Induzione e valutazione delle discinesie indotte da levodopa in un modello di ratto della malattia di Parkinson

Riepilogo

Questo articolo descrive i metodi per indurre e valutare le discinesie indotte da levodopa in un modello di ratto di malattia di Parkinson. Il protocollo offre informazioni dettagliate sull'intensità e la frequenza di una serie di comportamenti discinetici, sia distonici che ipercinetici, fornendo uno strumento affidabile per testare trattamenti mirati a questo bisogno medico insoddisfatto.

Abstract

La levodopa (L-DOPA) rimane la terapia gold standard usata per trattare i sintomi motori del morbo di Parkinson (PD). Tuttavia, movimenti involontari indesiderati noti come discinesie indotte da L-DOPA (LID) si sviluppano con l'uso prolungato di questo precursore della dopamina. Si stima che l'incidenza di LID aumenti a circa il 90% degli individui con PD entro 10-15 anni dal trattamento. Comprendere i meccanismi di questa malattia e sviluppare trattamenti anti-discinesia sia nuovi che efficaci richiede una modellazione coerente e accurata per i test pre-clinici degli interventi terapeutici. Un metodo dettagliato per un'induzione affidabile e una valutazione completa dei LID a seguito di lesione nigrale indotta da 6-OHDA in un modello di RATto di PD è presentato qui. La valutazione LID affidabile nei ratti fornisce un potente strumento che può essere prontamente utilizzato in tutti i laboratori per testare terapie emergenti incentrate sulla riduzione o l'eliminazione di questo onere comune indotto dal trattamento per gli individui con PD.

Introduzione

Sebbene siano passati più di 50 anni da quando la levodopa (L-DOPA) è stata introdotta per la prima volta come trattamento per gli individui con PD ^1,2, rimane notevolmente la terapia più efficace per i sintomi motori parkinsoniani. I sintomi motori clinici associati al PD derivano dalla perdita di neuroni della dopamina (DA) nella substantia nigra (SN) pars compacta, con conseguente drastica diminuzione della dopamina disponibile nello striato. La L-DOPA ripristina efficacemente i livelli di DA striatale, con conseguente beneficio motorio all'inizio della malattia ^3,4. Inopportunamente, con il trattamento a lungo termine, la maggior parte degli individui con PD svilupperà discinesie indotte da L-DOPA (LID), tra cui corea, distonia e atetosi, che spesso hanno un impatto significativo sulle attività della vita quotidiana ^5,6,7.

Mentre esistono diversi modelli comportamentali di LID nei roditori, le differenze nella modellazione e nella valutazione comportamentale dei LID hanno messo in discussione la riproducibilità dei risultati tra i laboratori e l'affidabilità di questi strumenti sperimentali per la ricerca pre-clinica sul PD. Sviluppato in associazione con uno specialista clinico di disturbi del movimento⁸, l'attuale protocollo è un metodo semplice per l'induzione e la valutazione della LID ed è appropriato per l'uso in un modello di RATto di PD che utilizza la lesione nigrale unilaterale indotta da 6-idrossidopamina (6-OHDA) ^9,10. La scala di valutazione LID fornita qui include il punteggio sia per l'intensità che per la frequenza del comportamento discinetico in varie singole parti del corpo. Vengono inoltre fornite informazioni pertinenti riguardanti l'ottimizzazione del flusso di lavoro degli esperimenti e la cura e la gestione appropriate degli animali parkinsoniani e discinetici.

Protocollo

Gli animali qui presentati sono stati mantenuti e trattati nel rispetto delle linee guida istituzionali. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in conformità con le normative federali e statali.

1. Conferma senza farmaci dello stato della lesione 6-OHDA

1. Prova di sospensione della coda posturale 11,12,13
   NOTA: Valutare lo stato della lesione almeno 1 settimana dopo l'induzione della lesione 6-OHDA (vedere ^9,10,35 per i dettagli sulla lesione) in soggetti sperimentali (ad esempio, maschio o femmina, ratti adulti Sprague Dawley o Fisher 344).
   1. Sospendere il ratto a circa 6 cm sopra la sua gabbia, tenendo saldamente alla base della coda, per ~ 5 s.
   2. Registrare la direzione della contorsione del corpo come + per un animale lesionato con successo che torce il controlaterale sul lato lesionato e - per mancanza di torsione o torsione in entrambe le direzioni.
   3. NOTA: questi test sono facoltativi ma consigliati. Vedere 14,15,16,17 per ulteriori opzioni/variazioni di test senza droga.
2. Test di trascinamento della regolazione del passo (adattato da¹⁶)
   NOTA: Valutare lo stato della lesione almeno 1 settimana dopo l'induzione unilaterale della lesione 6-OHDA in soggetti sperimentali (ad es. ratti maschi o femmine, Sprague Dawley adulti o Fisher 344).
   1. Tenere il topo per la base della coda, sollevando i piedi posteriori dalla superficie di ~ 6 cm; trascinare all'indietro su una superficie piatta, liscia ma non scivolosa, ~ 75 cm, oltre 5-10 s.
   2. Osservare e registrare il numero di movimenti di regolazione del tocco/passo di ciascuna zampa anteriore su tre test ripetuti.
   3. Segna il soggetto come + per una lesione unilaterale di successo quando si osservano 0-2 rubinetti di zampa anteriore sul lato lesionato, insieme a un rapido tocco (~ 10 rubinetti) dall'ipsilaterale della zampa anteriore al lato lesionato (ad esempio, gli animali lesionati unilateralmente sul lato sinistro mostrano deficit di picchiettamento (0-2 rubinetti) con la zampa anteriore destra controlaterale).
   4. Al contrario, segnare un tocco da moderato a rapido (5-10 tocchi) da entrambe le zampe anteriori come - per indicare uno stato di lesione incompleto o sconosciuto.
      NOTA: un animale ansioso può mostrare una rapida regolazione del tapping / step anche se lesionato con successo. Se questo è sospettato, rimetti il topo nella loro gabbia di casa e ri-testa ≥30 minuti dopo.

2. Preparazione dei reagenti e delle forniture

1. Determinare L-3,4-diidrossifenilalanina estere metilico cloridrato (levodopa o L-DOPA) e benserazide cloridrato, una dose periferica di inibitore della decarbossilasi (vedere Tabella dei materiali), frequenza di valutazione e tempistica sperimentale appropriata per la domanda sperimentale 12,18,19,20 (Figura 1).
   NOTA: Le domande sperimentali possono essere poste per cercare qualsiasi numero di domande che vanno dal chiedere se una terapia specifica potrebbe ridurre il LID esistente o prevenire l'induzione di LID. Possono anche esplorare se l'efficacia terapeutica dipende dalla dose di levodopa o se l'espressione della LID e / o l'efficacia terapeutica varia a seconda del sesso, della specie e dell'età del soggetto.

Figura 1: Esempio di tempistica del trattamento. Esempio di L-DOPA dose-escalation timeline di 12 settimane di lunghezza totale, con 8 settimane di iniezioni di L-DOPA a partire da 3 settimane dopo la lesione 6-OHDA e 4 settimane dopo il trattamento sperimentale. In questo esempio, la L-DOPA viene iniettata per via sottocutanea 5 volte a settimana (dal lunedì al venerdì) all'incirca alla stessa ora ogni giorno, per 2 settimane a ciascuna dose di L-DOPA prescritta (3, 6, 9 e 12 mg / kg). Le valutazioni LID comportamentali si svolgono nei giorni 1, 6 e 10 di ciascun livello di dosaggio di L-DOPA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Pesare i ratti settimanalmente per calcolare la quantità di farmaco appropriata in base alle variazioni di peso in corso durante lo studio.
   NOTA: A causa dell'aumento dell'attività nei ratti LID +, esiste un potenziale di perdita di peso con trattamenti L-DOPA a lungo termine. Se si verifica una perdita di peso, fornire ai ratti prelibatezze nutrizionalmente complete e altamente appetibili (vedere tabella dei materiali) dopo le iniezioni di L-DOPA.
3. Calcolare la quantità di L-DOPA e benserazide necessaria per ogni concentrazione settimanale, soppesando le aliquote liofilizzate per ogni giorno di iniezione e conservando in combinazione per 1-2 settimane a -20 °C in flaconcini di vetro ambrato fino al giorno del trattamento.
   NOTA: La dose target è di 12 mg/kg o 12 mg di L-DOPA/1000 g di peso corporeo. Esempi di calcoli per determinare la quantità di L-DOPA e soluzione salina necessaria per ogni giorno della settimana utilizzando 12 mg di L-DOPA/kg di peso corporeo ad un volume di iniezione di 1 cc/kg di peso del ratto sono riportati nel fascicolo supplementare 1.

3. Allestimento della stanza e della gabbia

1. Il primo giorno di trattamento con L-DOPA 3-4 settimane dopo l'intervento chirurgico alla lesione 6-OHDA, trasferire i ratti in un singolo alloggiamento, incluso l'arricchimento approvato dalla IACUC.
2. Mantenere in un unico alloggio durante lo studio per evitare interferenze tra pari con le valutazioni comportamentali.
3. Nei giorni di valutazione LID, posizionare le gabbie domestiche su una griglia di acciaio, ruotata con un angolo di circa 45 ^° per una visione ottimale del ratto (Figura 2A). Capovolgere i tag di identificazione (Figura 2B) verso l'alto e rimuovere bottiglie d'acqua, rack di cibo e tutti i tipi di arricchimento nella gabbia (Figura 2C) per evitare interferenze con le valutazioni comportamentali.

Figura 2: Esempio della gabbia predisposta per le classificazioni LID di esperimenti su ratti su larga scala. (A) È possibile impostare gabbie multiple per la classificazione LID utilizzando grandi scaffalature metalliche che consentono una visione ottimale di ciascun animale. Le gabbie dovrebbero essere distribuite con un angolo di 45 ° con carte d'identità capovolte verso l'alto (B), cibo, bottiglie d'acqua, materiali di nidificazione e altri arricchimenti rimossi per limitare l'oscurità visiva del ratto e le distrazioni al ratto durante l'esame dei comportamenti discinetici (C). Le scaffalature metalliche devono essere a pochi metri di distanza da qualsiasi parete per consentire al valutatore di esaminare il ratto nella parte anteriore o posteriore della gabbia, se necessario. È essenziale etichettare gli apparecchi di arricchimento (ad esempio, le case di ritiro dei ratti rossi C) con i singoli ID degli animali per sostituirli nella stessa gabbia da cui provengono. Ciò è particolarmente importante quando si utilizzano animali di sesso diverso per non aumentare lo stress ai soggetti sperimentali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Iniezioni di levodopa e valutazione della discinesia

1. Iniezioni sottocutanee di L-DOPA^21,22
   1. Immediatamente prima dell'iniezione giornaliera di L-DOPA, aggiungere il volume appropriato di soluzione salina sterile alla miscela di L-DOPA liofilizzata e benserazide pre-pesata nel flaconcino ambrato e agitare bene per 10 s (fase 2.3).
      NOTA: il volume target di iniezione è di 1 mL/1000 g di peso corporeo (con 12 mg di L-DOPA per mL). Il volume della soluzione salina sterile dipenderà dal numero di animali per studio.
   2. Riempire le singole siringhe (ad esempio, 1,0 o 0,5 mL con ago da 26 G) con il volume richiesto per ciascun animale (1 ml/kg di peso del ratto) ed etichettare ciascuna siringa con l'identificazione individuale dell'animale.
      NOTA: Tenere le siringhe riempite al riparo dalla luce in sacchetti sterili fino al momento dell'iniezione. La L-DOPA si ossida rapidamente in presenza di ossigeno e luce in ambiente acquoso 23,24,25,26.
   3. Portare la prima gabbia al banco di iniezione.
   4. Rimuovere il ratto dalla sua gabbia e posizionarlo sulla superficie di iniezione.
   5. Trattenere delicatamente la testa e le spalle contro la superficie su cui il ratto è appoggiato con il palmo della mano non dominante.
   6. Tamponare delicatamente la pelle sulla schiena sovrastante le scapole con il pollice e l'indice della mano non dominante, iniettare il volume di L-DOPA con la mano dominante nello spazio sottocutaneo tra/sotto le dita, mantenendo l'ago il più parallelo possibile al corpo per evitare l'iniezione intramuscolare.
      NOTA: I ratti non vengono anestetizzati prima dell'iniezione.
   7. Smaltire ogni singola siringa usata in un contenitore tagliente.
   8. Sostituire il ratto nella sua gabbia individuale e aggiungere prelibatezze nutrizionalmente complete tranne nei giorni di valutazione LID per evitare interferenze con le valutazioni comportamentali fino a quando le valutazioni non sono complete.
   9. Impostare il timer per 1-2 minuti a seconda del tempo di valutazione desiderato e del numero di ratti nello studio nei giorni di valutazione. Recupera la gabbia successiva e inietta il ratto successivo quando il timer lo indica.
   10. Ripeti questo, iniettando un ratto ogni 1-2 minuti, fino a quando tutti i ratti non vengono iniettati.
2. Valutazione della discinesia indotta da levodopa post-iniezione
   1. Valutare l'intensità (Tabella 1) e la frequenza (Tabella 2) dei movimenti di discinesia distonica e ipercinetica al numero desiderato di timepoint, che dovrebbe includere l'inizio iniziale del comportamento LID, il comportamento di picco e la fase di declino (vedere il file supplementare 2 per un esempio di foglio di registro di valutazione LID).
   2. Per i ratti adulti di sesso maschile e femmina Sprague Dawley o Fisher 344 e una dimensione del campione di N = 40 ratti, iniziare le valutazioni di discinesia 20 minuti dopo la prima iniezione di L-DOPA e quindi a intervalli di 50 minuti fino a 220 o 270 minuti dopo l'iniezione, a seconda di quando i comportamenti LID sono stati interrotti nel 90%-100% dei ratti.
   3. Se si utilizzano intervalli di valutazione di 1 minuto, impostare un timer per 1 minuto. Valuta il primo ratto per un minuto. Passa al ratto successivo e valutalo per 1 minuto. Continua attraverso tutti i ratti, valutando intervalli di 1 minuto.
   4. Avere un timer posizionato accanto alla gabbia in modo visibile in modo che l'intensità del comportamento LID (Tabella 1) possa essere osservata mentre si stima la frequenza di un dato comportamento (Tabella 2) durante il periodo di valutazione.
   5. Dopo che le valutazioni per il primo punto temporale sono state completate, ricominciare con il primo ratto al punto temporale successivo (ad esempio, 70 minuti dopo l'iniezione) e continuare all'intervallo desiderato (ad esempio, ogni 50 minuti) fino a quando tutti i punti temporali sono completati.
      NOTA: A causa della sovrapposizione delle attività di iniezione di L-DOPA e lid rating, sono necessarie due persone nei giorni di valutazione, una per l'iniezione e una per le valutazioni comportamentali.

Risultati

I LLD nei ratti parkinsoniani possono manifestarsi come una serie di movimenti involontari anormali (AAM), inclusi comportamenti distonici, ipercinetici e stereotipati. I criteri di valutazione LID per tali comportamenti sono presentati qui per includere sia l'intensità (Tabella 1) che la frequenza (Tabella 2). Ciò fornisce un punteggio complessivo di gravità LID per ciascun ratto che riflette sia la qualità (intensità) che la quantità di tempo trascorso a impegnarsi (frequenza) in...

Discussione

Qui sono presentati i dettagli per l'induzione riproducibile e la valutazione dei LIT in un modello di ratto parkinsoniano a seguito di lesione unilaterale 6-OHDA del sistema DA nigrostriatale. Mentre una volta si pensava che i roditori non sviluppassero LID e che l'asimmetria rotazionale potesse essere l'analogo di LID nei ratti³¹, i modelli di ratti e topi sono stati caratterizzati negli ultimi due decenni e sono uno strumento ben accettato per la ricerca LID 15,32,33,34....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Minutes Digital Timer	Staples	1111764
Compass CX Compact Scale	Ohaus	30428202
5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide	Cayman Chemicals	25330	6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents.
Allentown cages	Allentown, LLC	Rat900	Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides.
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle	BD	BD 305540	For subcutaneous L-DOPA injections
Benserazide hydrochloride	Sigma-Aldrich	B7283	Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD.
Glass amber scintillation vials	Thermo Scientific	B7921	Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline.
L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	D1507	L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents.
Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils	Staples	107250
Rodent nutritionally complete enrichment treats	Bio-Serv	F05478
Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L	Corning	432129
Standard Plastic Clipboard	Staples	1227770
Steel wired 6' long movable shelving units	Uline	H9488	Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment
Sterile Saline 0.9%	Covidien/Argyle	1020	For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections.