マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

要約

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。

要約

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、循環と肝実質との界面に位置する特殊な内皮細胞である。LSECは、フェネストラの存在および基底膜の欠如を特徴とする明確な形態を有する。LSECは、代謝調節不全、炎症、線維症、血管新生、および発癌を含む肝臓における多くの病理学的障害において不可欠な役割を果たす。しかし、LSECの単離と特性評価についてはほとんど発表されていない。ここで、このプロトコルは、健常および非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)マウスの両方からのLSECの単離について論じる。プロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓および非実質細胞の磁気ビーズ陽性選択のコラゲナーゼ灌流に基づいている。本研究では、フローサイトメトリーによる特異的マーカーを用いてLSECを特徴付け、走査型電子顕微鏡により特徴的な表現型の特徴を同定する。このプロトコールに従って単離されたLSECは、接着および透過性アッセイを含む機能的研究、ならびに関心のある特定の経路についての下流研究に使用することができる。さらに、これらのLSECは個別にプールまたは使用することができ、RNA-seqバルクまたは単一細胞、プロテオミクスまたはホスホプロテオミクス、およびシーケンシング(ATAC-seq)を使用したトランスポザーゼアクセシブルクロマチンのアッセイなどのマルチオミクスデータ生成を可能にします。このプロトコルは、健康および疾患におけるLSECと他の肝細胞とのコミュニケーションを研究する研究者にとって有用であり、急性および慢性肝障害の病原性メカニズムにおけるLSECの役割の詳細な理解を可能にする。

概要

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、肝正弦波壁に並び、肝臓¹の中で最も豊富な非実質細胞である。LSECは、フェネストラの存在および古典的な基底膜または隔膜の欠如によって、体内の他の場所にある他の毛細血管内皮細胞と区別される^2,3。したがって、LSECは、脂質およびリポタンパク質を含む様々な循環巨大分子を排除する透過性およびエンドサイトーシス能力を高める独特の表現型および構造特性を有する。LSECは、星状細胞や免疫細胞などの実質細胞と非実質細胞のクロストークにおいて極めて重要な役割を果たしています。LSECは、星状細胞およびクッパー細胞を静止状態に保つことによって肝臓恒常性を維持する上で重要である⁴。LSECsは、循環白血球の接着および経内皮遊走を媒介することによって肝免疫細胞集団の組成を調節する^5,6。虚血再灌流傷害(IRI)⁸、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)⁹、および肝細胞癌(HCC)を含む急性および慢性肝障害⁷の間、LSECは毛細血管化として知られる表現型変化を受け、防御および基底膜¹⁰の形成を特徴とする。LSECにおけるこれらの表現型変化は、LSECの機能不全および血栓形成促進性、炎症促進性、および線維形成促進性の獲得と関連している。

マウス肝臓からLSECを単離するためのいくつかの方法が開発されている¹¹。いくつかの技術は、非実質細胞および実質細胞を分離し、続いて密度勾配遠心分離を行い、LSECを非実質画分から精製することに依存する。この方法の限界は、LSECs単離の最終ステップにおける汚染性マクロファージの存在であり、これは単離された^LSECs12の純度に影響を与え得る。このプロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓およびCD146⁺磁気ビーズ陽性の非実質細胞のコラゲナーゼ灌流に基づいている。この方法を用いて単離されたLSECは、高純度で保存された形態および生存率を示す。これらのLSECは、透過性および接着アッセイを含む機能研究、ならびに関心のある経路の下流研究に最適です。さらに、臨床研究と発見科学の両方で大きなデータセットを生成することへの関心の高まりに伴い、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または他の状態の健康な肝臓と病気の両方の肝臓から分離されたこれらの高品質のLSECを個別にプールまたは使用することができ、マルチオミクスデータ生成と健康と病気の比較が可能になります^13,14.さらに、単離されたLSECは、LSECにおける活性化されたシグナル伝達経路および異なる有害刺激下で、および様々な治療介入に応答して他の肝細胞との細胞間通信を解読するために、オルガノイドのような2次元および3次元のインビトロモデルを開発するために使用することができる。

プロトコル

動物のプロトコルは、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたとおりに実施されました。8週齢のC57BL/6J雄マウスをジャクソン研究所から購入した。マウスを、食事への自由なアクセスを有する温度制御された12:12-h明暗サイクル施設に飼育した。

コラーゲンコート培養皿またはプレートの調製

1. 50 mL の 0.02 mol/L 酢酸を作るには、49.4 mL の_H2O に 0.6 mL の氷酢酸を加えます。
2. 0.02 mol/L酢酸で50 μg/mLのコラーゲンタイプIを作る。希釈はロットの濃度に依存する。
3. 10cm培養皿を3mLのコラーゲン溶液でコーティングする。室温(RT)で1時間インキュベートする。
   注:培養に別の皿またはプレートを使用する場合、コーティング溶液の量は培養面積に基づいて調整する必要があり、通常は6〜10μg/^cm2を使用してください。
4. コーティングされた表面から余分な流体を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。皿を風乾させます。
5. コラーゲン溶液が滅菌されていない場合は、滅菌組織培養フード内で紫外線(UV)光に10分間曝露してコラーゲンコーティング皿を滅菌する。

2. 設備のセットアップ

1. 図1Bに示すように加熱加湿再循環灌流装置を設置する。
2. 灌流システムを10%漂白剤で5分間すすぎ、続いて滅菌水をさらに10分間すすいでください。
3. コラゲナーゼ溶液を灌流する前に、できるだけすすぎ液を排出してください。
4. コラゲナーゼ溶液を灌流系を通して注入し( 図1Bに示すように)、37°Cで予温する。 速度制御ダイヤルに示されているように、ポンプ速度を速度1に設定します(40mL/分に等しい)。
5. この速度は、手順全体を通して同じに保ちます。LSEC単離の日中に閉回路で実行されるコラゲナーゼ溶液を再利用する。
   注:ポンプ速度は、LSECの生物学的状態を乱す可能性のある機械的圧力を避けるために1に固定されています。

3. 外科的処置

1. マウスの重量を量ります。
2. 90mg/kg体重のケタミンと10mg/kg体重のキシラジンを腹腔内に注射する(IP)。
3. マウスが痛みを伴う刺激に反応しなくなったら、 図1Bに示すように、マウスを手術面に固定します。
4. マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。外科用はさみを使用して、腹部の下部から剣状突起まで〜5cmの長さの切開を行う。
5. 次に、腹部の両側に小さな虹彩はさみを使用して2つの横方向の切り傷を作り、腹部の器官を完全に露出させます。
6. 静脈内(IV)カテーテルのシースを動物の背中の下に置き、腹部を持ち上げて水平にします。
7. 通常の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、腸と胃を動物の左側に静かに引き離します。
8. 露出した左腎臓のすぐ下の下大静脈(IVC)の下に5-0の外科的縫合糸を置く。縫合糸に緩いヒッチを結びます。
9. 肝門脈(PV)の周囲に別の5-0外科用縫合糸を、肝PVから分岐する脾静脈のすぐ上に置く。縫合糸に緩いヒッチを結びます。
10. PV縫合糸を張力として用いて、20G IVカテーテルを1cm下の肝PVに挿入し、左右の肝PVに分岐させる。
11. カテーテルを静脈上にスライドさせますが、分岐領域の下に保管してください。血液が滴り落ち始めるまでカテーテルを下るのを許します。
12. 静脈内(IV)ボトル内のバッファーA(表1)の一部を手術領域の上に置いた状態で、IVラインを使用してカテーテルに取り付けます。システムへの空気の侵入を避けながら、この溶液で肝臓を洗い流してください。
13. 腎臓の下の下大静脈の周りに縫合糸を結びます。これにより、肝臓はレトロな灌流が可能になります。
14. 動物が出血できるように縫合糸の下のIVCをカットします。
    注:この手順は、肝臓の鬱血を避けるために迅速に実行する必要があります。
15. IVカテーテルをPV縫合糸で固定する。
16. 灌流したら、胃、腸、脾臓、および肝臓に付着した他の内臓を切り取ります。
17. 横隔膜と主要血管を胸腔から切り取ります。動物から肝臓を取り出し、それを灌流トレイの上に置きます。
18. IVラインを慎重に取り外し、再循環チャンバ内のコラゲナーゼ溶液をフックアップする。
    注:ステップ3.16-3.18は5分以内に行う必要があるため、肝臓はバッファAで長時間灌流されません。
19. カプセルが斑点になり、濁って見えるまで肝臓に灌流させます(10〜15分以上、期間はコラゲナーゼのロットによって異なります)。
20. 肝臓が灌流されている間、剖検バッグに処分する前に動物が死亡していることを確認してください。
21. 消化したら、肝臓をチャンバーから取り出し、約20mLの無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む10cmのシャーレに入れます。
22. いくつかのピペットチップで肝臓を優しく拾い上げ、胆道の木を捨てます。
23. 肝臓懸濁液を70μmのセルストレーナーを通して50mLの円錐管に濾過する。
24. 細胞懸濁液を50 x g でRTで2分間遠心分離し、非実質肝細胞を含む上清を回収する。
    注:肝細胞はペレット中に沈殿し、これは先に記載したようにグラジエント遠心分離を用いてさらに精製することができる¹⁵。

4. 非実質肝細胞の分離とLSECの精製

メモ:CD146⁺ LSECは、製造元の指示に従って、免疫磁気ビーズを使用して精製してください。

1. 上清を300 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
2. 細胞ペレットを収集し、1mLの単離緩衝液に再懸濁し(表1)、製造業者の指示に従って自動セルカウンタを用いて細胞数を決定する。
3. 細胞懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
4. ペレットを全細胞107個あたり90μLの単離緩衝液で再懸濁^する 。
5. 全細胞¹⁰⁷ 個あたり10μLのCD146磁気ビーズを加える。よく混ぜ合わせ、4°Cで15分間インキュベートする。
6. 細胞を洗浄するには、¹⁰⁷ 細胞あたり1〜2mLの単離緩衝液を添加し、300 x g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
7. 最大¹⁰⁹ 個の細胞を500 μLの単離バッファーに再懸濁する(表1)。
   メモ: セル番号が大きい場合は、それに応じてバッファボリュームをスケールアップします。
8. 分離カラムを準備し、3mLの単離緩衝液ですすいでください。
9. 細胞懸濁液を、70 μm の予備分離フィルターで積み重ねたカラムに塗布します。
10. カラムを3 mLの単離バッファーで3回洗浄する。
    注: カラムを洗浄するときは、カラムリザーバが空になったらすぐに分離バッファーを追加する必要があります。
11. カラムを分離器から取り出し、15 mL 遠沈管の上に置きます。カラム上に5 mLの単離バッファーをピペットする。
12. 標識された細胞を磁気ビーズで回収するには、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで細胞を洗い流します。
13. 300 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離機を遠心分離し、顕微鏡検査と下流分析の準備ができています。

5. LSECのイムノフェノタイピングとフローサイトメトリーによる純度評価

1. 製造元の指示に従って、自動セルカウンタを使用して、分離されたLSECのセル番号を決定します。
2. 細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
3. 1 x¹⁰⁶ 細胞/チューブを取り、90 μLの染色バッファーで再懸濁する(表1)。
4. マウスFcRブロック10 μL/チューブと生存率色素1 μLを加え、4°Cで10分間インキュベートする。
5. 染色バッファーで1:50に希釈したCD45、CD146、およびスタビリン-2抗体の組み合わせで細胞を染色する。4°Cで20分間インキュベートする。
6. 細胞を5mLの染色緩衝液で洗浄し、300 x g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。
7. 細胞を300 μLの染色バッファーで再懸濁し、フローサイトメーターに通します。

6. LSECの文化と検討

1. 6ウェルプレートに1 x¹⁰⁶ 細胞/ウェルの種子を、5%ウシ胎児血清(FBS)、1%内皮細胞増殖サプリメント、および1%プリモシン溶液からなる内皮細胞増殖培地で培養する。
2. 単離されたLSECを光学顕微鏡で調べる。10倍の倍率で明視野画像を取得します。

7. 走査型電子顕微鏡によるLSECの形態とフェネストレー検査

1. 細胞培養インサート(孔径3μm)をコラーゲン溶液で予めコーティングする。
2. 単離したLSEC(120,000細胞)を内皮細胞増殖培地と共にインサート上で37°C加湿雰囲気下で24ウェルプレート中で培養した。細胞が落ち着いて2時間接着するのを許します。
3. 細胞固定のために、37°Cで予温したトランプの固定液を等価量の細胞培養培地に加える。
4. 10分間インキュベートした後、50%希釈されたトランプの固定液を希釈されていないトランプの固定液と交換する。
5. トランプ固定液で細胞を2時間固定し、次いで1%四酸化オスミウム中で1時間インキュベートする。
6. 試料脱水、臨界点乾燥装置での乾燥、実装、スパッタ塗布、走査型電子顕微鏡を用いた検査などを進める。

結果

実験回路図と装置のセットアップ:
このプロトコールでは、マウス肝臓を閉鎖灌流回路を用いて消化し、次いで、非実質細胞および肝細胞を、50 x g で2分間の低速遠心分離によって分離した。一次LSECは、非実質画分からのCD146磁気ビーズ選択を用いて単離した。実験模式を 図1Aに示す。カニューレをPVを通して配置し、下大静脈を縛り付けて、肝臓?...

ディスカッション

現在の原稿では、2段階のコラゲナーゼ灌流とそれに続く磁気活性化細胞選別(MACS)からなるマウス肝臓からのLSEC単離のためのプロトコルを記述している。このプロトコルは、以下の3つのステップからなる:(1)PVをカルシウムを含まない緩衝液で灌流し、続いてコラゲナーゼ含有緩衝液を用いて肝細胞分散を達成する。(2)低速遠心分離による肝細胞の排除;(3)抗CD146磁気ビーズを用いた非実質細胞(...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07