בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Summary

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

Abstract

תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) הם תאי אנדותל מיוחדים הממוקמים בממשק שבין מחזור הדם לבין הפרנכימה של הכבד. ל-LSECs יש מורפולוגיה מובחנת המאופיינת בנוכחות של fenestrae ובהיעדר קרום מרתף. LSECs ממלאים תפקידים חיוניים בהפרעות פתולוגיות רבות בכבד, כולל חוסר ויסות מטבולי, דלקת, פיברוזיס, אנגיוגנזה וקרצינוגנזה. עם זאת, מעט מאוד פורסם על הבידוד והאפיון של LSECs. כאן, פרוטוקול זה דן בבידוד של LSEC מעכברים בריאים ולא אלכוהוליים של מחלת כבד שומני (NAFLD). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. מחקר זה מאפיין LSECs באמצעות סמנים ספציפיים על ידי ציטומטריה של זרימה ומזהה את התכונות הפנוטיפיות האופייניות על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. LSECs שבודדו בעקבות פרוטוקול זה יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים, כולל מבחני הידבקות וחדירות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלול עניין מסוים. בנוסף, ניתן לאגד או להשתמש ב-LSECs אלה בנפרד, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקות, כולל תפזורת RNA-seq או תא בודד, פרוטאומי או פוספו-פרוטאומיקה, ובדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq), בין היתר. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים החוקרים את התקשורת של LSECs עם תאי כבד אחרים בבריאות ובמחלות ויאפשר הבנה מעמיקה של תפקידם של LSECs במנגנונים הפתוגניים של פגיעה חריפה וכרונית בכבד.

Introduction

תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) מרפדים את דפנות הסינוסואידים הכבדים והם התאים הלא-פרנכימליים הנפוצים ביותר בכבד¹. LSECs נבדלים מתאי אנדותל נימיים אחרים במקומות אחרים בגוף על ידי נוכחות של fenestrae והיעדר קרום מרתף קלאסי או דיאפרגמה ^2,3. לפיכך, LSECs הם בעלי מאפיינים פנוטיפיים ומבניים ייחודיים המשפרים את חדירותם ואת יכולתם האנדוציטית לחסל מגוון של מקרומולקולות במחזור הדם, כולל שומנים וליפופרוטאינים. LSECs ממלאים תפקיד מרכזי בהצלבה בין תאים פרנכימליים ולא-פרנצ'ימליים, כגון תאי סטלה ותאי מערכת החיסון. LSECs הם המפתח לשמירה על הומאוסטזיס בכבד על ידי שמירה על תאי הסטלטים ותאי קופפר במצב^{שקט 4}. LSECs מווסתים את הרכב אוכלוסיות תאי החיסון בכבד על ידי תיווך הידבקות והגירה טרנס-אנדותל של לויקוציטים במחזור ^5,6. במהלך פגיעה חריפה וכרונית בכבד⁷, כולל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI)⁸, סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH)⁹, וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC), LSECs עוברים שינויים פנוטיפיים הידועים בשם קפילאריזציה המאופיינים בהתגוננות והיווצרות של קרום מרתף¹⁰. שינויים פנוטיפיים אלה ב-LSECs קשורים לתפקוד לקוי של LSECs ולרכישת תכונות פרותרומבוטיות, פרו-דלקתיות ופרופילוגניות.

מספר שיטות לבידוד של LSECs מכבד העכבר פותחו¹¹. טכניקות מסוימות תלויות בהפרדת תאים לא-פרנכימליים ופרנכימליים ולאחר מכן צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות כדי לטהר את ה-LSECs משברים לא-פרנצ'ימליים. המגבלה של שיטה זו היא נוכחות של מקרופאגים מזהמים בשלבים האחרונים של בידוד LSECs, אשר יכול להשפיע על טוהר של LSECs^{מבודדים 12}. פרוטוקול זה מבוסס על זלוף קולגןאז של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים CD146⁺ של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. LSECs שבודדו בשיטה זו מראים טוהר גבוה ומורפולוגיה ומשומרת וכדאיות. LSECs אלה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים, כולל בדיקת חדירות והידבקות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלולי עניין. יתר על כן, עם העניין הגובר ביצירת מערכי ביג דאטה הן במחקר קליני והן במדע הגילוי, ניתן לאגד או להשתמש בנפרד ב-LSECs באיכות גבוהה אלה המבודדים מכבדים בריאים וחולים עם סטאטוהפטיטיס לא-אלכוהולית (NASH) או מצבים אחרים, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקה והשוואה בין בריאות למחלות ^13,14 . בנוסף, ניתן להשתמש ב-LSECs המבודדים כדי לפתח מודלים דו-ממדיים כמו גם תלת-ממדיים במבחנה כמו אורגנואידים כדי לפענח את מסלול האיתות המופעל ב-LSECs ואת התקשורת הבין-תאית שלהם עם תאי כבד אחרים תחת גירויים רעילים שונים ובתגובה להתערבויות טיפוליות שונות.

Protocol

פרוטוקולים של בעלי חיים נערכו כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מאיו קליניק. עכברים זכרים C57BL/6J בני שמונה שבועות נרכשו ממעבדת ג'קסון. העכברים שוכנו במתקן מחזור בהיר-כהה מבוקר טמפרטורה של 12:12 שעות עם גישה חופשית לתזונה.

1. הכנת צלחת או צלחת תרבית מצופה קולגן

1. כדי לייצר 50 מ"ל של חומצה אצטית של 0.02 מול/ל', יש להוסיף 0.6 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ל-49.4 מ"ל של H₂O.
2. הכינו 50 מיקרוגרם/מ"ל קולגן מסוג I בחומצה אצטית 0.02 מול/ל'. הדילול תלוי בריכוז המגרש.
3. מצפים מנות תרבית 10 ס"מ עם תמיסת קולגן של 3 מ"ל. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.
   הערה: בעת שימוש בצלחת או צלחת אחרת לתרבית, יש להתאים את נפח תמיסת הציפוי בהתאם לאזור התרבית, בדרך כלל להשתמש ב- 6-10 מיקרוגרם / ס"מ².
4. יש להסיר את הנוזל העודף מהמשטח המצופה, ולשטוף עם מלח עם גוש פוספט (PBS) 3 פעמים. אפשרו לכלים להתייבש באוויר.
5. אם תמיסת הקולגן אינה סטרילית, עיקרו את הכלים המצופה בקולגן על ידי חשיפה לאור אולטרה סגול (UV) למשך 10 דקות במכסה אדים של תרבית רקמה סטרילית.

2. הגדרת ציוד

1. הגדירו את מנגנון הזלוף המחומם והלח, כפי שמוצג באיור 1B.
2. שטפו את מערכת הזלוף באמצעות 10% אקונומיקה למשך 5 דקות ולאחר מכן מים סטריליים למשך 10 דקות נוספות.
3. מסננים את נוזל השטיפה ככל האפשר לפני שאתם מנקבים את תמיסת הקולגנאז.
4. החדירו תמיסת קולגןאז דרך מערכת הזלוף (כפי שמוצג באיור 1B) כדי לחמם אותה מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קצב המשאבה במהירות 1 כפי שמוצג בחוגת בקרת המהירות (שווה ערך ל- 40 מ"ל לדקה).
5. שמור על מהירות זו זהה לאורך כל ההליך. יש לעשות שימוש חוזר בתמיסת הקולגאז הפועלת במעגל סגור במהלך יום הבידוד של LSEC.
   הערה: מהירות המשאבה קבועה על 1 כדי למנוע לחץ מכני שעלול להפריע למצב הביולוגי של LSECs.

3. הליך כירורגי

1. שקלו את העכבר.
2. יש להזריק 90 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קטמין ומשקל גוף של 10 מ"ג/ק"ג של קסילאזין תוך-צפקי (IP).
3. ברגע שהעכבר אינו פעיל לגירויים כואבים, הצמידו את העכבר למשטח הניתוח, כפי שניתן לראות באיור 1B.
4. מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך באורך של כ -5 ס"מ החל מהחלק התחתון של הבטן ועד לתהליך xiphoid.
5. לאחר מכן, לעשות שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים קשתית קטנה בכל צד של הבטן כדי לחשוף באופן מלא את איברי הבטן.
6. מניחים את הנדן של הצנתר התוך ורידי (IV) מתחת לגב החיה כדי להרים וליישר את הבטן.
7. באמצעות מלקחיים קבועים של חבישה מעוקלת, משכו בעדינות את המעיים ואת הבטן משמאל לבעל החיים.
8. מניחים תפר כירורגי 5-0 מתחת לווריד הנבוב התחתון (IVC) ממש מתחת לכליה השמאלית החשופה. קשרו תקלה רופפת בתפר.
9. מניחים עוד תפר כירורגי 5-0 סביב וריד פורטל הכבד (PV) ממש מעל נקודת ההסתעפות של וריד הטחול מה-PV הכבדי. קשרו תקלה רופפת בתפר.
10. באמצעות תפר PV כמתח, הכנס את קטטר 20 G IV בכבד PV 1 ס"מ מתחת למקום שבו הוא מסתעף ימינה ושמאלה PV כבד.
11. החליקו את הצנתר במעלה הווריד אך שמרו אותו מתחת לאזור ההסתעפות. אפשרו לדם לנוע במורד הצנתר עד שהוא מתחיל לטפטף החוצה.
12. עם חלק מהמאגר A (טבלה 1) בבקבוק תוך ורידי (IV) הממוקם מעל האזור הניתוחי, השתמש בקו עירוי והצמד אותו לצנתר. יש לשטוף את הכבד בתמיסה זו תוך הימנעות מכניסת אוויר למערכת.
13. קשרו את התפר סביב הווריד הנבוב התחתון מתחת לכליה. זה יאפשר לכבד לחדור רטרו.
14. חותכים את ה-IVC מתחת לתפר כדי לאפשר לבעל החיים לדמם החוצה.
    הערה: שלב זה חייב להתבצע במהירות כדי למנוע גודש של הכבד.
15. אבטחו את צנתר ה-IV עם תפר ה-PV.
16. לאחר ההחדרה, חותכים את הקיבה, המעיים, הטחול ושאר הפתחים המחוברים לכבד.
17. חותכים את הסרעפת ואת כלי הדם העיקריים מחלל בית החזה. מוציאים את הכבד מבעל החיים ומניחים אותו על מגש הזלוף.
18. יש להסיר בזהירות את קו ה- IV ולחבר את תמיסת הקולגןאז בתא המשחזר.
    הערה: שלבים 3.16-3.18 צריכים להיעשות תוך 5 דקות, כך שהכבד לא יוחדר זמן רב מדי עם Buffer A. היזהר מאוד לא לאפשר בועות אוויר לתוך הכבד.
19. אפשרו לכבד לחלחל עד שהקפסולה הופכת מנומרת ונראית מטושטשת (10-15 דקות או יותר, המחזור משתנה בהתאם למגוון ההמון של הקולגנאז).
20. בזמן שהכבד נמצא בזלוף, יש לוודא שבעל החיים מת לפני השלכתו בשקית נמק.
21. לאחר העיכול, מוציאים את הכבד מהתא ומניחים אותו בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ עם כ-20 מ"ל של מדיום הנשרים המהונדסים (DMEM) של דולבקו ללא סרום.
22. לקטוף בעדינות את הכבד עם כמה קצוות פיפטה ולהשליך את עץ המרה.
23. מסננים את תרחיף הכבד דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
24. צנטריפוגה תרחיף התא ב 50 x g במשך 2 דקות ב- RT. לאסוף את supernatant המכיל תאים כבדים שאינם פרנצ'ימליים.
    הערה: הפטוציטים מואצים בכדור, אשר ניתן לטהר עוד יותר באמצעות צנטריפוגה גרדיאנט כפי שתואר קודם לכן¹⁵.

4. הפרדת תאי כבד לא-פרנצ'ימליים וטיהור LSECs

הערה: טהרו את ה-CD146⁺ LSECs באמצעות החרוזים האימונומגנטיים, בהתאם להוראות היצרן.

1. צנטריפוגה את supernatant ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
2. אסוף את גלולת התא ובצע החייאה ב- 1 מ"ל של מאגר בידוד (טבלה 1), קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
3. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant לחלוטין.
4. בצעו החייאה של הכדור עם 90 μL של מאגר בידוד לכל 10⁷ תאים בסך הכל.
5. הוסף 10 μL של חרוזים מגנטיים CD146 לכל 10⁷ תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. כדי לשטוף את התאים, להוסיף 1-2 מ"ל של מאגר בידוד לכל 10⁷ תאים, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשאוף את supernatant לחלוטין.
7. יש לבצע שימוש חוזר של עד 10⁹ תאים ב-500 μL של מאגר בידוד (טבלה 1).
   הערה: עבור מספרי תאים גבוהים יותר, הגדל את נפח המאגר בהתאם.
8. הכן את עמוד ההפרדה, שטפו אותו עם 3 מ"ל של חיץ בידוד.
9. החל את תרחיף התא על העמודה הערומה עם מסנני קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר.
10. שטפו את העמודה עם 3 מ"ל של מאגר בידוד 3 פעמים.
    הערה: בעת שטיפת העמודה, יש להוסיף את מאגר הבידוד ברגע שמאגר העמודות מתרוקן.
11. הסר את העמודה מהמפריד והנח אותה על צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. פיפט 5 מ"ל של חיץ בידוד על העמודה.
12. כדי לשחזר את החרוזים המגנטיים המסומנים בתאים, דחפו בחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים.
13. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. LSECs מוכנים לבדיקה מיקרוסקופית וניתוח במורד הזרם.

5. LSECs אימונופנוטיפ והערכת טוהר על ידי ציטומטריית זרימה

1. קבע את מספרי התאים של LSECs מבודדים באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
2. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g במשך 5 דקות, לשאוף את supernatant לחלוטין.
3. קח 1 x 10⁶ תאים / צינור ו resuspend עם 90 μL של מאגר צביעה (טבלה 1).
4. הוסף 10 μL / שפופרת של בלוק FcR עכבר ו 1 μL של צבע כדאיות, דגירה ב 4 ° C למשך 10 דקות.
5. הכתימו את התאים בשילוב של נוגדני CD45, CD146 ו-stabilin-2 המדוללים בשעה 1:50 עם מאגר צביעה. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
6. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של חיץ צביעה וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשאוף את supernatant לחלוטין.
7. בצעו החייאה של התאים עם 300 μL של מאגר צביעה והעבירו דרך ציטומטר הזרימה.

6. תרבות ובחינה של LSECs

1. זרע 1 x 10⁶ תאים/באר בצלחת של 6 בארות ותרביב אותו עם מדיום גדילה של תאי אנדותל המורכב מ-5% סרום בקר עוברי (FBS), תוסף גדילה של תאי אנדותל 1% ותמיסת פרימוצין של 1%.
2. בחנו את ה-LSECs המבודדים על ידי מיקרוסקופיית אור. רכוש תמונות בשדה בהיר עם הגדלה של פי 10.

7. מורפולוגיה של LSECs ובדיקת fenestrae על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

1. ציפוי מראש של תרבית התאים (גודל נקבובית של 3 מיקרומטר) בתמיסת קולגן.
2. LSECs מבודדים בתרבית (120,000 תאים) על התוספת עם מדיום גדילה של תאי אנדותל בצלחת של 24 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס חמה ולחה. אפשרו לתאים להתיישב ולהיצמד למשך שעתיים.
3. לקיבוע תאים, הוסיפו נפח שווה ערך של 37 מעלות צלזיוס המקבע של טראמפ לתקשורת תרביות התאים.
4. לאחר הדגירה במשך 10 דקות, החליפו 50% מהקיבעון המדולל של טראמפ בקיבעון של טראמפ.
5. לתקן את התאים ב-Trump fixative במשך 2 שעות, ואז לדגום במשך שעה אחת ב-1% אוסמיום טטרוקסידים.
6. המשך עם התייבשות הדגימות, ייבוש בהתקן ייבוש נקודה קריטית, הרכבה, ציפוי ניתור ובדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

תוצאות

שרטוטים ניסיוניים והתקנת ציוד:
בפרוטוקול זה, כבד העכברים עוכל באמצעות מעגל פרפוזיה סגור, ואז תאים לא-פרנצ'ימליים והפטוציטים הופרדו על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב-50 x g במשך 2 דקות. LSECs ראשוניים בודדו באמצעות בחירת חרוזים מגנטיים CD146 מהשבר הלא-פרנצ'ימלי. הסכימות הניסיוניות מ?...

Discussion

בכתב היד הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבידוד LSEC מכבד עכברים המורכב מפרפוזיית קולגןאז דו-שלבית ומיון תאים המופעלים על ידי מגנטית (MACS) לאחר מכן. פרוטוקול זה מורכב משלושת השלבים הבאים: (1) פרפוזיה דרך ה-PV עם מאגר נטול סידן ואחריו מאגר המכיל קולגן כדי להשיג פיזור תאי כבד; (2) הרחקה של הפטוציטים עם צנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07