Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Zusammenfassung

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

Lebersinusförmige Endothelzellen (LSECs) sind spezialisierte Endothelzellen, die sich an der Schnittstelle zwischen dem Kreislauf und dem Leberparenchym befinden. LSECs haben eine ausgeprägte Morphologie, die durch das Vorhandensein von Fenestrae und das Fehlen einer Basalmembran gekennzeichnet ist. LSECs spielen eine wesentliche Rolle bei vielen pathologischen Erkrankungen der Leber, einschließlich metabolischer Dysregulation, Entzündungen, Fibrose, Angiogenese und Karzinogenese. Über die Isolierung und Charakterisierung der LSECs wurde jedoch wenig veröffentlicht. Hier diskutiert dieses Protokoll die Isolierung von LSEC von gesunden und nichtalkoholischen Fettlebererkrankungen (NAFLD) Mäusen. Das Protokoll basiert auf der Kollagenase-Perfusion der Mausleber und der positiven Auswahl von nichtparenchymalen Zellen zur Reinigung von LSECs. Diese Studie charakterisiert LSECs unter Verwendung spezifischer Marker durch Durchflusszytometrie und identifiziert die charakteristischen phänotypischen Merkmale durch Rasterelektronenmikroskopie. LSECs, die nach diesem Protokoll isoliert wurden, können für funktionelle Studien, einschließlich Adhäsions- und Permeabilitätsassays, sowie für nachgelagerte Studien für einen bestimmten Signalweg von Interesse verwendet werden. Darüber hinaus können diese LSECs gepoolt oder einzeln verwendet werden, was unter anderem die Generierung von Multi-Omics-Daten ermöglicht, einschließlich RNA-seq-Bulk oder Einzelzell-, Proteomik- oder Phospho-Proteomik und Assay für Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung von Sequenzierung (ATAC-seq). Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die die Kommunikation von LSECs mit anderen Leberzellen in Gesundheit und Krankheit untersuchen und ein tiefes Verständnis der Rolle von LSECs bei den pathogenen Mechanismen akuter und chronischer Leberschäden ermöglichen.

Einleitung

Lebersinusförmige Endothelzellen (LSECs) säumen die hepatischen Sinuswände und sind die am häufigsten vorkommenden nichtparenchymalen Zellen in der Leber¹. LSECs unterscheiden sich von anderen kapillaren Endothelzellen an anderer Stelle im Körper durch das Vorhandensein von Fenestrae und das Fehlen einer klassischen Basalmembran oder eines Zwerchfells ^2,3. Daher besitzen die LSECs charakteristische phänotypische und strukturelle Eigenschaften, die ihre Permeabilität und endozytäre Fähigkeit zur Beseitigung einer Vielzahl von zirkulierenden Makromolekülen, einschließlich Lipiden und Lipoproteinen, verbessern. LSECs spielen eine zentrale Rolle im Crosstalk zwischen parenchymalen und nichtparenchymalen Zellen, wie Sternzellen und Immunzellen. LSECs sind der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Leberhomöostase, indem sie die Sternzellen und Kupffer-Zellen in einem Ruhezustand^{halten 4}. LSECs modulieren die Zusammensetzung der Populationen hepatischer Immunzellen, indem sie Adhäsion und transendotheliale Migration von zirkulierenden Leukozyten vermitteln ^5,6. Während der akuten und chronischen Leberschädigung⁷, einschließlich Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI)⁸, nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH)⁹ und hepatozellulärem Karzinom (HCC), unterliegen LSECs phänotypischen Veränderungen, die als Kapillarisierung bekannt sind und durch Defenestration und Bildung der Basalmembran¹⁰ gekennzeichnet sind. Diese phänotypischen Veränderungen in LSECs sind mit LSEC-Dysfunktion und dem Erwerb prothrombotischer, proinflammatorischer und profibrogener Eigenschaften verbunden.

Mehrere Methoden zur Isolierung von LSECs aus der Mausleber wurden entwickelt¹¹. Einige Techniken hängen von der Trennung von nichtparenchymalen und parenchymalen Zellen ab, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die LSECs von nichtparenchymalen Fraktionen zu reinigen. Die Einschränkung dieser Methode ist das Vorhandensein von kontaminierenden Makrophagen in den letzten Schritten der LSEC-Isolierung, die die Reinheit der isolierten GVECs^{beeinflussen könnten 12}. Dieses Protokoll basiert auf der Kollagenase-Perfusion der Mausleber und der positiven Auswahl von nichtparenchymalen Zellen durch ^{CD146 + -}Magnetkügelchen, um LSECs zu reinigen. Mit dieser Methode isolierte LSECs zeigen eine hohe Reinheit und konservierte Morphologie und Lebensfähigkeit. Diese LSECs sind optimal für funktionelle Studien, einschließlich Permeabilitäts- und Adhäsionsassays, sowie für nachgelagerte Studien für Pfade von Interesse. Mit dem wachsenden Interesse an der Generierung großer Datensätze sowohl in der klinischen Forschung als auch in der Entdeckungswissenschaft können diese hochwertigen LSECs, die sowohl aus gesunden als auch aus erkrankten Lebern mit nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH) oder anderen Erkrankungen isoliert wurden, gepoolt oder einzeln verwendet werden, was die Generierung von Multi-Omics-Daten und den Vergleich zwischen Gesundheit und Krankheit ermöglicht^13,14 . Darüber hinaus können die isolierten LSECs verwendet werden, um sowohl zweidimensionale als auch dreidimensionale In-vitro-Modelle wie Organoide zu entwickeln, um den aktivierten Signalweg in LSECs und ihre interzelluläre Kommunikation mit anderen Leberzellen unter verschiedenen schädlichen Reizen und als Reaktion auf verschiedene therapeutische Interventionen zu entschlüsseln.

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Protokoll

Tierprotokolle wurden durchgeführt, wie vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Mayo Clinic genehmigt. Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Die Mäuse wurden in einer temperaturgesteuerten 12:12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklusanlage mit freiem Zugang zur Ernährung untergebracht.

1. Zubereitung einer kollagenbeschichteten Kulturschale oder eines Tellers

1. Um 50 ml 0,02_mol/lEssigsäure herzustellen, fügen Sie 0,6 ml Eisessigsäure zu 49,4 ml H2 O hinzu.
2. 50 μg/ml Kollagen Typ I in 0,02 mol/L Essigsäure herstellen. Die Verdünnung hängt von der Konzentration der Partie ab.
3. 10 cm Kulturgeschirr mit 3 ml Kollagenlösung bestreichen. Bei Raumtemperatur (RT) für 1 h inkubieren.
   HINWEIS: Wenn Sie eine andere Schale oder Platte für die Kultur verwenden, muss das Volumen der Beschichtungslösung basierend auf der Kulturfläche angepasst werden, im Allgemeinen 6-10 μg / cm² verwenden.
4. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der beschichteten Oberfläche und waschen Sie sie 3 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Lassen Sie das Geschirr an der Luft trocknen.
5. Wenn die Kollagenlösung nicht steril ist, sterilisieren Sie das kollagenbeschichtete Geschirr unter Einwirkung von ultraviolettem (UV) Licht für 10 min in einer sterilen Gewebekulturhaube.

2. Geräteeinrichtung

1. Die beheizte und befeuchtete zirkulierende Perfusionsvorrichtung ist wie in Abbildung 1B dargestellt aufzustellen.
2. Spülen Sie das Perfusionssystem mit 10% Bleichmittel für 5 Minuten ab, gefolgt von sterilem Wasser für weitere 10 Minuten.
3. Lassen Sie die Spülflüssigkeit so weit wie möglich abtropfen, bevor Sie die Kollagenaselösung durchbluten.
4. Kollagenaselösung durch das Perfusionssystem infundiert (wie in Abbildung 1B gezeigt), um sie bei 37 °C vorzuwärmen. Stellen Sie die Pumpenrate auf Geschwindigkeit 1 ein, wie auf dem Einstellrad angezeigt (entspricht 40 ml/min).
5. Halten Sie diese Geschwindigkeit während des gesamten Vorgangs gleich. Wiederverwendung der Kollagenaselösung, die während des Tages der LSEC-Isolierung in einem geschlossenen Kreislauf ausgeführt wird.
   HINWEIS: Die Pumpendrehzahl ist auf 1 festgelegt, um mechanischen Druck zu vermeiden, der den biologischen Zustand der LSECs stören könnte.

3. Chirurgischer Eingriff

1. Wiegen Sie die Maus.
2. Injizieren Sie 90 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin intraperitoneal (IP).
3. Sobald die Maus nicht auf schmerzhafte Reize reagiert, befestigen Sie die Maus an der Operationsoberfläche, wie in Abbildung 1B dargestellt.
4. Besprühen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt von ~ 5 cm Länge, beginnend mit dem unteren Teil des Abdomens bis zum Xiphoid-Prozess.
5. Als nächstes machen Sie zwei seitliche Schnitte mit einer kleinen Irisschere auf jeder Seite des Abdomens, um die Bauchorgane vollständig freizulegen.
6. Legen Sie die Hülle des intravenösen (IV) Katheters unter den Rücken des Tieres, um den Bauch anzuheben und auszugleichen.
7. Ziehen Sie mit einer normalen gebogenen Verbandszange den Darm und den Magen vorsichtig links vom Tier ab.
8. Platzieren Sie eine 5-0 chirurgische Naht unter der unteren Hohlvene (IVC) direkt unter der freiliegenden linken Niere. Binden Sie eine lose Kupplung in die Naht.
9. Platzieren Sie eine weitere 5-0-chirurgische Naht um die Leberpfortader (PV) direkt über dem Milzvenenverzweigungspunkt von der Leber-PV. Binden Sie eine lose Kupplung in die Naht.
10. Verwenden Sie die PV-Naht als Spannung, und führen Sie den 20 G IV-Katheter in den Leber-PV 1 cm tiefer ein, wo er sich nach rechts und links in die Leber-PV verzweigt.
11. Schieben Sie den Katheter die Vene hinauf, aber halten Sie ihn unter dem verzweigten Bereich. Lassen Sie das Blut den Katheter hinunterwandern, bis es heraustropft.
12. Wenn ein Teil des Puffers A (Tabelle 1) in einer intravenösen (IV) Flasche über dem Operationsbereich positioniert ist, verwenden Sie eine IV-Leitung und befestigen Sie sie am Katheter. Spülen Sie die Leber mit dieser Lösung, während Sie den Eintritt von Luft in das System vermeiden.
13. Binden Sie die Naht um die untere Hohlvene unterhalb der Niere ab. Dies ermöglicht es der Leber, retro perfusionieren.
14. Schneiden Sie die IVC unter die Naht, damit das Tier ausbluten kann.
    HINWEIS: Dieser Schritt muss schnell durchgeführt werden, um eine Verstopfung der Leber zu vermeiden.
15. Sichern Sie den IV-Katheter mit der PV-Naht.
16. Schneiden Sie nach dem Durchsickern den Magen, den Darm, die Milz und andere an der Leber befestigte Eingeweide ab.
17. Schneiden Sie das Zwerchfell und die Hauptgefäße aus der Brusthöhle ab. Entfernen Sie die Leber vom Tier und legen Sie sie auf die Perfusionsschale.
18. Entfernen Sie vorsichtig die IV-Leitung und schließen Sie die Kollagenaselösung in der Umwälzkammer an.
    HINWEIS: Die Schritte 3.16-3.18 müssen innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden, damit die Leber mit Puffer A nicht zu lange durchblutet wird.
19. Lassen Sie die Leber perfusionieren, bis die Kapsel fleckig wird und matschig erscheint (10-15 min oder mehr, die Periode variiert je nach den verschiedenen Mengen an Kollagenase).
20. Während die Leber in Perfusion ist, stellen Sie sicher, dass das Tier verstorben ist, bevor Sie es in einem Nekropsiebeutel entsorgen.
21. Nach der Verdauung die Leber aus der Kammer nehmen und in eine 10 cm große Petrischale mit etwa 20 ml serumfreiem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) geben.
22. Nehmen Sie die Leber vorsichtig mit ein paar Pipettenspitzen auseinander und entsorgen Sie den Gallenbaum.
23. Filtern Sie die Lebersuspension durch ein 70 μm Zellsieb in einen 50 ml konischen Schlauch.
24. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 x g für 2 min bei RT. Sammeln Sie den Überstand, der nichtparenchymale Leberzellen enthält.
    HINWEIS: Hepatozyten werden im Pellet ausgefällt, das durch Gradientenzentrifugation weiter gereinigt werden kann, wie zuvor beschrieben¹⁵.

4. Trennung von nichtparenchymalen Leberzellen und LSEC-Reinigung

HINWEIS: Reinigen Sie die CD146⁺ LSECs mit den immunmagnetischen Kügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers.

1. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
2. Sammeln Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie es in 1 ml Isolationspuffer (Tabelle 1), bestimmen Sie die Zellnummer mithilfe eines automatischen Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, saugen Sie den Überstand vollständig ab.
4. Resuspendiert das Pellet mit 90 μL Isolationspuffer pro 10⁷ Gesamtzellen.
5. Fügen Sie 10 μL CD146-Magnetkügelchen pro 10⁷ Gesamtzellen hinzu. Gut mischen und 15 min bei 4 °C inkubieren.
6. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 1-2 ml Isolationspuffer pro 10⁷ Zellen hinzu, zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min und saugen Sie dann den Überstand vollständig ab.
7. Resuspendieren Sie bis zu 10⁹ Zellen in 500 μL Isolationspuffer (Tabelle 1).
   HINWEIS: Bei höheren Zellzahlen sollten Sie das Puffervolumen entsprechend erhöhen.
8. Bereiten Sie die Trennsäule vor und spülen Sie sie mit 3 ml Isolationspuffer ab.
9. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, die mit 70-μm-Vorabscheidefiltern gestapelt ist.
10. Waschen Sie die Säule 3 Mal mit dem 3 ml Isolationspuffer.
    HINWEIS: Beim Waschen der Spalte sollte der Isolationspuffer hinzugefügt werden, sobald das Säulenreservoir leer ist.
11. Entfernen Sie die Säule aus dem Trennzeichen und legen Sie sie auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Pipette 5 ml Isolationspuffer auf die Säule.
12. Um die mit Magnetperlen beschrifteten Zellen wiederherzustellen, drücken Sie den Kolben fest in die Säule, um die Zellen auszuspülen.
13. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. LSECs sind bereit für mikroskopische Untersuchungen und nachgelagerte Analysen.

5. Immunphänotypisierung von LSECs und Reinheitsbewertung durch Durchflusszytometrie

1. Ermitteln Sie die Zellnummern isolierter LSECs mithilfe eines automatischen Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min, saugen Sie den Überstand vollständig ab.
3. Nehmen Sie 1 x 10⁶ Zellen/Röhrchen und resuspendieren Sie mit 90 μL Färbepuffer (Tabelle 1).
4. 10 μL/Röhrchen Maus-FcR-Block und 1 μL Viability-Farbstoff zugeben, bei 4 °C für 10 min inkubieren.
5. Färben Sie die Zellen mit einer Kombination aus CD45-, CD146- und Stabilin-2-Antikörpern, die bei 1:50 mit Färbepuffer verdünnt wurden. 20 min bei 4 °C inkubieren.
6. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml Färbepuffer und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min, dann saugen Sie den Überstand vollständig ab.
7. Resuspendieren Sie die Zellen mit 300 μL Färbepuffer und laufen Sie durch das Durchflusszytometer.

6. Kultur und Prüfung der GVEC

1. Samen Sie 1 x 10 6 Zellen / Well in einer 6-Well-Platte und kultivieren Sie es mit Endothelzellen-Wachstumsmedium, bestehend aus 5% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Endothelzellen-Wachstumsergänzung und 1% Primocin-Lösung.
2. Untersuchen Sie die isolierten LSECs mittels Lichtmikroskopie. Erfassen Sie Hellfeldbilder mit einer 10-fachen Vergrößerung.

7. LSEC-Morphologie und Fenestrae-Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie

1. Beschichten Sie die Zellkultureinsätze (3 μm Porengröße) mit Kollagenlösung vor.
2. Kulturisolierte LSECs (120.000 Zellen) auf dem Insert mit Endothelzellen-Wachstumsmedium in einer 24-Well-Platte bei 37 °C warmer und befeuchteter Atmosphäre. Lassen Sie die Zellen sich beruhigen und für 2 Stunden haften.
3. Für die Zellfixierung fügen Sie ein äquivalentes Volumen des bei 37 ° C vorgewärmten Trump-Fixiermittels zu den Zellkulturmedien hinzu.
4. Ersetzen Sie nach der Inkubation für 10 min 50% verdünntes Trump-Fixiermittel durch unverdünntes Trump-Fixiermittel.
5. Fixieren Sie die Zellen in Trump-Fixiermittel für 2 h und inkubieren Sie dann für 1 h in 1% Osmium-Tetroxiden.
6. Fahren Sie mit der Dehydratisierung der Proben, der Trocknung in einem kritischen Punkttrocknungsgerät, der Montage, der Sputterbeschichtung und der Untersuchung mit einem Rasterelektronenmikroskop fort.

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Ergebnisse

Experimentelle Schaltpläne und Aufbau der Ausrüstung:
In diesem Protokoll wurde die Mausleber mit einem geschlossenen Perfusionskreislauf verdaut, dann wurden nichtparenchymale Zellen und Hepatozyten durch langsame Zentrifugation bei 50 x g für 2 min getrennt. Primäre LSECs wurden unter Verwendung der Auswahl von CD146-Magnetperlen aus der nichtparenchymalen Fraktion isoliert. Die experimentellen Schaltpläne sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Kanüle wurd...

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Diskussion

Im aktuellen Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur LSEC-Isolierung aus der Mausleber, bestehend aus zweistufiger Kollagenase-Perfusion und anschließender magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS). Dieses Protokoll besteht aus den folgenden drei Schritten: (1) Perfusion durch die PV mit einem kalziumfreien Puffer, gefolgt von einem kollagenasehaltigen Puffer, um eine Leberzelldispersion zu erreichen; (2) Ausschluss von Hepatozyten mit langsamer Zentrifugation; und (3) MACS-basierte positive Selektion von LSECs ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07