Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Resumo

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Resumo

As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são células endoteliais especializadas localizadas na interface entre a circulação e o parênquim hepático. Os LSECs têm uma morfologia distinta caracterizada pela presença de fenestrae e pela ausência de membrana do porão. Os LSECs desempenham papéis essenciais em muitas doenças patológicas no fígado, incluindo desregulação metabólica, inflamação, fibrose, angiogênese e carcinogênese. No entanto, pouco foi publicado sobre o isolamento e caracterização dos LSECs. Aqui, este protocolo discute o isolamento do LSEC de camundongos saudáveis e não alcoólicos da doença hepática gordurosa (NAFLD). O protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do rato e contas magnéticas seleção positiva de células nãoparambiais para purificar LSECs. Este estudo caracteriza os LSECs usando marcadores específicos por citometria de fluxo e identifica as características fenotípicas características através da microscopia eletrônica de varredura. Os LSECs isolados seguindo este protocolo podem ser usados para estudos funcionais, incluindo ensaios de adesão e permeabilidade, bem como estudos a jusante para um determinado caminho de interesse. Além disso, esses LSECs podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics, incluindo RNA-seq em massa ou célula única, proteômica ou fosfo-proteômica, e Ensaio para Chromatina Acessível transposase usando sequenciamento (ATAC-seq), entre outros. Este protocolo será útil para os pesquisadores que estudam a comunicação dos LSECs com outras células hepáticas em saúde e doenças e permitirá uma compreensão aprofundada do papel dos LSECs nos mecanismos patogênicos de lesões hepáticas agudas e crônicas.

Introdução

As células endoteliais sinusoidais hepáticos (LSECs) alinham as paredes sinusoides hepáticas e são as células não parambiais mais abundantes no fígado¹. Os LSECs distinguem-se de outras células endoteliais capilares em outros lugares do corpo pela presença de fenestrae e pela falta de uma membrana clássica do porão ou um diafragma ^2,3. Assim, os LSECs possuem características fenotípicas e estruturais distintas que aumentam sua permeabilidade e capacidade endócítica para eliminar uma variedade de macromoléculas circulantes, incluindo lipídios e lipoproteínas. Os LSECs desempenham um pape....

Protocolo

Os protocolos animais foram conduzidos conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Clínica Mayo. Camundongos machos C57BL/6J de oito semanas foram comprados do Laboratório Jackson. Os ratos estavam alojados em uma instalação de ciclo claro-escuro de 12:12 h controlada pela temperatura com livre acesso à dieta.

1. Preparação de prato ou prato de cultura revestido de colágeno

1. Para fazer 50 mL de ácido acético mol/L de 0,02, adicione 0,6 mL de ácido acético glacial a 49,4 mL de H₂O.
2. Faça 50 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético mol/L de 0,02. A diluição....

Resultados

Esquemas experimentais e equipamentos configurados:
Neste protocolo, o fígado de rato foi digerido usando um circuito de perfusão fechado, então células não parêquias e hepatócitos foram separados por centrifugação de baixa velocidade a 50 x g por 2 min. Os LSECs primários foram isolados usando a seleção de contas magnéticas CD146 da fração não equiquial. Os esquemas experimentais são mostrados na Figura 1A. A cânula foi colocada através do PV .......

Discussão

No manuscrito atual, descrevemos um protocolo para o isolamento do LSEC do fígado de rato consistindo de perfusão de colagem de duas etapas e posterior classificação celular ativada por magnético (MACS). Este protocolo consiste nas seguintes três etapas: (1) Perfusão através do PV com um buffer livre de cálcio seguido de um tampão contendo colagem para alcançar a dispersão das células hepáticas; (2) Exclusão de hepatócitos com centrifugação de baixa velocidade; e (3) seleção positiva baseada em MACS d.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07