Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Resumo

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Resumo

As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são células endoteliais especializadas localizadas na interface entre a circulação e o parênquim hepático. Os LSECs têm uma morfologia distinta caracterizada pela presença de fenestrae e pela ausência de membrana do porão. Os LSECs desempenham papéis essenciais em muitas doenças patológicas no fígado, incluindo desregulação metabólica, inflamação, fibrose, angiogênese e carcinogênese. No entanto, pouco foi publicado sobre o isolamento e caracterização dos LSECs. Aqui, este protocolo discute o isolamento do LSEC de camundongos saudáveis e não alcoólicos da doença hepática gordurosa (NAFLD). O protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do rato e contas magnéticas seleção positiva de células nãoparambiais para purificar LSECs. Este estudo caracteriza os LSECs usando marcadores específicos por citometria de fluxo e identifica as características fenotípicas características através da microscopia eletrônica de varredura. Os LSECs isolados seguindo este protocolo podem ser usados para estudos funcionais, incluindo ensaios de adesão e permeabilidade, bem como estudos a jusante para um determinado caminho de interesse. Além disso, esses LSECs podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics, incluindo RNA-seq em massa ou célula única, proteômica ou fosfo-proteômica, e Ensaio para Chromatina Acessível transposase usando sequenciamento (ATAC-seq), entre outros. Este protocolo será útil para os pesquisadores que estudam a comunicação dos LSECs com outras células hepáticas em saúde e doenças e permitirá uma compreensão aprofundada do papel dos LSECs nos mecanismos patogênicos de lesões hepáticas agudas e crônicas.

Introdução

As células endoteliais sinusoidais hepáticos (LSECs) alinham as paredes sinusoides hepáticas e são as células não parambiais mais abundantes no fígado¹. Os LSECs distinguem-se de outras células endoteliais capilares em outros lugares do corpo pela presença de fenestrae e pela falta de uma membrana clássica do porão ou um diafragma ^2,3. Assim, os LSECs possuem características fenotípicas e estruturais distintas que aumentam sua permeabilidade e capacidade endócítica para eliminar uma variedade de macromoléculas circulantes, incluindo lipídios e lipoproteínas. Os LSECs desempenham um papel fundamental no crosstalk entre células parenchymal e não parenquiais, como células estelares e células imunes. Os LSECs são fundamentais na manutenção da homeostase hepática mantendo as células estelares e as células Kupffer em um estado quiescente⁴. Os LSECs modulam a composição das populações de células imunes hepáticas mediando a adesão e a migração trans-endotelial de leucócitos circulantes ^5,6. Durante a lesão hepática aguda e crônica⁷, incluindo lesão isquemia-reperfusão (IRI)⁸, esteatohepatite não alcoólica (NASH)⁹, e carcinoma hepatocelular (HCC), os LSECs sofrem alterações fenotípicas conhecidas como capilarização caracterizada pela defenestração e formação da membrana do porão¹⁰. Essas alterações fenotípicas nos LSECs estão associadas à disfunção dos LSECs e à aquisição de propriedades protombolíticas, proinflammatórias e profibrogênicas.

Vários métodos para o isolamento de LSECs do fígado de rato foram desenvolvidos¹¹. Algumas técnicas dependem da separação de células não parambientais e parínicas seguidas pela centrifugação gradiente de densidade para purificar os LSECs de frações não parambiais. A limitação deste método é a presença de macrófagos contaminados nas etapas finais do isolamento das LSECs, o que poderia afetar a pureza dos LSECs^{isolados 12}. Este protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do camundongo e contas magnéticas CD146⁺ seleção positiva de células não equiquiais para purificar LSECs. LSECs isolados usando este método mostram alta pureza e morfologia preservada e viabilidade. Estes LSECs são ótimos para estudos funcionais, incluindo permeabilidade e ensaio de adesão, bem como estudos a jusante para caminhos de interesse. Além disso, com o crescente interesse em gerar grandes conjuntos de dados tanto na pesquisa clínica quanto na ciência da descoberta, esses LSECs de alta qualidade isolados de fígados saudáveis e doentes com esteatohepatite não alcoólica (NASH) ou outras condições podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics e comparação entre saúde e doença^13,14 . Além disso, os LSECs isolados podem ser empregados para desenvolver modelos in vitro tridimensionais, bem como tridimensionais, como organoides para decifrar a via de sinalização ativada em LSECs e sua comunicação intercelular com outras células hepáticas sob diferentes estímulos nocivos e em resposta a várias intervenções terapêuticas.

Protocolo

Os protocolos animais foram conduzidos conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Clínica Mayo. Camundongos machos C57BL/6J de oito semanas foram comprados do Laboratório Jackson. Os ratos estavam alojados em uma instalação de ciclo claro-escuro de 12:12 h controlada pela temperatura com livre acesso à dieta.

1. Preparação de prato ou prato de cultura revestido de colágeno

1. Para fazer 50 mL de ácido acético mol/L de 0,02, adicione 0,6 mL de ácido acético glacial a 49,4 mL de H₂O.
2. Faça 50 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético mol/L de 0,02. A diluição depende da concentração do lote.
3. Cubra pratos de cultura de 10 cm com 3 mL de solução de colágeno. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 1h.
   NOTA: Ao usar um prato ou placa diferente para cultura, o volume da solução de revestimento precisa ser ajustado com base na área de cultura, geralmente use 6-10 μg/cm².
4. Remova o excesso de fluido da superfície revestida e lave com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) 3 vezes. Deixe os pratos secarem.
5. Se a solução de colágeno não for estéril, esterilize os pratos revestidos de colágeno por exposição à luz ultravioleta (UV) por 10 minutos em uma capa de cultura tecidual estéril.

2. Configuração do equipamento

1. Configure o aparelho de perfusão aquecido e umidificado, conforme mostrado na Figura 1B.
2. Enxágüe o sistema de perfusão usando 10% de alvejante por 5 minutos seguido de água estéril por mais 10 minutos.
3. Escorra o líquido de lavagem o máximo possível antes de perfumar a solução de colagemnase.
4. Infundir a solução de colagem através do sistema de perfusão (como mostrado na Figura 1B) para pré-aniá-la a 37 °C. Coloque a taxa da bomba na velocidade 1, conforme mostrado no mostrador de controle de velocidade (igual a 40 mL/min).
5. Mantenha essa velocidade igual durante todo o procedimento. Reutilizar a solução de colagenase em um circuito fechado durante o dia do isolamento LSEC.
   NOTA: A velocidade da bomba é fixada em 1 para evitar pressão mecânica que poderia perturbar a condição biológica dos LSECs.

3. Procedimento cirúrgico

1. Pesar o rato.
2. Injete 90 mg/kg de peso corporal de cetamina e 10 mg/kg de peso corporal de xilazina intraperitoneal (IP).
3. Uma vez que o rato não seja reativo a estímulos dolorosos, fixe o mouse na superfície cirúrgica, como mostrado na Figura 1B.
4. Pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de ~5 cm de comprimento, começando da parte inferior do abdômen até o processo xifoide.
5. Em seguida, faça dois cortes laterais usando uma pequena tesoura de íris em cada lado do abdômen para expor totalmente os órgãos abdominais.
6. Coloque a baia do cateter intravenoso (IV) sob as costas do animal para levantar e nivelar o abdômen.
7. Usando um fórceps curvos regulares, puxe suavemente os intestinos e o estômago para a esquerda do animal.
8. Coloque uma sutura cirúrgica de 5-0 sob a veia cava inferior (IVC) logo abaixo do rim esquerdo exposto. Amarre um engate solto na sutura.
9. Coloque outra sutura cirúrgica 5-0 ao redor da veia do portal hepático (PV) logo acima do ponto de ramificação da veia esplênica fora do PV hepático. Amarre um engate solto na sutura.
10. Utilizando a sutura PV como tensão, insira o cateter de 20 G IV no PV hepático 1 cm abaixo de onde se ramifica para o PV hepático direito e esquerdo.
11. Deslize o cateter até a veia, mas mantenha-o abaixo da área de ramificação. Deixe o sangue viajar pelo cateter até que comece a escorrer.
12. Com parte do Buffer A (Tabela 1) em uma garrafa intravenosa (IV) posicionada acima da área cirúrgica, use uma linha IV e conecte-a ao cateter. Lave o fígado com esta solução, evitando a entrada de ar no sistema.
13. Amarre a sutura ao redor da veia cava inferior abaixo do rim. Isso permitirá que o fígado retro perfume.
14. Corte o IVC abaixo da sutura para permitir que o animal sangre.
    NOTA: Esta etapa deve ser realizada rapidamente para evitar o congestionamento do fígado.
15. Fixar o cateter IV com a sutura PV.
16. Uma vez perfumado, corte o estômago, intestinos, baço e outras entranhas presas ao fígado.
17. Corte o diafragma e os principais vasos da cavidade torácica. Retire o fígado do animal e coloque-o na bandeja de perfusão.
18. Remova cuidadosamente a linha IV e conecte a solução de colagem na câmara de recirculação.
    NOTA: As etapas 3.16-3.18 precisam ser feitas dentro de 5 minutos, para que o fígado não fique perfumado por muito tempo com buffer A. Tenha muito cuidado para não permitir bolhas de ar no fígado.
19. Deixe o fígado perfundir até que a cápsula fique manchada e pareça mole (10-15 min ou mais, o período varia dependendo dos diferentes lotes de colagemnase).
20. Enquanto o fígado está em perfusão, certifique-se de que o animal está morto antes de descartá-lo em um saco de necropsia.
21. Uma vez digerido, remova o fígado da câmara e coloque-o em uma placa de Petri de 10 cm com cerca de 20 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
22. Desmonte suavemente o fígado com algumas pontas de pipeta e descarte a árvore biliar.
23. Filtre a suspensão hepática através de um coador de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL.
24. Centrifugar a suspensão celular a 50 x g por 2 min na RT. Colecione o supernatante contendo células hepáticas nãoparambiais.
    NOTA: Os hepatócitos são precipitados na pelota, que pode ser purificada ainda mais usando centrifugação gradiente como descrito anteriormente¹⁵.

4. Separação de células hepáticas não oparambimais e purificação de LSECs

NOTA: Purifique os LSECs CD146⁺ utilizando as contas imunomagnéticas, seguindo as instruções da fabricação.

1. Centrifugar o supernante a 300 x g por 5 min a 4 °C.
2. Coletar a pelota da célula e resuspend em 1 mL de tampão de isolamento (Tabela 1), determinar o número da célula usando um contador automático de células seguindo as instruções do fabricante.
3. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 10 min a 4 °C, aspirar o supernatante completamente.
4. Resuspende a pelota com 90 μL de tampão de isolamento por 10⁷ células totais.
5. Adicione 10 μL de contas magnéticas CD146 por 10⁷ células totais. Misture bem e incubar por 15 min a 4 °C.
6. Para lavar as células, adicione 1-2 mL de tampão de isolamento por 10⁷ células, centrífuga a 300 x g por 10 minutos e, em seguida, aspire o supernadente completamente.
7. Resuspend até 10⁹ células em 500 μL de tampão de isolamento (Tabela 1).
   NOTA: Para maiores números de células, aumente o volume do buffer de acordo.
8. Prepare a coluna de separação, enxágue-a com 3 mL de tampão de isolamento.
9. Aplique a suspensão da célula na coluna empilhada com filtros de pré-separação de 70 μm.
10. Lave a coluna com 3 mL de tampão de isolamento 3 vezes.
    NOTA: Ao lavar a coluna, o tampão de isolamento deve ser adicionado assim que o reservatório da coluna estiver vazio.
11. Retire a coluna do separador e coloque-a em um tubo de centrífuga de 15 mL. Pipeta 5 mL de tampão de isolamento na coluna.
12. Para recuperar as contas magnéticas rotuladas células, empurre firmemente o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células.
13. Centrifuuga a 300 x g para 5 min a 4 °C. Os LSECs estão prontos para exame microscópico e análise a jusante.

5. LSECs imunofenoftipagem e avaliação da pureza por citometria de fluxo

1. Determine os números de células de LSECs isolados usando um contador automático de células seguindo as instruções do fabricante.
2. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min, aspirar o supernante completamente.
3. Pegue 1 x 10⁶ células/tubo e resuspend com 90 μL de tampão de coloração (Tabela 1).
4. Adicione 10 μL/tubo de bloco FcR do mouse e 1 μL de corante de viabilidade, incubar a 4 °C por 10 min.
5. Colora as células com uma combinação de anticorpos CD45, CD146 e stabilin-2 diluídos à 1:50 com tampão de coloração. Incubar a 4 °C por 20 min.
6. Lave as células com 5 mL de tampão de coloração e centrífuga a 300 x g por 10 minutos, depois aspire completamente o sobrenante.
7. Resuspende as células com 300 μL de tampão de coloração e passe pelo citômetro de fluxo.

6. Cultura e exame LSECs

1. Semente 1 x 10⁶ células/bem em uma placa de 6 poços e cultuá-lo com meio de crescimento de células endoteliais consistindo de 5% de soro bovino fetal (FBS), 1% suplemento de crescimento de células endoteliais e 1% solução de primocina.
2. Examine os LSECs isolados por microscopia leve. Adquira imagens de campo brilhante com uma ampliação de 10x.

7. Morfologia LSECs e exame de fenestrae por meio da microscopia eletrônica de varredura

1. Pré-reveste as pastilhas de cultura celular (tamanho de poros de 3 μm) com solução de colágeno.
2. Cultura isolou LSECs (120.000 células) na inserção com células endoteliais meio de crescimento em uma placa de 24 poços a 37 °C atmosfera quente e umidificada. Permita que as células se acalmem e aderam por 2h.
3. Para fixação celular, adicione um volume equivalente de pré-armado a 37 °C de fixação de Trump à mídia de cultura celular.
4. Após a incubação por 10 minutos, substitua 50% da fixação diluída de Trump por fixação não diluída de Trump.
5. Fixar as células em Trump fixação por 2 h, em seguida, incubar por 1 h em 1% tetroxidas de ósmio.
6. Prossiga com a desidratação das amostras, secando em um dispositivo de secagem de ponto crítico, montagem, revestimento de sputter e exame usando um microscópio eletrônico de varredura.

Resultados

Esquemas experimentais e equipamentos configurados:
Neste protocolo, o fígado de rato foi digerido usando um circuito de perfusão fechado, então células não parêquias e hepatócitos foram separados por centrifugação de baixa velocidade a 50 x g por 2 min. Os LSECs primários foram isolados usando a seleção de contas magnéticas CD146 da fração não equiquial. Os esquemas experimentais são mostrados na Figura 1A. A cânula foi colocada através do PV ...

Discussão

No manuscrito atual, descrevemos um protocolo para o isolamento do LSEC do fígado de rato consistindo de perfusão de colagem de duas etapas e posterior classificação celular ativada por magnético (MACS). Este protocolo consiste nas seguintes três etapas: (1) Perfusão através do PV com um buffer livre de cálcio seguido de um tampão contendo colagem para alcançar a dispersão das células hepáticas; (2) Exclusão de hepatócitos com centrifugação de baixa velocidade; e (3) seleção positiva baseada em MACS d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07