Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Résumé

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Résumé

Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) sont des cellules endothéliales spécialisées situées à l’interface entre la circulation et le parenchyme hépatique. Les CSLS ont une morphologie distincte caractérisée par la présence de fenestrae et l’absence de membrane basale. Les CSL JOUENT UN RÔLE ESSENTIEL DANS DE NOMBREUX TROUBLES PATHOLOGIQUES DU FOIE, NOTAMMENT LA DÉRÉGULATION MÉTABOLIQUE, L’INFLAMMATION, LA FIBROSE, L’ANGIOGENÈSE ET LA CANCÉROGENÈSE. Cependant, peu de choses ont été publiées sur l’isolement et la caractérisation des CSLS. Ici, ce protocole traite de l’isolement du LSEC chez les souris saines et non alcooliques de la stéatose hépatique (NAFLD). Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase du foie de souris et la sélection positive de billes magnétiques de cellules non parenchymateuses pour purifier les CSL. Cette étude caractérise les LSEC à l’aide de marqueurs spécifiques par cytométrie en flux et identifie les caractéristiques phénotypiques caractéristiques par microscopie électronique à balayage. Les CSLS isolés selon ce protocole peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles, y compris des essais d’adhérence et de perméabilité, ainsi que des études en aval pour une voie d’intérêt particulière. En outre, ces LSTEC peuvent être regroupés ou utilisés individuellement, ce qui permet la génération de données multi-omiques, y compris l’ARN-seq en vrac ou à cellule unique, la protéomique ou la phospho-protéomique, et le test pour la chromatine accessible à la transposase en utilisant le séquençage (ATAC-seq), entre autres. Ce protocole sera utile pour les chercheurs qui étudient la communication des CSL avec d’autres cellules hépatiques dans les domaines de la santé et de la maladie et permettra une compréhension approfondie du rôle des CSLS dans les mécanismes pathogènes des lésions hépatiques aiguës et chroniques.

Introduction

Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) tapissent les parois sinusoïdales hépatiques et sont les cellules non parenchymateuses les plus abondantes dans le foie¹. Les CSL SE distinguent des autres cellules endothéliales capillaires ailleurs dans le corps par la présence de fenestrae et l’absence d’une membrane basale classique ou d’un diaphragme ^2,3. Par conséquent, les CSLS possèdent des caractéristiques phénotypiques et structurelles distinctives qui améliorent leur perméabilité et leur capacité endocytaire à éliminer une variété de macromolécules circulantes, y compris les lipides et les lipoprotéines. Les CSL JOUENT UN RÔLE CENTRAL DANS LA DIAPHONIE entre les cellules parenchymateuses et non parenchymateuses, telles que les cellules stellaires et les cellules immunitaires. Les CSLS sont essentiels au maintien de l’homéostasie hépatique en maintenant les cellules stellaires et les cellules de Kupffer dans un état de repos⁴. Les CSL modulent la composition des populations de cellules immunitaires hépatiques en médiant l’adhésion et la migration transendothéliale des leucocytes circulants ^5,6. Au cours des lésions hépatiques aiguës et chroniques⁷, y compris les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI)⁸, la stéatohépatite non alcoolique (NASH)⁹ et le carcinome hépatocellulaire (CHC), les CSL subissent des changements phénotypiques connus sous le nom de capillarisation caractérisée par la défenestration et la formation de la membrane basale¹⁰. Ces changements phénotypiques dans les CSLS sont associés à un dysfonctionnement des CSLS et à l’acquisition de propriétés prothrombotiques, pro-inflammatoires et profibrogéniques.

Plusieurs méthodes d’isolement des CSL du foie de souris ont été mises au point¹¹. Certaines techniques dépendent de la séparation des cellules non parenchymateuses et parenchymateuses suivie d’une centrifugation par gradient de densité pour purifier les LSTEC des fractions non parenchymateuses. La limitation de cette méthode est la présence de macrophages contaminants dans les dernières étapes de l’isolement des CSEL, ce qui pourrait affecter la pureté des CSEL isolés¹². Ce protocole est basé sur la perfusion de collagénase du foie de souris et la sélection positive des billes magnétiques CD146⁺ de cellules non parenchymateuses pour purifier les CSLS. Les CSLS isolés à l’aide de cette méthode présentent une grande pureté et une morphologie et une viabilité préservées. Ces CSLS sont optimaux pour les études fonctionnelles, y compris les essais de perméabilité et d’adhérence, ainsi que pour les études en aval des voies d’intérêt. De plus, avec l’intérêt croissant pour la génération de grands ensembles de données dans la recherche clinique et la science de la découverte, ces CSL de haute qualité isolés à partir de foies sains et malades atteints de stéatohépatite non alcoolique (NASH) ou d’autres affections peuvent être regroupés ou utilisés individuellement, ce qui permet la génération de données multi-omiques et la comparaison entre la santé et la maladie^13,14 . En outre, les LSTEC isolés peuvent être utilisés pour développer des modèles in vitro bidimensionnels et tridimensionnels tels que des organoïdes pour déchiffrer la voie de signalisation activée dans les LSTEC et leur communication intercellulaire avec d’autres cellules hépatiques sous différents stimuli nocifs et en réponse à diverses interventions thérapeutiques.

Protocole

Les protocoles pour animaux ont été menés tels qu’approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Mayo Clinic. Des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines ont été achetées au Jackson Laboratory. Les souris ont été logées dans une installation de cycle lumière-obscurité de 12:12 h à température contrôlée avec un accès gratuit à l’alimentation.

1. Préparation d’un plat ou d’une assiette de culture enrobé de collagène

1. Pour obtenir 50 mL d’acide acétique 0,02 mol/L, ajouter 0,6 mL d’acide acétique glacial à 49,4 mL de_H2O.
2. Produire 50 μg/mL de collagène de type I dans 0,02 mol/L d’acide acétique. La dilution dépend de la concentration du lot.
3. Enduire les plats de culture de 10 cm avec 3 mL de solution de collagène. Incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
   REMARQUE: Lors de l’utilisation d’un plat ou d’une plaque différent pour la culture, le volume de la solution de revêtement doit être ajusté en fonction de la zone de culture, utilisez généralement 6-10 μg / cm².
4. Retirez l’excès de liquide de la surface revêtue et lavez-le avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois. Laissez sécher la vaisselle à l’air.
5. Si la solution de collagène n’est pas stérile, stériliser les plats enrobés de collagène par exposition à la lumière ultraviolette (UV) pendant 10 minutes dans une hotte de culture tissulaire stérile.

2. Configuration de l’équipement

1. Installez l’appareil de perfusion à recirculation chauffé et humidifié comme illustré à la figure 1B.
2. Rincez le système de perfusion à l’aide de 10% d’eau de Javel pendant 5 min, puis d’eau stérile pendant 10 minutes supplémentaires.
3. Égouttez le liquide de rinçage autant que possible avant de perfuser la solution de collagénase.
4. Infuser la solution de collagénase à travers le système de perfusion (comme le montre la figure 1B) pour la préchauffer à 37 °C. Réglez le débit de la pompe à la vitesse 1 comme indiqué sur la molette de contrôle de vitesse (égale à 40 mL/min).
5. Gardez cette vitesse la même tout au long de la procédure. Réutilisez la solution de collagénase en circuit fermé pendant la journée d’isolement LSEC.
   REMARQUE: La vitesse de la pompe est fixée à 1 pour éviter la pression mécanique qui pourrait perturber l’état biologique des CSL.

3. Intervention chirurgicale

1. Pesez la souris.
2. Injecter 90 mg/kg de poids corporel de kétamine et 10 mg/kg de poids corporel de xylazine par voie intrapéritonéale (IP).
3. Une fois que la souris n’est pas réactive aux stimuli douloureux, fixez-la à la surface chirurgicale, comme le montre la figure 1B.
4. Vaporisez l’abdomen de la souris avec 70% d’éthanol. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision d’environ 5 cm de long à partir de la partie inférieure de l’abdomen jusqu’au processus xiphoïde.
5. Ensuite, faites deux coupes latérales à l’aide de petits ciseaux à iris de chaque côté de l’abdomen pour exposer complètement les organes abdominaux.
6. Placez la gaine du cathéter intraveineux (IV) sous le dos de l’animal pour soulever et niveler l’abdomen.
7. À l’aide d’une pince de pansement incurvée régulière, retirez doucement les intestins et l’estomac vers la gauche de l’animal.
8. Placez une suture chirurgicale 5-0 sous la veine cave inférieure (IVC) juste en dessous du rein gauche exposé. Attachez un attelage lâche dans la suture.
9. Placez une autre suture chirurgicale 5-0 autour de la veine porte hépatique (PV) juste au-dessus du point de ramification de la veine splénique de la PV hépatique. Attachez un attelage lâche dans la suture.
10. En utilisant la suture PV comme tension, insérez le cathéter IV 20 G dans le PV hépatique 1 cm en dessous où il se ramifie vers le PV hépatique droit et gauche.
11. Faites glisser le cathéter vers le haut de la veine, mais gardez-le sous la zone de ramification. Laissez le sang circuler le long du cathéter jusqu’à ce qu’il commence à s’égoutter.
12. Avec une partie du tampon A (tableau 1) dans un flacon intraveineux (IV) placé au-dessus de la zone chirurgicale, utilisez une ligne IV et fixez-la au cathéter. Rincez le foie avec cette solution tout en évitant l’entrée d’air dans le système.
13. Attachez la suture autour de la veine cave inférieure sous le rein. Cela permettra au foie de percuser rétro.
14. Coupez la CIV sous la suture pour permettre à l’animal de saigner.
    REMARQUE: Cette étape doit être effectuée rapidement pour éviter la congestion du foie.
15. Fixez le cathéter IV avec la suture PV.
16. Une fois perfusé, coupez l’estomac, les intestins, la rate et les autres entrailles attachées au foie.
17. Coupez le diaphragme et les principaux vaisseaux de la cavité thoracique. Retirez le foie de l’animal et placez-le sur le plateau de perfusion.
18. Retirez soigneusement la ligne IV et branchez la solution de collagénase dans la chambre de recirculation.
    REMARQUE: Les étapes 3.16-3.18 doivent être effectuées dans les 5 minutes, de sorte que le foie ne sera pas perfusé trop longtemps avec le tampon A. Faites très attention à ne pas laisser de bulles d’air dans le foie.
19. Laissez le foie perfuser jusqu’à ce que la capsule devienne tachetée et apparaisse pâteuse (10-15 min ou plus, la période varie en fonction des différents lots de collagénase).
20. Pendant que le foie est en perfusion, assurez-vous que l’animal est décédé avant de le jeter dans un sac de nécropsie.
21. Une fois digéré, retirez le foie de la chambre et placez-le dans une boîte de Petri de 10 cm avec environ 20 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco sans sérum.
22. Séparez délicatement le foie avec quelques pointes de pipette et jetez l’arbre biliaire.
23. Filtrer la suspension hépatique à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL.
24. Centrifuger la suspension cellulaire à 50 x g pendant 2 min à TA. Prélever le surnageant contenant des cellules hépatiques non parenchymateuses.
    REMARQUE: Les hépatocytes sont précipités dans la pastille, qui peut être purifiée à l’aide de la centrifugation par gradient comme décrit précédemment¹⁵.

4. Séparation des cellules hépatiques non parenchymateuses et purification des CSLS

REMARQUE: Purifier les CD146⁺ LSEC à l’aide des billes immunomagnétiques, en suivant les instructions du fabricant.

1. Centrifuger le surnageant à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
2. Recueillir la pastille de cellule et la remettre en suspension dans 1 mL de tampon d’isolement (tableau 1), déterminer le numéro de cellule à l’aide d’un compteur de cellules automatique en suivant les instructions du fabricant.
3. Centrifuger la suspension de la cellule à 300 x g pendant 10 min à 4 °C, aspirer complètement le surnageant.
4. Remettre en suspension la pastille avec 90 μL de tampon d’isolement pour 10⁷ cellules au total.
5. Ajouter 10 μL de billes magnétiques CD146 pour 10⁷ cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.
6. Pour laver les cellules, ajoutez 1 à 2 mL de tampon d’isolement pour 10⁷ cellules, centrifugez à 300 x g pendant 10 min, puis aspirez complètement le surnageant.
7. Remettre en suspension jusqu’à 10⁹ cellules dans un tampon d’isolement de 500 μL (tableau 1).
   REMARQUE: Pour un nombre de cellules plus élevé, augmentez le volume de la mémoire tampon en conséquence.
8. Préparez la colonne de séparation, rincez-la avec 3 mL de tampon d’isolement.
9. Appliquez la suspension de la cellule sur la colonne empilée avec des filtres de pré-séparation de 70 μm.
10. Lavez la colonne avec les 3 mL de tampon d’isolation 3 fois.
    REMARQUE: Lors du lavage de la colonne, le tampon d’isolation doit être ajouté dès que le réservoir de la colonne est vide.
11. Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 mL. Pipette 5 mL de tampon d’isolation sur la colonne.
12. Pour récupérer les cellules marquées par des billes magnétiques, poussez fermement le piston dans la colonne pour débusquer les cellules.
13. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Les CSLS sont prêts pour l’examen microscopique et l’analyse en aval.

5. Immunophénotypage et évaluation de la pureté des CSL par cytométrie en flux

1. Déterminez le nombre de cellules des LSTEC isolés à l’aide d’un compteur de cellules automatique en suivant les instructions du fabricant.
2. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min, aspirer complètement le surnageant.
3. Prélever 1 x 10⁶ cellules/tube et remettre en suspension avec 90 μL de tampon de coloration (tableau 1).
4. Ajouter 10 μL/tube de bloc FcR de souris et 1 μL de colorant de viabilité, incuber à 4 °C pendant 10 min.
5. Colorez les cellules avec une combinaison d’anticorps CD45, CD146 et stabilin-2 dilués à 1:50 avec un tampon de coloration. Incuber à 4 °C pendant 20 min.
6. Lavez les cellules avec 5 mL de tampon de coloration et centrifugez à 300 x g pendant 10 min, puis aspirez complètement le surnageant.
7. Remettez en suspension les cellules avec 300 μL de tampon de coloration et faites passer le cytomètre en flux.

6. Culture et examen des CSL

1. Semer 1 x 10⁶ cellules / puits dans une plaque de 6 puits et le cultiver avec un milieu de croissance de cellules endothéliales composé de 5% de sérum bovin fœtal (FBS), de 1% de supplément de croissance de cellules endothéliales et de solution de primocine à 1%.
2. Examiner les CSL isolés par microscopie optique. Obtenez des images en champ lumineux avec un grossissement de 10x.

7. Morphologie des CSL et examen des fenestrae par microscopie électronique à balayage

1. Pré-enduire les inserts de culture cellulaire (taille des pores de 3 μm) avec une solution de collagène.
2. Cultiver des CSLSE isolés (120 000 cellules) sur l’insert avec un milieu de croissance de cellules endothéliales dans une plaque de 24 puits à 37 °C atmosphère chaude et humidifiée. Laissez les cellules s’installer et adhérer pendant 2 h.
3. Pour la fixation cellulaire, ajoutez un volume équivalent de fixateur préavertissé à 37 °C de Trump au milieu de culture cellulaire.
4. Après une incubation de 10 minutes, remplacez le fixateur de Trump dilué à 50% par le fixateur de Trump non dilué.
5. Fixer les cellules dans le fixateur trump pendant 2 h, puis incuber pendant 1 h dans des tétroxydes d’osmium à 1%.
6. Procéder à la déshydratation des échantillons, au séchage dans un dispositif de séchage aux points critiques, au montage, au revêtement par pulvérisation et à l’examen à l’aide d’un microscope électronique à balayage.

Résultats

Schémas expérimentaux et équipements mis en place :
Dans ce protocole, le foie de souris a été digéré à l’aide d’un circuit de perfusion fermé, puis les cellules non parenchymateuses et les hépatocytes ont été séparés par centrifugation à basse vitesse à 50 x g pendant 2 min. Les CSL PRIMAIRES ont été isolés à l’aide de la sélection de billes magnétiques CD146 à partir de la fraction non parenchymateuse. Les schémas expérimentaux sont illustrés à

Discussion

Dans le présent manuscrit, nous décrivons un protocole d’isolement LSEC du foie de souris consistant en une perfusion de collagénase en deux étapes et un tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) ultérieur. Ce protocole comprend les trois étapes suivantes: (1) Perfusion à travers le PV avec un tampon sans calcium suivi d’un tampon contenant de la collagénase pour obtenir une dispersion des cellules hépatiques; (2) Exclusion des hépatocytes avec centrifugation à basse vitesse; et (3) sélection positive...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07