке (рисунок 2C), чтобы избежать вмешательства в поведенческие оценки.

Рисунок 2: Пример клетки, установленной для рейтингов LID крупномасштабных экспериментов на крысах. (A) Несколько клеток могут быть настроены для рейтинга LID с использованием больших металлических стоек, которые позволяют оптимально просматривать каждое животное. Клетки должны быть разделены под углом 45 ° с удостоверениями личности, перевернутыми вверх (B), пищей, бутылками с водой, материалами для гнездования и другим обогащением, чтобы ограничить визуальную неясность крысы и отвлекающие факторы для крысы при изучении дискинетического поведения (C). Металлические стойки должны быть в нескольких футах от любой стены, чтобы позволить оценщику осмотреть крысу в передней или задней части клетки по мере необходимости. Важно маркировать аппараты обогащения (например, дома для отдыха красных крыс) индивидуальными идентификаторами животных, чтобы заменить их в той же клетке, из которой они пришли. Это особенно важно при использовании животных разного пола, чтобы не увеличивать стресс для подопытных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Рейтинг инъекций леводопы и дискинезии

1. Подкожные инъекции L-DOPA^21,22
   1. Непосредственно перед ежедневной инъекцией L-DOPA добавляют соответствующий объем стерильного физиологического раствора к предварительно взвешенной лиофилизированной смеси L-DOPA и бенсеразида во флаконе янтаря и хорошо встряхивают в течение 10 с (стадия 2.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой объем инъекции составляет 1 мл/1000 г массы тела (с 12 мг L-DOPA на мл). Объем стерильного физиологического раствора будет зависеть от количества животных в одном исследовании.
   2. Наполните отдельные шприцы (например, 1,0 или 0,5 мл иглой 26 г) требуемым объемом для каждого животного (вес крысы 1 мл /кг) и нанесите на каждый шприц индивидуальную идентификацию животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наполненные шприцы защищенными от света в стерильных пакетах до момента инъекции. L-DOPA быстро окисляется в присутствии кислорода и света в водной среде 23,24,25,26.
   3. Поднесите первую клетку к инъекционному стенду.
   4. Извлеките крысу из клетки и поместите ее на поверхность инъекции.
   5. Осторожно прижмите голову и плечи к поверхности, на которой покоится крыса, ладонью недоминирующей руки.
   6. Аккуратно нанесите кожу на спину, покрывающую лопатки, большим и указательным пальцами недоминирующей руки, введите объем L-DOPA доминирующей рукой в подкожное пространство между/ниже пальцев, держа иглу как можно параллельнее телу, чтобы избежать внутримышечной инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крыс не анестезируют перед инъекцией.
   7. Утилизируйте каждый использованный отдельный шприц в контейнере ошейника.
   8. Замените крысу в ее индивидуальную клетку и добавьте питательные лакомства, за исключением дней рейтинга LID, чтобы избежать вмешательства в поведенческие оценки до тех пор, пока рейтинги не будут завершены.
   9. Установите таймер на 1–2 мин в зависимости от желаемого времени рейтинга и количества крыс в исследовании на рейтинговые дни. Извлеките следующую клетку и введите следующую крысу, когда таймер укажет.
   10. Повторяйте это, вводя одну крысу каждые 1-2 минуты, пока все крысы не будут введены.
2. Рейтинг дискинезии, вызванной леводопой, после инъекции
   1. Оцените интенсивность (таблица 1) и частоту (таблица 2) движений дистонической и гиперкинетической дискинезии в желаемом количестве временных точек, которые должны включать начальное начало поведения LID, пиковое поведение и фазу снижения (см. Дополнительный файл 2 для примера журнала рейтинга LID).
   2. Для самцов и самок взрослых крыс Sprague Dawley или Fisher 344 и размер выборки N = 40 крыс начинают оценку дискинезии через 20 мин после первой инъекции L-DOPA, а затем с интервалом 50 мин до 220 или 270 мин после инъекции, в зависимости от того, когда поведение LID прекратилось у 90%-100% крыс.
   3. Если используются 1-минутные интервалы рейтинга, установите таймер на 1 мин. Оцените первую крысу в течение одной минуты. Перейдите к следующей крысе и оцените ее в течение 1 мин. Продолжайте через всех крыс, оценивая с интервалом в 1 мин.
   4. Расположите таймер рядом с клеткой так, чтобы интенсивность поведения LID (таблица 1) можно было наблюдать при оценке частоты любого заданного поведения (таблица 2) в течение периода рейтинга.
   5. После того, как оценки для первой точки времени завершены, начните снова с первой крысы в следующий момент времени (например, через 70 минут после инъекции) и продолжайте с желаемым интервалом (например, каждые 50 минут) до тех пор, пока не будут завершены все временные точки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за перекрытия задач по внедрению L-DOPA и рейтингу LID в дни рейтинга необходимы два человека, один для инъекций и один для поведенческих рейтингов.

Результаты

ЛИДы у паркинсонических крыс могут проявляться в виде ряда аномальных непроизвольных движений (ИМ), включая дистоническое, гиперкинетическое и стереотипное поведение. Критерии оценки LID для такого поведения представлены здесь, чтобы включить как интенсивность (таблица 1), так ...

Обсуждение

Здесь представлены подробные сведения о воспроизводимой индукции и рейтинге LID в модели крысы-паркинсониста после одностороннего поражения 6-OHDA нигростриатальной системы DA. Хотя когда-то считалось, что у грызунов не развивается LID и что ротационная асимметрия может быть аналогом LID у к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Minutes Digital Timer	Staples	1111764
Compass CX Compact Scale	Ohaus	30428202
5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide	Cayman Chemicals	25330	6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents.
Allentown cages	Allentown, LLC	Rat900	Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides.
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle	BD	BD 305540	For subcutaneous L-DOPA injections
Benserazide hydrochloride	Sigma-Aldrich	B7283	Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD.
Glass amber scintillation vials	Thermo Scientific	B7921	Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline.
L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	D1507	L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents.
Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils	Staples	107250
Rodent nutritionally complete enrichment treats	Bio-Serv	F05478
Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L	Corning	432129
Standard Plastic Clipboard	Staples	1227770
Steel wired 6' long movable shelving units	Uline	H9488	Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment
Sterile Saline 0.9%	Covidien/Argyle	1020	For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections.