Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Riepilogo

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Abstract

Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono cellule endoteliali specializzate situate all'interfaccia tra la circolazione e il parenchima epatico. Le LSEC hanno una morfologia distinta caratterizzata dalla presenza di fenestrae e dall'assenza di membrana basale. Le LSEC svolgono un ruolo essenziale in molti disturbi patologici del fegato, tra cui la disregolazione metabolica, l'infiammazione, la fibrosi, l'angiogenesi e la carcinogenesi. Tuttavia, poco è stato pubblicato sull'isolamento e la caratterizzazione delle LSEC. Qui, questo protocollo discute l'isolamento di LSEC da topi sani e non alcolici di steatosi epatica (NAFLD). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di perline magnetiche di cellule non parenchimali per purificare le LSECs. Questo studio caratterizza le LSEC utilizzando marcatori specifici mediante citometria a flusso e identifica le caratteristiche fenotipiche caratteristiche mediante microscopia elettronica a scansione. Le LSEC isolate seguendo questo protocollo possono essere utilizzate per studi funzionali, compresi saggi di adesione e permeabilità, nonché studi a valle per una particolare via di interesse. Inoltre, questi LSEC possono essere raggruppati o utilizzati singolarmente, consentendo la generazione di dati multi-omica tra cui RNA-seq bulk o singola cellula, proteomica o fosfo-proteomica e Assay for Transposase-Accessible Chromatin utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), tra gli altri. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che studiano la comunicazione delle LSEC con altre cellule epatiche in salute e malattia e consentirà una comprensione approfondita del ruolo delle LSEC nei meccanismi patogenetici del danno epatico acuto e cronico.

Introduzione

Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) rivestono le pareti sinusoidi epatiche e sono le cellule non parenchimali più abbondanti nel fegato¹. Le LSEC si distinguono dalle altre cellule endoteliali capillari in altre parti del corpo per la presenza di fenestrae e la mancanza di una membrana basale classica o di un diaframma ^2,3. Quindi, le LSEC possiedono caratteristiche fenotipiche e strutturali distintive che migliorano la loro permeabilità e capacità endocitica di eliminare una varietà di macromolecole circolanti, inclusi lipidi e lipoproteine. Le LSEC svolgono un ruolo fondamentale nella diafonia tra cellule parenchimali e non parenchimali, come le cellule stellate e le cellule immunitarie. Le LSEC sono fondamentali per mantenere l'omeostasi epatica mantenendo le cellule stellate e le cellule di Kupffer in uno stato quiescente⁴. Le LSECs modulano la composizione delle popolazioni di cellule immunitarie epatiche mediando l'adesione e la migrazione trans-endoteliale dei leucociti circolanti ^5,6. Durante il danno^epatico acuto e cronico 7, tra cui il danno da ischemia-riperfusione (IRI)⁸, la steatoepatite non alcolica (NASH)⁹ e il carcinoma epatocellulare (HCC), le LSECs subiscono cambiamenti fenotipici noti come capillarizzazione caratterizzati da defenestrazione e formazione della membrana basale¹⁰. Questi cambiamenti fenotipici nelle LSEC sono associati alla disfunzione delle LSECs e all'acquisizione di proprietà protrombotiche, proinfiammatorie e profibrogeniche.

Sono stati sviluppati diversi metodi per l'isolamento delle LSEC dal fegato di topo¹¹. Alcune tecniche dipendono dalla separazione delle cellule non parenchimali e parenchimali seguita dalla centrifugazione a gradiente di densità per purificare le LSEC dalle frazioni non parenchimali. Il limite di questo metodo è la presenza di macrofagi contaminanti nelle fasi finali dell'isolamento delle LSECs, che potrebbero influenzare la purezza delle LSECs^{isolate 12}. Questo protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di cellule non parenchimali CD146⁺ magnetiche per purificare le LSECs. Le LSEC isolate con questo metodo mostrano un'elevata purezza e morfologia e vitalità preservate. Questi LSEC sono ottimali per studi funzionali, compresi i test di permeabilità e adesione, nonché studi a valle per i percorsi di interesse. Inoltre, con il crescente interesse nel generare grandi set di dati sia nella ricerca clinica che nella scienza della scoperta, questi LSEC di alta qualità isolati da fegati sani e malati con steatoepatite non alcolica (NASH) o altre condizioni possono essere raggruppati o utilizzati individualmente, consentendo la generazione di dati multi-omici e il confronto tra salute e malattia^13,14 . Inoltre, le LSEC isolate possono essere impiegate per sviluppare modelli in vitro bidimensionali e tridimensionali come gli organoidi per decifrare la via di segnalazione attivata nelle LSEC e la loro comunicazione intercellulare con altre cellule epatiche sotto diversi stimoli nocivi e in risposta a vari interventi terapeutici.

Protocollo

I protocolli sugli animali sono stati condotti come approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Mayo Clinic. I topi maschi C57BL / 6J di otto settimane sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. I topi sono stati alloggiati in una struttura a temperatura controllata 12: 12-h di ciclo chiaro-buio con libero accesso alla dieta.

1. Preparazione del piatto o del piatto di coltura rivestito di collagene

1. Per produrre 50 mL di acido acetico 0,02 mol/L, aggiungere 0,6 mL di acido acetico glaciale a 49,4 mL di H₂O.
2. Produrre 50 μg/mL di collagene di tipo I in acido acetico 0,02 mol/L. La diluizione dipende dalla concentrazione del lotto.
3. Rivestire piatti di coltura di 10 cm con 3 ml di soluzione di collagene. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
   NOTA: quando si utilizza un piatto o una piastra diversa per la coltura, il volume della soluzione di rivestimento deve essere regolato in base all'area di coltura, generalmente utilizzare 6-10 μg / cm².
4. Rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie rivestita e lavare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 3 volte. Lasciare asciugare i piatti all'aria.
5. Se la soluzione di collagene non è sterile, sterilizzare i piatti rivestiti di collagene mediante esposizione alla luce ultravioletta (UV) per 10 minuti in una cappa di coltura di tessuto sterile.

2. Configurazione dell'apparecchiatura

1. Impostare l'apparecchio di perfusione a ricircolo riscaldato e umidificato come mostrato nella Figura 1B.
2. Risciacquare il sistema di perfusione con candeggina al 10% per 5 minuti seguita da acqua sterile per altri 10 minuti.
3. Scolare il liquido di risciacquo il più possibile prima di perfondere la soluzione di collagenasi.
4. Infondere la soluzione di collagenasi attraverso il sistema di perfusione (come mostrato nella Figura 1B) per preriscaldarla a 37 °C. Impostare la velocità della pompa alla velocità 1 come indicato sulla ghiera di controllo della velocità (pari a 40 ml/min).
5. Mantieni questa velocità la stessa durante l'intera procedura. Riutilizzare la soluzione di collagenasi eseguita in un circuito chiuso durante il giorno dell'isolamento LSEC.
   NOTA: La velocità della pompa è fissata a 1 per evitare pressioni meccaniche che potrebbero perturbare le condizioni biologiche degli LSEC.

3. Procedura chirurgica

1. Pesare il mouse.
2. Iniettare 90 mg/kg di peso corporeo di ketamina e 10 mg/kg di peso corporeo di xilazina per via intraperitoneale (IP).
3. Una volta che il topo non è reattivo agli stimoli dolorosi, fissare il mouse alla superficie chirurgica, come mostrato nella Figura 1B.
4. Spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo. Usando le forbici chirurgiche, fai un'incisione di ~ 5 cm di lunghezza partendo dalla parte inferiore dell'addome fino al processo xifoide.
5. Quindi, effettuare due tagli laterali utilizzando piccole forbici dell'iride su ciascun lato dell'addome per esporre completamente gli organi addominali.
6. Posizionare la guaina del catetere endovenoso (IV) sotto la schiena dell'animale per sollevare e livellare l'addome.
7. Usando una normale pinza da medicazione curva, tirare delicatamente l'intestino e lo stomaco a sinistra dell'animale.
8. Posizionare una sutura chirurgica 5-0 sotto la vena cava inferiore (IVC) appena sotto il rene sinistro esposto. Legare un gancio sciolto nella sutura.
9. Posizionare un'altra sutura chirurgica 5-0 attorno alla vena porta epatica (PV) appena sopra il punto di ramificazione della vena splenica dal PV epatico. Legare un gancio sciolto nella sutura.
10. Utilizzando la sutura PV come tensione, inserire il catetere 20 G IV nel PV epatico 1 cm sotto dove si ramifica a destra e sinistra PV epatico.
11. Far scorrere il catetere sulla vena ma tenerlo sotto l'area di ramificazione. Lasciare che il sangue viaggi lungo il catetere fino a quando non inizia a gocciolare.
12. Con parte del tampone A (Tabella 1) in un flacone per via endovenosa (IV) posizionato sopra l'area chirurgica, utilizzare una linea IV e collegarla al catetere. Lavare il fegato con questa soluzione evitando l'ingresso di aria nel sistema.
13. Legare la sutura intorno alla vena cava inferiore sotto il rene. Ciò consentirà al fegato di retroperfondersi.
14. Tagliare l'IVC sotto la sutura per consentire all'animale di sanguinare.
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente per evitare la congestione del fegato.
15. Fissare il catetere IV con la sutura fotovoltaica.
16. Una volta perfuso, tagliare via lo stomaco, l'intestino, la milza e altre interiora attaccate al fegato.
17. Tagliare via il diaframma e i vasi principali dalla cavità toracica. Rimuovere il fegato dall'animale e posizionarlo sul vassoio di perfusione.
18. Rimuovere con attenzione la linea IV e collegare la soluzione di collagenasi nella camera di ricircolo.
    NOTA: I passaggi 3.16-3.18 devono essere eseguiti entro 5 minuti, quindi il fegato non sarà perfuso troppo a lungo con il tampone A. Fare molta attenzione a non consentire bolle d'aria nel fegato.
19. Lasciare che il fegato si perfonda fino a quando la capsula diventa screziata e appare molle (10-15 minuti o più, il periodo varia a seconda dei diversi lotti di collagenasi).
20. Mentre il fegato è in perfusione, assicurarsi che l'animale sia deceduto prima di smaltirlo in una sacca per necroscopia.
21. Una volta digerito, rimuovere il fegato dalla camera e metterlo in una capsula di Petri di 10 cm con circa 20 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero.
22. Raccogliere delicatamente il fegato con un paio di punte di pipetta e scartare l'albero biliare.
23. Filtrare la sospensione epatica attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo conico da 50 ml.
24. Centrifugare la sospensione cellulare a 50 x g per 2 minuti a RT. Raccogliere il surnatante contenente cellule epatiche non parenchimali.
    NOTA: Gli epatociti vengono precipitati nel pellet, che può essere ulteriormente purificato utilizzando la centrifugazione a gradiente come descritto in precedenza¹⁵.

4. Separazione delle cellule epatiche non parenchimali e purificazione delle LSEC

NOTA: Purificare i CD146⁺ LSEC utilizzando le perle immunomagnetiche, seguendo le istruzioni del produttore.

1. Centrifugare il surnatante a 300 x g per 5 min a 4 °C.
2. Raccogliere il pellet di cella e risospesciare in 1 mL di tampone di isolamento (Tabella 1), determinare il numero di cella utilizzando un contatore automatico di celle seguendo le istruzioni del produttore.
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, aspirare completamente il surnatante.
4. Risospendare il pellet con 90 μL di tampone di isolamento per 10⁷ celle totali.
5. Aggiungere 10 μL di perline magnetiche CD146 per 10⁷ celle totali. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.
6. Per lavare le cellule, aggiungere 1-2 ml di tampone di isolamento per 10⁷ celle, centrifugare a 300 x g per 10 minuti, quindi aspirare completamente il surnatante.
7. Risospendare fino a 10⁹ celle in 500 μL di tampone di isolamento (Tabella 1).
   NOTA: per numeri di cella più elevati, aumentare di conseguenza il volume del buffer.
8. Preparare la colonna di separazione, risciacquarla con 3 ml di tampone di isolamento.
9. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna impilata con filtri di pre-separazione da 70 μm.
10. Lavare la colonna con 3 mL di tampone di isolamento 3 volte.
    NOTA: durante il lavaggio della colonna, il buffer di isolamento deve essere aggiunto non appena il serbatoio della colonna è vuoto.
11. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo centrifugo da 15 ml. Pipetta 5 mL di buffer di isolamento sulla colonna.
12. Per recuperare le celle etichettate con perline magnetiche, spingere con decisione lo stantuffo nella colonna per scovare le celle.
13. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Le LSEC sono pronte per l'esame microscopico e l'analisi a valle.

5. Immunofenotipizzazione delle LSEC e valutazione della purezza mediante citometria a flusso

1. Determinare il numero di celle di LSEC isolati utilizzando un contatore di celle automatico seguendo le istruzioni del produttore.
2. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirare completamente il surnatante.
3. Prendere 1 x 10⁶ celle/tubo e risospesciare con 90 μL di tampone di colorazione (Tabella 1).
4. Aggiungere 10 μL/tubo di blocco FcR di topo e 1 μL di colorante di vitalità, incubare a 4 °C per 10 min.
5. Colorare le cellule con una combinazione di anticorpi CD45, CD146 e stabilina-2 diluiti a 1:50 con tampone di colorazione. Incubare a 4 °C per 20 min.
6. Lavare le cellule con 5 mL di tampone colorante e centrifugare a 300 x g per 10 minuti, quindi aspirare completamente il surnatante.
7. Risospese le cellule con 300 μL di tampone colorante e scorrere attraverso il citometro a flusso.

6. Cultura ed esame delle LSECs

1. Seminare 1 x 10⁶ cellule / pozzetto in una piastra a 6 pozzetti e coltivarlo con un mezzo di crescita delle cellule endoteliali costituito al 5% da siero bovino fetale (FBS), integratore di crescita delle cellule endoteliali all'1% e soluzione di primocina all'1%.
2. Esaminare le LSEC isolate al microscopio ottico. Acquisisci immagini in campo luminoso con un ingrandimento di 10x.

7. Morfologia LSECs ed esame delle fenestrae mediante microscopia elettronica a scansione

1. Pre-rivestire gli inserti di coltura cellulare (dimensione dei pori di 3 μm) con soluzione di collagene.
2. LSECs isolate in coltura (120.000 cellule) sull'inserto con mezzo di crescita delle cellule endoteliali in una piastra a 24 pozzetti a 37 °C in atmosfera calda e umidificata. Lasciare che le cellule si stabilizzino e aderiscano per 2 ore.
3. Per la fissazione cellulare, aggiungere un volume equivalente di fissativo di Trump preriscaldato a 37 ° C ai terreni di coltura cellulare.
4. Dopo l'incubazione per 10 minuti, sostituisci il fissativo di Trump diluito al 50% con il fissativo di Trump non diluito.
5. Fissare le cellule in fissativo di Trump per 2 ore, quindi incubare per 1 ora in tetrossidi di osmio all'1%.
6. Procedere con la disidratazione dei campioni, l'essiccazione in un dispositivo di essiccazione del punto critico, il montaggio, il rivestimento sputter e l'esame utilizzando un microscopio elettronico a scansione.

Risultati

Schemi sperimentali e messa a punto delle apparecchiature:
In questo protocollo, il fegato di topo è stato digerito utilizzando un circuito di perfusione chiuso, quindi le cellule non parenchimali e gli epatociti sono stati separati mediante centrifugazione a bassa velocità a 50 x g per 2 minuti. Le LSEC primarie sono state isolate utilizzando la selezione di perline magnetiche CD146 dalla frazione non parenchimale. Gli schemi sperimentali sono mostrati nella Figura 1A<...

Discussione

Nel manoscritto attuale, descriviamo un protocollo per l'isolamento LSEC dal fegato di topo costituito dalla perfusione di collagenasi in due fasi e dalla successiva selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo protocollo consiste nei seguenti tre passaggi: (1) Perfusione attraverso il PV con un tampone privo di calcio seguito da un tampone contenente collagenasi per ottenere la dispersione delle cellule epatiche; (2) Esclusione degli epatociti con centrifugazione a bassa velocità; e (3) selezione positiva...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07