שיטת פרפוזיה טרנסקרדיאלית הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר

Summary

מוצגת שיטת זלוף נוחה הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר. זיהוי אימונופלואורסצנטי של α-סינוקלאין זרחני מודגם במודל עכברי של מחלת פרקינסון. עבודה זו גם מתארת באופן מקיף את ההעתקה, הנתיחה, הקפאת/הטבעת רקמות ושלבי חתך קפואים.

Abstract

הניתוח ההיסטולוגי של דגימות המוח וחוט השדרה שבודדו מעכברים הוא פרקטיקה נפוצה להערכת הפתולוגיה במערכת מודל זו. כדי לשמור על המורפולוגיה של רקמות עדינות אלה, זה שגרתי לתת מקבע כימי כגון paraformaldehyde באמצעות שימורים של הלב בבעלי חיים מרדימים (זלוף טרנסקרדיאלי). זלוף טרנסקרדיאלי של לב העכבר הסתמך באופן מסורתי על שימוש במשאבות פריסטלטיות או לחץ אוויר כדי לספק הן את הפתרונות המלוחים והן את הפתרונות המקבעים הדרושים לתהליך זה. כחלופה נגישה בקלות לשיטות אלה, עבודה זו מדגימה את השימוש בשיטה הניזונה מכוח הכבידה של אספקה מתכלה המשתמשת בחומרים הזמינים ברוב חנויות החומרה.

כדי לאמת את שיטת הזלוף החדשה הזו, עבודה זו מדגימה את כל השלבים הבאים הדרושים לזיהוי רגיש של α-סינוקלאין זרחני הן במוח והן בחוט השדרה. בשלבים אלה נכללים כריתה של רקמות המוח וחוט השדרה הקבועות, הקפאה/הטבעה מהירה וקריו-כריתה של הרקמות, והכתמה אימונופלואורסצנטית. מכיוון ששיטה זו גורמת למסירה של כל הגוף של המקבע, היא עשויה לשמש גם להכנת רקמות אחרות שאינן נוירונים לניתוח היסטולוגי.

Introduction

אפיון היסטולוגי של פתולוגיה במערכת העצבים המרכזית של העכבר (CNS) היא טכניקה שגרתית המשמשת במחקרים על ניוון עצבי. כאשר רקמות עצביות מתפרקות במהירות לאחר המוות, נהוג להעביר מקבע כימי כגון פרפורמלדהיד לרקמות CNS כדי לשמר את המורפולוגיה שלהן ^1,2. קיבוע כימי יכול להתבצע באמצעות פרפוזיה של כל הגוף עם תמיסה מקבעת או באמצעות בידוד של רקמות וטבילתן בתמיסה מקבעת (המכונה "קיבוע טיפה"). פרפוזיה היא השיטה המועדפת להעברה מקבעת, שכן קיבוע טיפה עשוי שלא לאפשר חדירה מהירה של הפתרון המקבע למבני CNS עמוקים ^3,4,5. יתר על כן, מכיוון שקשה להסיר את חוט השדרה הלא מרוסק מעמוד השדרה, העברת התמיסה המקבעת באמצעות זלוף מאפשרת שימור באתרו של האנטומיה המיקרוסקופית והגסה של חוט השדרה ומקשיחה את הרקמה כדי למזער את הנזק במהלך ההסרה.

אספקת המאגר ופתרונות הקיבוע הדרושים לקיבוע מתבצעת בדרך כלל באמצעות משאבות זמינות מסחרית או לחץ אוויר. אספקת כוח הכבידה של perfusate עשויה לשמש כחלופה להעברת המשאבה מהסיבות הבאות: (1) העברת משאבה או לחץ אוויר עשויה במקרים מסוימים לדרוש מהמשתמש לשמור באופן ידני על הלחץ במערכת לאורך כל הזלוף. ניתן לשמור על מסירת כוח המשיכה של perfusate ללא התערבות המשתמש. (2) ניתן לבנות מנגנון פרפוזט המועבר על ידי כוח הכבידה בעלות נמוכה למשתמש על ידי השגת חומרים הזמינים מספקים מדעיים סטנדרטיים. עבודה זו מתארת כיצד לבנות מכשיר פיזור כבידה פשוט באמצעות בקבוקי שטיפה וצינורות ויניל. באמצעות מודל עכברי של מחלת פרקינסון, עבודה זו מדגימה את היעילות של מערכת זו בהחדרת רקמות המוח וחוט השדרה לפני בידודם לצורך חתך קפוא. עבודה זו מתארת באופן מקיף את כל השלבים, הטכניקות והחומרים הדרושים כדי לנתח את הרקמה הקבועה מתוך החיה, להקפיא/להטביע ולהקריך במהירות את הרקמה, ולזהות את נוכחותם של α-סינוקלאין זרחניים הן במוח והן בחוט השדרה באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית עקיפה.

Protocol

הנתונים ושלבי הניסוי המוצגים בפרוטוקול זה נוצרו באמצעות עכברי C57BL/6J. כל השיטות המערבות בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של אוניברסיטת מדינת ניו יורק.

1. בניית מנגנון פרפוזיה ופלטפורמת דיסקציה

1. כפי שניתן לראות באיור 1, קצצו את הקשיות הפנימיות משני בקבוקי שטיפה של 500 מ"ל על-ידי חיתוך הסומק הזה לצד הפנימי של מכסה ההברגה באמצעות סכין גילוח חדה. חותכים חור מרובע בגודל 4 ס"מ על 4 ס"מ בתחתית כל בקבוק חיץ. חותכים חור קטן בתחתית כל בקבוק כדי לאפשר מעבר של מיקרוספטולה כפופה מפלדת אל-חלד.
2. צור עיקול בצורת "S" במיקרו-מרחביות כך שניתן יהיה להשתמש בהן כווים לתליית בקבוקי החיץ. הכנס את המיקרוספטולות הכפופות לתוך הפתחים המתאימים בבקבוקי החיץ.
3. חותכים שני צינורות באורך 25 ס"מ ומחברים אותם בחוזקה עם שקעי הקש החיצוניים של הבקבוק. חבר את הקצוות של צינורות אלה יחד עם מחבר Y. חותכים 2 מ' של צינורות ומחברים אותם לקצה החופשי של מחבר Y.
4. מוציאים את הבוכנה מהמזרק 1 מ"ל וחותכים את המזרק במרחק של כ-6 ס"מ מקצה המזרק. חותכים את המזרק על ידי ניקוד תחילה של הפלסטיק באמצעות סכין גילוח ולאחר מכן הצמדה חדה של פלסטיק המזרק.
5. הכנס את הפנים החתוכות של המזרק לקצה החופשי של צינורות הפלסטיק. הכנס לעומק מספיק כדי להבטיח אטימה הדוקה.
   הערה: חשוב שכל החיבורים בתוך מנגנון הזלוף יהיו הדוקים מספיק כדי למנוע דליפה. במקרה של חיבורים רופפים, ניתן למקם ולהדק מהדק צינורות נירוסטה קטנים בצמתים לפי הצורך כדי להבטיח אטימה הדוקה במידת הצורך.
6. סמן בקבוק חיץ אחד כ - PFA ובקבוק אחד כ - PBS (מאגר). יש למדוד^{כ-1/3 מהאורך} הרחק מפתח הבקבוק ולצייר קו סביב היקף הבקבוק בנקודה זו כדי לציין את רמת המילוי המתאימה של התמיסות המחורצות.
7. יש ליישר ולאחר מכן ליצור לולאה בתוך מהדק נייר גדול שיכול להתאים סביב היקף הצינורות. הניחו את הלולאה הזו סביב הצינורות רק קרובים למזרק.
8. הניחו גוש קלקר בגודל מתאים במגש הזכוכית. מניחים את קצוות הצינור לתוך גוש הקלקר כדי להדביק את הצינורות.
9. באמצעות מגבות נייר, הגבירו את הקצה הקדמי של מגש הזכוכית בכ-2 ס"מ.
   הערה: פעולה זו תמקם את העכבר בערך ב-20° של מיקום Trendelenburg (הטיה לאחור) כדי לאפשר הדמיה קלה יותר של הסרעפת במהלך הנתיחה ולעודד ניקוז של נוזלים במהלך זלוף.

איור 1: דיאגרמה המתארת את מנגנון הזלוף המורכב. קיצורים: PBS = מלוחים בעלי מאגר פוספט; PFA = paraformaldehyde. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. הכנת פתרון פרפורמלדהיד (PFA)

הערה: יש להכין תמיסת PFA טרייה ביום ההזלפה ולהשליך אותה בסוף הזלוף במיכל פסולת ייעודי לפני השלכתו על ידי כוח אדם מיומן. פרוטוקול זה מייצר תמיסת PFA של 1 ליטר מתוך 4%, שמספיקה כדי להחדיר כ-4 עכברים. PFA הוא רעיל מאוד, ויש להקפיד על הימנעות משאיפה או מגע ישיר עם העור בצורה האבקה או הנוזלית. לכן רוב שלבי ההכנה מבוצעים תוך לבישת כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה מתחת למכסה אדים.

1. יש לשטוף 1 ליטר באמצעות מים מזוקקים ולמלא בכ-800 מ"ל של 18 mΩ דרגה מולקולרית-ביולוגית H₂O.
2. מחממים את הכוס של H₂O במיקרוגל למשך 3 דקות או עד שטמפרטורת המים מגיעה ל-65 מעלות צלזיוס. מניחים על צלחת חימום/ערבוב שנשמרה במכסה אדים.
3. יש לשטוף מוט ערבוב במים מזוקקים ולהניחו במים החמים. התחילו את המערבל והפכו את הצלחת החמה לחום בינוני. ודא כי טמפרטורת המים אינה עולה על 70 °C (70 °F).
4. יש ללבוש מסכה כירורגית, כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה ולמדוד 40 גרם של אבקת PFA. יוצקים את האבקה הזו למים המחוממים.
5. באמצעות פיפטת העברה, הוסף כמה טיפות של 5 M NaOH לפתרון. אפשרו לאבקת ה-PFA להתמוסס באופן מלא. אם האבקה לא התמוססה במלואה לאחר מספר דקות, הוסיפו טיפות של 5 M NaOH לפי הצורך.
6. לאחר שכמעט כל ה-PFA נמס (ייראה מעט עכור), הפסיקו את הערבוב/חימום והוסיפו מיד 100 מ"ל של 10x מלוחים עם חיץ פוספט (PBS). לבסוף, יש להעלות את המים לסימן 1 ליטר על הכוס באמצעות 18 mΩ דרגה מולקולרית-ביולוגית H₂O. מכסים את הכוס בניילון נצמד ומניחים אותו במקפיא של -20 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה מגיעה לטמפרטורת החדר (כ-45 דקות).
7. כיול מד pH באמצעות התקנים המתאימים. בזמן שהכוס נמצאת על צלחת ערבוב, מדוד את ה-pH של התמיסה והוסף HCl עד שה-pH מגיע ל-7.4. במידת הצורך, הוסף 5 M NaOH כדי להגדיל את ה- pH אם הוא נמוך מדי.
8. חברו בקבוקון ואקום כדי לשאוב אבק והניחו משפך Büchner קרמי נקי עם נייר מסנן בבקבוקון. הפעילו את השואב והרטיבו את נייר הסינון באמצעות פיפטת העברה מלאה בתמיסת 4% PFA.
9. מוזגים באיטיות את תמיסת ה-PFA של 4% על נייר הסינון עד שכל הפתרון מסונן.
10. העבירו את התמיסה המסוננת למיכל נקי ומוגן באור ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (אחסנו לא יותר מ-24 שעות).

3. פרפוזיה "ללא משאבה" טרנסקרדיאלית

1. במכסה האדים, הניחו גוש חיתוך קלקר במגש זכוכית. ודא כי בלוק הניתוח כולל 5-6 מחטים קצרות לריסון העכבר במהלך הניתוח ו -2 מחטים ארוכות לתמיכה בצינורות הזלוף.
2. יש לשטוף את מנגנון הזלוף באמצעות מים מזוקקים. אפשרו לכל המים להתנקז לפני תליית מנגנון הזלוף. תלו את בקבוקי ההזלפה 1 מ' מעל החיה המחוררת (עבור עכבר 20-30 גרם).
3. הכן תמיסה לא סטרילית של 1x PBS באמצעות 10x PBS מדולל עם 18 mΩ רמה מולקולרית-ביולוגית H₂O.
4. כפי שמוצג באיור 2, הידקו את הקו הראשי של מנגנון הזלוף באמצעות המוסטאט. מהדק את קו ה-PFA עם עוד המוסטאט.
   הערה: חסימה עם המוסטאטים מרובים עשויה להיות נחוצה לכל שורה כדי למנוע לחלוטין זרימה.
5. מלאו את מיכל המאגר ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
6. מקם את קצה המזרק של מנגנון הזלוף בכוס כדי לאסוף חיץ פסולת ולהסיר את ההמוסטאט החותם את הקו הראשי (איור 2, משמאל).
7. אפשרו ל-PBS לזרום דרך הקו תוך הסרת אוויר כלוא על ידי הקשה נמרצת על דפנות הצינור.
8. לאחר שכל האוויר הוסר מהמאגר ומהקווים הראשיים, יש לחסום את הזרימה על ידי הצבת המוסטאט על הקו הראשי.
9. הסר את ההמוסטאט מקו ה-PFA ואפשר ל-PBS לזרום באופן מדרדר עד לבקבוק ה-PFA תוך הקשה על בועות כלשהן בקו ה-PFA (איור 2, באמצע). המשיכו לאפשר ל-PBS להיכנס לקו ה-PFA עד שניתן יהיה לראות את ה-PBS ממש מעל פתח הבקבוק. חסום את קו ה- PFA עם hemostat כדי לעצור את הזרימה לתוך בקבוק ה- PFA.
10. חברו את מחט עירוי הפרפר למזרק הזלוף ושטפו את ה-PBS דרך הקו (על ידי פתיחת הקו הראשי של המוסטאט) כדי להסיר בועות ממזרק הזלוף. סגור את המוסטאט של הקו הראשי.
11. ודא שבקבוק ה-PBS מלא כעת בערך^ב-1 /3 rd של PBS. במידת הצורך, יש לשטוף את ה-PBS דרך הקו הראשי או למלא יותר PBS לתוך בקבוק המאגר עד^ל-1 /3 מקיבולתו המלאה.
12. לאחר שכל הבועות הוסרו מה-PBS, ה-PFA והקווים הראשיים, מלאו את בקבוק ה-PFA ב-4% תמיסת PFA בטמפרטורת החדר עד לסימן השחור שעל הבקבוק (בערך 1/3^rd מלא) (איור 2, מימין).

איור 2: הכנת מנגנון הזלוף לניתוח זלוף. ראשית, סגרו את קו ה-PFA hemostat ופתחו את ההמוסטאט בקו PBS ובקו הראשי. מלא PBS והסר בועות מקו PBS ומהקו הראשי. לאחר מכן, מלאו את קו ה-PFA ב-PBS על ידי פתיחת ההמוטט בקו ה-PFA וסגירת ההמוטט בקו הראשי. הסר בועות בשורת ה-PFA. לבסוף, סגרו את ההמוסטאט על קו ה-PFA כאשר ה-PBS מגיע לפתח בקבוק ה-PFA. מלאו את בקבוק ה-PFA 1/3^rd מלא ב-PFA. ודא שרמת ה- PBS בבקבוק ה- PBS מלאה ב- 1/3^rd ומלאה ב- PBS או מנקזים PBS על ידי פתיחת הקו הראשי hemostat במידת הצורך. קיצורים: PBS = מלוחים בעלי מאגר פוספט; PFA = paraformaldehyde. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

13. היכונו לניתוח שאינו הישרדותי על ידי ניקוי המכשירים הבאים במים ואחריהם 70% אתנול: מספריים גדולים, מספריים עדין לניתוח, מלקחיים עדינים, מלקחיים מעוקלים עדינים.
14. הכינו את ההרדמה על ידי הנחת מגבונים נטולי אבק בצינור חרוטי של 50 מ"ל. במכסה אדים, משרים היטב את המגבונים נטולי האבק באיזופלורן ומניחים את הצינור הפתוח הפוך בכוס של 500 מ"ל. ודא שאין איזופלורן נוזלי בתחתית הכוס ומשליך כל איזופלורן נוזלי לפני הצבת עכבר בכוס.
15. מניחים את העכבר בכוס ומניחים ניילון נצמד על הפתח כדי להתחיל בהרדמה.
16. יש לבצע הרדמה עד שהעכבר מפסיק לנשום (כדקה ו-30 שניות).
17. כאשר הנשימה נעצרה, מיד להסיר את העכבר מן הכוס ולהחליף את המכסה על צינור חרוטי 50 מ"ל.
18. בדוק שהעכבר מורדם מספיק על ידי שימוש ברפלקס צביטה של הבוהן. אם החיה אינה מורדמת מספיק, יש לתת יותר איזופלורן כמתואר בשלב 3.15.
19. בעבודה מהירה, הניחו את העכבר על גוש הקלקר והצמידו את כפות הרגליים החוצה באמצעות ארבע מחטים קצרות (למשל, מחטי מזרק 22 גרם).
20. הרמת עור הבטן עם מלקחיים העור, השתמש במספריים הגדולים כדי לחתוך את דופן הבטן. יש לוודא כי לא נחתכו איברי בטן!
21. ממשיכים את חתך הבטן בצורה מעולה לכיוון הכבד. נתקו את הכבד מדופן הבטן הקדמית והמשיכו את החתך הראשוני בצורה מעולה לכיוון הסרעפת. עצרו את החתך הזה כ-1 ס"מ נחות מהסרעפת. הקפידו לוודא שהכבד לא נחתך!
22. המשיכו את החתך הראשוני לרוחב כלפי מעלה לכיוון הצד הימני והשמאלי של הסרעפת כדי ליצור חתך בצורת "Y" (איור 3A).
23. כאשר החתך מגיע לסרעפת, בצעו חור בסרעפת באמצעות מספריים עדינים וחתכו את הצלעות בצד ימין של החיה. חותכים את הצלעות בערך באמצע הדרך לבית השחי הימני.
24. בצע חתך דומה אך ארוך יותר דרך הצד השמאלי של הסרעפת כמעט כל הדרך אל בית השחי השמאלי.
25. לשקף את דופן החזה ולהצמיד אותו לגוש הקלקר.
26. במידת הצורך, נתחו את השומן מסביב ללב כדי לחשוף את החדר השמאלי. זהה את החדר השמאלי על סמך הצבע הבהיר יחסית בהשוואה לחדר הימני.
27. לאחר זיהוי החדר השמאלי, החזק את הלב יציב באמצעות לחץ קל עם המלקחיים המעוקלים העדינים. פתח את ההמוסטאט של הקו הראשי כדי לאפשר ל- PBS לזרום דרך המחט. מיד לנקב את החדר השמאלי ולהבטיח כי המחט מוכנסת לא יותר מ 0.5 ס"מ לתוך החדר. למשוך את המחט מעט במידת הצורך.
    הערה: מיקום מדויק של המחט בחדר השמאלי מצוין על ידי זרימה מדרדרת של דם לתוך צינורות המחט. חשוב לוודא שהמחט לא מוחדרת עמוק מדי לחדר. זה יכול לגרום לזרימה מדרדרת דרך הוורידים הריאתיים או לנקב את המחיצה הבין חדרית.
28. הניחו את צינורות הפרפר על X המיוצר בקלקר באמצעות שתי מחטים גדולות של 18 גרם.
    הערה: זה קריטי מכיוון שהוא ימנע את התנועה של מחט הפרפר בתוך הלב במהלך הזלוף.
29. זהה את הווריד הנבוב התחתון קאווה כשהוא יוצא מהכבד והעתק אותו באמצעות המספריים המנתחים העדינים (איור 3B). לחלופין, פתחו את האטריום הימני עם מספריים.
30. פתחו מיד את הקו הראשי כדי לאפשר לזלוף PBS להתחיל (איור 3C).
31. הבטיחו שה-PBS מתנקז מגוש הקלקר אל תוך מגש הזכוכית שמתחתיו. אם זה לא קורה, התאימו מחדש את זווית המגש או את בלוק הקלקר כדי לאפשר ניקוז של נוזלים לתוך מגש הזכוכית.
32. יש להמשיך בזלוף PBS עד שהנוזל הזורם מתוך הווריד הנבוב התחתון נקי מדם (כ-3 דקות).
    הערה: מיקום נכון של המחט בלב יגרום לניקוי חזותי של הדם מהכבד, אשר יהפוך מאדום לצבע קש. אם זה לא קורה, זה עשוי להיות מתוקן על ידי מיקום מחדש של מחט עירוי בתוך החדר השמאלי. ניתן לבצע חתך קטן בבסיס הזנב הגחוני כדי להעריך את איכות הזלוף. זלוף תקין יגרום ל-PBS ברור לזרום מתוך החתך בבסיס הזנב.
33. בעבודה מהירה, לחסום את קו PBS עם hemostat ולפתוח את קו PFA.
34. אפשרו ל-PFA לחלחל במשך כמה דקות עד שהזנב מתחיל להתכרבל. ברגע שהזנב מתחיל להתכרבל, התחילו טיימר של 50 דקות. אם הזנב אינו מתכרבל לאחר 5 דקות של פרפוזיית PFA, התחילו טיימר של 50 דקות עבור זלוף ה-PFA.
35. עקוב אחר רמת ה- PFA בבקבוק באופן רציף לאורך כל הזלוף כדי להבטיח שהרמה לא תרד נמוך מדי. מלאו יותר PFA בבקבוק אם המפלס יורד מתחת ל-2 ס"מ מעל מכסה הבקבוק.

איור 3: דיאגרמה המתארת פרפוזיה טרנסקרדיאלית. (A) דופן הבטן נחתכת תחילה, ולאחר מכן שני חתכים המצביעים לרוחב לעבר בית השחי ויוצרים "Y". (B) לאחר הכניסה לחלל בית החזה וחשיפת הלב, המחט מועברת לחדר השמאלי. לאחר מכן, IVC או אטריום ימני הוא transected כדי לאפשר ניקוז של perfusates לאחר שהם הסתובבו דרך הגוף. ה-IVC נחתך עדיף על הסרעפת. (ג) נוהל למתן תנינים. קיצור = IVC = vena cava נחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

35. לאחר שחלפו 50 דקות, חסמו את הקו הראשי עם המוסטאט ומשכו את המחט מהחדר השמאלי.
    הערה: העכבר כולו נוקשה בשלב זה וכעת ניתן למקם אותו במיכל מסומן של 4% PFA למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בשלב זה, ניתן לנתח את רקמות ה- CNS ולהניח אותן בנפרד במשך הלילה. בעבודה זו, העכבר כולו ממוקם בקיבוע מכיוון שהדבר מקצר את המרווח בין קיבוע למיקום ב- 4 °C (7 °F). זה גם מונע כל עיוות מכני אפשרי של רקמת עצבים שעלול להתרחש אם בעלי חיים מנותחים מראש לפני השלמת קיבוע הלילה.

4. כריתת CNS

1. הכן את המכשירים הבאים לנתיחה על ידי שטיפה במים ואחריה 70% אתנול: מספריים, מלקחיים, מלקחיים מעוקלים, מלקחיים עדינים מעוקלים, מלקחיים עדינים ישרים, מספריים עדינים עדינים.
2. תייג ארבעה צינורות לכל עכבר כדלקמן ומלא בסוכרוז סטרילי 20%: מזהה עכבר, מוח 1, מזהה עכבר, מוח 2, מזהה עכבר, מותני, מזהה עכבר, צוואר הרחם.
3. מוציאים את העכבר מתמיסת ה-PFA ומייבשים אותו במגבת נייר כדי להסיר עודפי PFA.
4. באמצעות המספריים הגדולים, להסיר את ראש העכבר על ידי חיתוך בצוואר.
5. מקם את הגוף בתמיסת ה- PFA. שמור על הראש כדי לנתח את המוח מהגולגולת.
6. כדי לנתח את המוח, התחילו בכך שתחזירו את עור הגולגולת קדימה כדי לחשוף את כל הגולגולת (איור 4A).
7. בצע חתך רדוד לתעלה השמיעתית תוך שימוש במספריים המנתחים העדינים כדי להיכנס לגולגולת
8. ממשיכים את החתך הזה לאורך הסינוס הרוחבי עד שהגולגולת נחתכת כל הדרך בין שתי התעלות השמיעתיות.
9. בצע חתך בניצב לחתך הקודם לאורך הסדק האורכי עד לחלק הרוסטרלי ביותר של הגולגולת (בערך בין העיניים).
10. באמצעות המלקחיים המעוקלים המחודדים, משקפים את הגולגולת לרוחב כדי לחשוף את המוח הקדמי. ממשיכים להסיר את הגולגולת עד שכל המוח הקדמי, כולל נורות חוש הריח, נחשפות.
11. התחילו לנתח את האזור הקאודלי של הגולגולת על ידי ביצוע חתך דרך העצם העורפית ולאט לאט המשיכו את החתך הזה כלפי מטה לכיוון הפורמן מגנום.
12. שיקפו את שתי פיסות הגולגולת לרוחב כדי לחשוף את המוח הקטן ואת גזע המוח באופן קאודלי (איור 4B).
13. השתמשו במלקחיים המעוקלים האולטרה-דקים כדי להפריד בין נורות חוש הריח לבין הגולגולת הקדמית ולהתחיל לקלף את המוח הרחק מבסיס הגולגולת החל מהפקעות של חוש הריח.
14. כאשר המוח מתקלף מבסיס הגולגולת, השתמש במלקחיים דקים במיוחד כדי לחתוך את עצבי הגולגולת ולאפשר את הסרת המוח.
15. המשיכו לקלף את המוח מבסיס הגולגולת עד שכל המוח השלם יוסר (איור 4C,D).
16. חותכים את המוח לשניים לאורך הסדק האורכי כדי להפריד בין ההמיספרה הימנית לשמאלית (איור 4E,F).
17. מקם חצי כדור אחד במוח 1 צינור ואת ההמיספרה השנייה בצינור המוח 2 . אחסנו את הצינורות האלה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהמיספרות במוח ישקעו (בערך במשך הלילה).

איור 4: הסרת מוח קבוע. (B) מוח חשוף בתוך הגולגולת. (C) מוח מבודד (היבט הגבי). (D) מוח מבודד (היבט גחוני). (E) ההמיספרה השמאלית (היבט רוחבי). (F) ההמיספרה השמאלית (היבט מדיאלי). סרגלי קנה מידה = 1 ס"מ (E ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

18. כדי לנתח את חוט השדרה, הסר את גוף העכבר מה- PFA והכתים אותו יבש.
19. הניחו את העכבר על גוש ניתוח קלקר במצב נוטה והצמידו את הכפות לתוך הבלוק באמצעות ארבע מחטים.
20. התחל את הניתוח על ידי חיתוך העור לאורך קו האמצע של העכבר מהצוואר לזנב כדי לחשוף את כל הישבן.
21. לשקף את השריר ואת החיתולית על הגב כדי לחשוף את החלק האחורי של עמוד החוליות.
22. החל מהחוליות הגולגולתיות ביותר, השתמשו במספריים המנתחים העדינים כדי לחתוך את הלמינה תוך הימנעות מחוט השדרה (איור 5A).
23. מניחים את המלקחיים המעוגלים האולטרה-דקים מתחת ללמינה ומושכים כלפי מעלה כדי לשבור את החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה (איור 5B).
24. השתמש במלקחיים המעוקלים כדי לשקף את החוליות השבורות ולחשוף את האזורים הצדדיים ביותר של חוט השדרה.
25. המשך בתהליך זה עבור החוליות הבאות על ידי הצבת המלקחיים המעוגלים האולטרה-דקים מתחת ללמינה ושבירת החוליות. המשיכו לשבור חוליות עד שכל עמוד השדרה הצווארי ועמוד השדרה החזי ייחשפו (איור 5C).
26. המשיכו לחשוף את חוט השדרה עד לקצה חוט השדרה המותני (איור 5D).
27. באמצעות סכין גילוח חדה, חותכים כל הדרך דרך חוט השדרה האמצעי.
28. באמצעות המלקחיים המעוקלים האולטרה-דקים, מעבירים את עצבי עמוד השדרה לרוחב מעמוד השדרה ואת החיתולית הקדמית לחוט השדרה כדי להפריד את חוט השדרה הצווארי באיטיות מעמוד השדרה החוליתי.
29. המשיכו לנתח את חוט השדרה הצווארי עד שהוא משתחרר מהחוליות (איור 5E). מניחים את חוט השדרה הצווארי-מידתוראקי בצינורית שכותרתה צוואר הרחם. אחסנו את הצינורית הזו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שחוט השדרה הצווארי ישקע (בערך במשך הלילה).
30. המשך לשבור את חוליות החזה עד לסוס הקאודה כמפורט בשלבים 4.22 עד 4.25. כאשר סוס הקאודה נחשף, השתמשו בסכין גילוח חדה כדי לחתוך את חוט השדרה 1 ס"מ מתחת לחוט השדרה המותני (איור 5F).
31. נתחו את חוט השדרה המותני הרחק מהחוליות כפי שמתואר בשלבים 4.26-4.27. מכניסים את חוט השדרה של סוס הקאודה המותני-בינוני לתוך הצינור המסומן במותני. אחסנו צינור זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שחוט השדרה המותני ישקע (בערך בן לילה).
32. כאשר כל הרקמות שקעו ב 20% סוכרוז, להעביר אותם צינורות מסומנים של 30% סוכרוז עד שהם שקעו או במשך 3 ימים.
    הערה: רקמות עמוד השדרה לעתים קרובות אינן שוקעות ב 30% סוכרוז.

איור 5: הסרה של מקטעי חוט שדרה קבועים. (B) מיקום מלקחיים מעוקלים לשבירת חוליות בודדות. (C) עמוד השדרה הצווארי החשוף. (D) עמוד שדרה צווארי, בית חזה ומותני חשוף. (E) הסרת עמוד השדרה הצווארי לאחר חיתוך עצבי עמוד השדרה. (F) חיתוך עמוד השדרה העצתי. (G) עמוד שדרה צווארי מבודד. (H) עמוד שדרה מותני מבודד. פסי קנה מידה = 1 ס"מ (G ו- H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. הטבעת OCT ואחסון רקמות

1. עבור כל עכבר, תייג ארבעה קריומולדים בצורת מלבנים: מזהה עכבר, חצי הכדור הימני, תאריך ההטבעה; מזהה עכבר, חצי כדור שמאלי, תאריך ההטבעה; מזהה עכבר, צוואר הרחם, תאריך ההטבעה; מזהה עכבר, מותני, תאריך ההטבעה.
2. הקימו מיכל קלקר ותלו מתכת מעל המיכל.
3. מלאו את מיכל הקלקר בחנקן נוזלי בערך באמצע הדרך. מלאו את המתכת ב-2-מתילבוטאן טרי בערך באמצע הדרך.
   הערה: 2-מתילבוטאן הוא רעיל, נדיף מאוד ודליק. יש להקפיד להימנע משאיפה על ידי ביצוע הצעדים הבאים במכסה אדים והרחק ממקורות בעירה.
4. הורידו באיטיות את המתכת לתוך החנקן הנוזלי והימנעו מכל התזה של החנקן הנוזלי לתוך המתכת.
5. אפשרו ל-2-מתילבוטאן להתחיל לקפוא. בזמן שה-2-מתילבוטאן קופא, מוציאים את הרקמה הרצויה מתמיסת 30% הסוכרוז ומטשטשים אותה על מגבון נטול אבק.
6. ממקמים את הרקמה בקריומולד כאשר האזור הרוסטרלי מכוון לכיוון החלק העליון (ללא תווית) של העובש.
7. במשורה יוצקים מדיום אופטימלי להטבעת טמפרטורת חיתוך (OCT) על הרקמה בקריומולד, תוך שימוש במספיק רק כדי לכסות את הרקמה לחלוטין. הימנע משימוש מוגזם ב- OCT מכיוון שהדבר עלול לגרום לפיצוח. הסר את כל הבועות מה- OCT.
8. כאשר 2-מתילבוטאן קפוא כיסה באופן מלא את המשטח הפנימי של המתכת, יש לטבול באופן מלא את הקרימולד בפאזה הנוזלית העליונה 2-מתילבוטאן במשך 12 שניות. לאחר 12 שניות, הניחו את הקריומולד לניקוז בריבוע רדיד אלומיניום מסומן ועטפו את כל הקריומולד. מיד הניחו את הקרימולד העטוף על קרח יבש והימנעו מהפשרה. ודא שה-OCT/cryomold הקפואים מכוסים תמיד בקרח יבש.
9. חזור על שלבים 5.6 עד 5.8 עבור כל הרקמות. מניחים את הרקמה של עכבר אחד בשקית ניילון קטנה ואטומה ולאחר מכן לתוך מיכל אטום ובטוח לקריו. אחסנו את המיכל הזה במקפיא העמוק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך החלקים.

6. קריוזקציה

1. לפני ההקפאה, יש לוודא כי טמפרטורת תא הקריוסטט וראש הדגימה מוגדרים להגדרות המתאימות.
   הערה: טמפרטורת תא של -20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת ראש דגימה של -20 מעלות צלזיוס, ועובי מקטע של 30 מיקרומטר משמשים לחיתוך מקטעי מוח. לחיתוך מקטעי חוט השדרה, נעשה שימוש בטמפרטורת תא של -23 מעלות צלזיוס, טמפרטורת ראש דגימה של -30 מעלות צלזיוס ועובי מקטע של 30 מיקרומטר. חשוב לציין כי יהיה צורך להתאים את הגדרות הקריוסטט (במיוחד טמפרטורת ראש הדגימה) במהלך החתך כדי לטפל בבעיות באיכות הרקמה. בדרך כלל, טמפרטורת ראש הדגימה יורדת כדי לתקן את מריחת הרקמה. לעומת זאת, טמפרטורת ראש הדגימה מוגברת כדי לתקן עבור סלסול רקמות מוגזם.
2. הסר את בלוק ה- OCT הרצוי מהמקפיא של -80 °C והנח את בלוק cryomold / OCT הלא מרוסק בתא cryostat.
3. אפשרו לבלוק ה-OCT להתאקלם לטמפרטורת התא למשך 30 דקות.
4. מנקים צ'אק עם 70% אתנול ומנגבים אותו לייבוש עם מגבון נטול אבק. מניחים את הצ'אק המנוקה בתא הקריוסטט ויוצרים עיגול בגודל של OCT בגודל מטבע על הצ'אק. אפשרו ל-OCT לקפוא (כ-1-2 דקות).
5. כאשר ה-OCT קפא, הניחו נקודה בגודל אפונה של OCT טרי על הצ'אק והניחו מיד את בלוק ה-OCT של הרקמה על הצ'אק. ודא שהרקמה מאונכת באופן מושלם לצ'אק לפני שה- OCT קופא לחלוטין.
   הערה: באופן כללי, האזור הרוסטרלי ביותר במוח ממוקם לכיוון הצ'אק כך שהחתך מתחיל מהקצה הקאודלי. עבור חוט השדרה, בדרך כלל, האזור הקאודלי ביותר ממוקם על הצ'אק כך שהחתך מתחיל מהקצה הרוסטרלי.
6. כאשר ה-OCT התקשה, הניחו יותר OCT סביב בסיס בלוק ה-OCT כדי לשמש כתמיכה מבנית במהלך החתך. כאשר תמיכה זו התקשתה מעט, הניחו את הצ'אק על ראש הדגימה ואפשרו לבלוק ה-OCT להגיע לטמפרטורה של ראש הדגימה למשך 30 דקות.
7. מניחים להב מיקרוטום במחזיק הלהב ומנקים את צלחת האנטירול. התאימו את מרחק צלחת האנטי-רול כדי לוודא שהרקמה עוברת ממש מתחת לצלחת במהלך החתך. לקבלת מידע נוסף על המיקום הנכון של צלחת האנטירול, עיין במדריך cryostat.
8. לאחר שגוש OCT התאקלם לטמפרטורת ראש הדגימה, התחילו לקצץ את בלוק ה-OCT עד שיגיעו לרקמה. כאשר הרקמה נראית לעין, עברו מחיתוך לחתך והתחילו לחתוך מקטעים של 30 מיקרומטר. הזז הצידה את לוחית האנטירול, ובאמצעות שקופית מיקרוסקופ, הרם את הקטע.
9. ממשיכים לחתוך ולאסוף קטעים עד להסתפק במיקום האנטומי של החלקים או שכל הרקמה נחתכה. יש להניח את המגלשות לייבוש בטמפרטורת החדר למשך 1-3 ימים. לאחר הייבוש, מניחים את המגלשות בקופסת החלקה ומניחים קופסה זו בשקית ניילון אטומה. תייג את השקית עם מזהה העכבר ופרטי הרקמות לפני הצבת המגלשות במקפיא העמוק של -80 מעלות צלזיוס.

7. צביעה אימונופלואורסצנטית

1. להפשיר את המגלשות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
2. מניחים את השקופיות בצנצנת החלקה אופקית ושוטפים את החלקים 3 פעמים ב- PBS במשך 10 דקות כל שטיפה בטמפרטורת החדר על שייקר.
3. הכן מאגר חסימה (2% BSA + 0.3% Triton-X-100 ב- 1x PBS). השתמש בכ-1 מ"ל לכל שקופית.
4. צרו תא לח על ידי הוספת מים לקרקעית. הניחו את המגלשות עם הפנים כלפי מעלה בצורה אופקית ואל תאפשרו להן להתייבש. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר חסימה לכל שקופית ודגרו למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר.
5. הכן תמיסת נוגדנים ראשונית על ידי דילול הנוגדן העיקרי במאגר נוגדנים (0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100 ב- 1x PBS).
   הערה: עבור הנוגדן α-סינוקלאין הזרחני, נעשה שימוש בגורם דילול של 1:500.
6. הוסף 200-300 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל שקופית. יש לכסות בכיסוי כדי לפזר את הנוגדן ולדגום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
7. למחרת, הסירו את המגלשות מהתא הלח והניחו אותן בצנצנת קופלין אנכית מלאה ב-1x PBS כדי לאפשר לכיסוי ליפול. עשו זאת עבור כל שקופית בנפרד והיזהרו שלא להפריע לחלק הרקמה בעת הסרת הכיסוי.
8. מניחים את השקופיות בצנצנת החלקה אופקית ושוטפים את החלקים 3 פעמים ב- PBS במשך 10 דקות כל שטיפה בטמפרטורת החדר על שייקר.
   הערה: יש לבצע את כל הצעדים הבאים כאשר האורות כבויים כדי למנוע הלבנת תמונה של הפלואורופור!
9. הכן את תמיסת הנוגדן המשני על ידי דילול הנוגדן המשני במאגר נוגדנים.
   הערה: לזיהוי α-סינוקלאין זרחני, נעשה שימוש במשני אנטי-ארנב המצומד ל-Alexa 488 עם מקדם דילול של 1:500 במאגר נוגדנים (0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100 ב-1x PBS).
10. הניחו את המגלשות אופקית בתא הלח והוסיפו 200-300 μL של תמיסת נוגדנים משנית לכל שקופית. יש לכסות בכיסוי כדי לפזר את הנוגדן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות לפחות.
11. הסירו את המגלשות מהתא הלח והניחו אותן בצנצנת קופלין אנכית מלאה ב-1x PBS כדי לאפשר לכיסוי ליפול. עשו זאת עבור כל שקופית בנפרד והיזהרו שלא להפריע לחלק הרקמה בעת הסרת הכיסוי.
12. מניחים את השקופיות בצנצנת החלקה אופקית ושוטפים את החלקים 3 פעמים ב- PBS במשך 10 דקות כל שטיפה בטמפרטורת החדר על שייקר.
13. יש לייבש את צד המגלשות על מגבת ולנער את עודפי ה-PBS.
14. הוסף 3 טיפות של מדיום הרכבה לכל שקופית. הוסיפו את הכיסוי ודחפו בעדינות את הבועות החוצה עם זוג מלקחיים על ידי לחיצה על הכיסוי לפני ההדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

תוצאות

זלוף באיכות גבוהה מצביע על היעדר דם בכבד, בחוט השדרה ובמבנים עמוקים של מערכת העצבים המרכזית (איור 4C ואיור 5G,H). דם שמור מתחת לדורה מאטר (לדוגמה, בתוך הסינוסים הוורידיים) או בין הדורה מאטר לגולגולת לא היה בעייתי מכיוון שדם זה אינו נמצא בתוך הפרנכימה המוחית. הדם שנראה באיור 4A ממוקם בין הגולגולת לחומר הדורה ולכן אינו בעייתי או מרמז על זלוף באיכות ירודה. המוח הטרי וחוט השדרה רכים למדי ונפגעים בקלות במהלך הטיפול. רקמות קבועות כראוי, לשם השוואה, הן מוצקות. כדי להעריך את איכות הרקמה ואת שימור המורפולוגיה של רקמות בשיטת זלוף זו, עבודה זו מדגימה את זיהוי α-סינוקלאין זרחני בחוט השדרה האמצעי והמותני של עכבר בן 15 חודשים ועכבר בן 7 חודשים המבטא את A53T האנושי α-סינוקלאין (איור 6).

המוטציה A53T מיוצגת יתר על המידה בחולים עם מחלת פרקינסון אוטוזומלית דומיננטית (PD). יתר על כן, α-סינוקלאין אנושי עם מוטציית A53T יכול לשחזר רבות מהתכונות של מחלת פרקינסון אנושית כאשר הן מבוטאות בעכברים ^6,7. זרחון של α-סינוקלאין בשאריות Serine 129 הוכח ב-in vivo וב-in vitro כדי לגרום לצבירה α-סינוקלאין⁸. גופי לוי הם הממצא ההיסטולוגי הקלאסי הקיים בחולים עם מחלת פרקינסון או דמנציה של גוף לוי⁹. רוב α-סינוקלאין הנמצא בגופי לוי הוא זרחן ב-Serine 129^10,11. כתוצאה מכך, הצטברות של α-סינוקלאין זרחני משמש כסמן לחומרה ההיסטולוגית של הפתולוגיה של PD. המחקר הנוכחי מצא כי α-סינוקלאין זרחני מצטבר ברמה גבוהה משמעותית בעכברים סימפטומטיים בני 15.5 חודשים ביחס לעכברים אסימפטומטיים בני 7 חודשים המבטאים α-סינוקלאין אנושיים מסוג A53T. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים המתארים העשרה של ציטופתולוגיה בקרניים הקדמיות של חוט השדרה ובמוח האמצעי של עכברים אלה. ⁶ מכאן, מסיק כי שיטת הזלוף הפשוטה המתוארת כאן מספקת קיבוע באיכות גבוהה של רקמות CNS לאפיון היסטולוגי במורד הזרם.

איור 6: תווית עבור α-סינוקלאין זרחני ברקמות של המוח האמצעי וחוט השדרה המותני ממודל עכברי של מחלת פרקינסון. העכבר המשותק בן ה-15.5 חודשים (בן 15.5 חודשים) מושווה לעכבר הבריא בן ה-7 חודשים. שני העכברים מבטאים גרסה מוטנטית מוטעית (A53T) של α-סינוקלאין אנושית הגורמת לפתולוגיה דמוית פרקינסון. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (לוחות עליונים) ו- 50 מיקרומטר (לוחות תחתונים). קיצור: α syn-A53T = מוטציה A53T של α-סינוקליין; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול; PS129 = סרין 129 זרחני של α-סינוקלאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

עבודה זו מתארת את השלבים הקריטיים לביצוע זלוף טרנסקרדיאלי. בעת בניית מנגנון הזלוף (פרוטוקול סעיף 1), חשוב להשתמש בצינורות גמישים מספיק כדי להיות חסום לחלוטין על ידי hemostat. ייתכן שחלק מהצינורות הנוקשים לא יהיו חסומים מספיק על ידי המוסטאט, ועדיין עשויים לאפשר ל-PFA לדלוף לתוך הקו הראשי במהלך פיזור ה-PBS הראשוני. בעת הכנת תמיסת ה-PFA של 4%, חשוב לוודא שה-pH הוא פיזיולוגי (7.4). מכיוון שהכנת תמיסת ה-PFA כוללת חימום ל-65 מעלות צלזיוס, יש לקרר את התמיסה בחזרה ל-25 מעלות צלזיוס לפני מדידת ה-pH מכיוון שזו הטמפרטורה שבה ה-pH מכויל על המונה.

בעת ביצוע החתך הראשוני לתוך הבטן, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע חתך של איברי הבטן (פרוטוקול סעיף 2). כאשר מנתחים בצורה מעולה לכיוון הסרעפת, חשוב להימנע מחתך של הכבד כפי שהוא נפוץ עבור הכבד להיות דבק עם דופן הבטן הקדמית. כדי להתגבר על כך, הכבד מנותח בזהירות ובבוטות מהקיר הקדמי לפני שהוא ממשיך בחתך לעבר הסרעפת. כאשר נכנסים לחלל החזה דרך הסרעפת, חשוב להימנע מחתך של הלב, כלי הדם הגדולים והריאה. כדי להימנע מכך, קצה המספריים נשמר באופן שטחי ובזווית חריפה עם בית הצלעות.

הנתיחה הראשונית לחשיפת הלב אורכת כ-2 דקות מהחתך הראשוני. צפוי כי במהלך תקופה זו, קצת אוויר נכנס לקצה מחט הפרפר. הכנסת אוויר זה למחזור הדם של העכבר תניב זלוף באיכות ירודה. לכן, זה קריטי כי הקו הראשי נפתח PBS הוא שוטף דרך המחט מיד לפני תותח של הלב כדי להסיר בועות אוויר. באופן אידיאלי, הלב משומר בעוד טפטוף PBS קטן זורם דרך קצה המחט כדי להבטיח היעדר מוחלט של אוויר בעת ניקוב LV.

כאשר המחט נכנסת ל- LV, אסור לה להעמיק כל כך כדי להכניס את קצה המחט לחדר הימני (RV). מיקום המחט ב-RV או מעבר למסתם המיטרלי יגרום ל"אינפלציה" מיידית של הריאות בעת הפעלת הזלוף. זה לא רצוי, ויש למשוך מעט את המחט כדי להבטיח מיקום LV. אם המחט ממוקמת כראוי, הריאות יישארו שטוחות לאורך כל הזלוף. כאשר זלוף הוא יזם, הוא ציין לפעמים כי נוזל ברור הוא מגיח מן הפה הפתוח של החיה. זה בדרך כלל בגלל לחץ זלוף כי הוא גבוה מדי או בשל חוסר מיקום של המחט בתוך הלב. החוקרים משערים כי לחצי זלוף גבוהים גורמים לפזרנות של הפרפוזט ממיטת הנימים העורקית ולזרימה מדרדרת של PBS דרך עץ הסימפונות אל תוך הוושט וחלל הפה.

יש להוריד את לחץ הזלוף על ידי הפחתת רמת ה-PBS בבקבוק ה-PBS או על ידי הורדת גובה בקבוק ה-PBS. לחלופין, אם המחט מונחת עמוק מדי לתוך החדר השמאלי, היא עשויה לעבור דרך המסתם המיטרלי ולהעביר את המחט לאטריום השמאלי. זה עלול לגרום לזרימה מדרדרת דרך הוורידים הריאתיים ולפזרנות של חדירה לתוך העורקים, כפי שתואר לעיל. ניקוי יסודי של הדם ממערכת הדם באמצעות PBS חשוב במיוחד כדי למנוע קישור צולב של מרכיבי הדם המושרה על ידי קיבוע וכתוצאה מכך חסימה של כלי הדם עם זלוף קבוע לאחר מכן. הסילוק מוערך ביעילות על ידי שינוי צבע של הכבד וזרימת PBS מחתך בבסיס הזנב הגחוני. פינוי הדם הוא בדרך כלל להשלים על ידי 3 דקות של זלוף עם PBS; עם זאת, אם סימנים חזותיים של אישור מתרחשים בזמנים קצרים יותר, אז fixative הוא הציג מוקדם יותר מ 3 דקות. זמני פינוי ארוכים יותר אינם מומלצים מכיוון שפיזור מתעכב מקבע מוביל לממצאים במבנה עדין CNS¹.

כאשר PFA מנוהל, חשוב לעקוב אחר רמת פתרון ה- PFA בבקבוק ה- PFA. מלאו את בקבוק ה-PFA אם רמת ה-PFA יורדת לפחות מ-4 ס"מ מעל פיו של בקבוק ה-PFA. לאחר השלמת הזלוף, יש לשטוף היטב את מנגנון הזלוף במים מזוקקים. זה חשוב מכיוון ש-PFA שיורי בקו הראשי יזהם את זילוף ה-PBS הראשוני ב-PFA ויגרום לזלוף באיכות ירודה. לבסוף, מחטי פרפר 25 גרם מומלצות בדרך כלל לעכברים בוגרים בגודל ממוצע בטווח של 20-30 גרם. עם זאת, עכברים גדולים או קטנים יותר עשויים לדרוש מחטי מד מעט גדולות יותר או קטנות יותר בנוסף להתאמת הבקבוקים המקבעים כדי לספק קצבי זרימה אופטימליים.

עבור דיסקציה של CNS והטמעת OCT (פרוטוקול סעיף 3), מקובל שרקמות חוט השדרה אינן שוקעות לחלוטין ב-30% סוכרוז. לכן רקמות אלה נשארות בסוכרוז במשך יומיים ולאחר מכן מוטבעות ב- OCT, ללא קשר אם הן שוקעות או לא. כאשר מקפיאים רקמות ב-OCT, ייתכן שרקמות מסוימות עלולות להיסדק כאשר הן ממוקמות בקירור 2-מתילבוטאן. זה נפוץ יותר עם המוח ובדרך כלל מתרחשת כאשר יותר מדי OCT ממוקם על הרקמה. כדי להימנע מכך, הניחו רק מספיק OCT כדי לכסות את משטחי הרקמה לפני הקפאה מיידית. בפרוטוקולים מסוימים, פיצוח נפוץ פחות למרות טבילה מוחלטת ב- OCT. זה בדרך כלל נובע משיטת הקפאה איטית יותר, למשל בעת שימוש ב-2-מתילבוטאן מקורר קרח יבש או הנחת הקריומולד על גוש קרח יבש ישירות. 2-מתילבוטאן מקורר בחנקן נוזלי מועדף בעבודה זו מכיוון שקצב ההקפאה מהיר יותר באופן משמעותי ועשוי לשמר טוב יותר את המורפולוגיה של הרקמות מאשר שיטות הקפאה איטיות יותר.

בעת הפשרה של הרקמה (פרוטוקול סעיף 4), חשוב להימנע ממחזורי הפשרה מרובים של הקפאה. לכן, זה אופטימלי לחתוך את כל החלקים מגוש OCT יחיד כדי לקבל אזור מוח מסוים לניתוח במקום להפשיר ולהפשיר מחדש אזורים נבחרים. אם זה לא בר קיימא, לאחר קבלת כמה קטעים, משתמשים יכולים להקפיא מחדש ולאחסן את בלוקי OCT במקפיא העמוק של -80 מעלות צלזיוס 1-2 פעמים נוספות לשימוש עתידי.

היתרונות העיקריים של שיטה זו על פני משאבה מסורתית יותר או אספקת לחץ אוויר של perfusate הם כדלקמן: (1) עלות נמוכה ונגישות של מנגנון הזלוף. (2) המשתמשים אינם צריכים לשמור באופן ידני על הלחץ במנגנון הזלוף לאורך כל הזלוף. (3) לחץ פרפוזיה נמוך ועקבי יותר מחלופות זולות אחרות לזלוף כגון באמצעות אספקת מזרקים. על פי משוואת ברנולי, מחושב כי מנגנון הזלוף הניזון מכוח הכבידה שנבנה כאן ישמור על לחץ פרפוזיה של כ-73 מ"מ כספית כאשר בקבוקי הפרפוזט ממוקמים בגובה של מטר אחד ביחס למחט. בהתחשב בכך שזה נמוך משמעותית מלחץ הדם הסיסטולי של בעלי חיים אלה, לחץ זלוף זה הוא ככל הנראה נמוך מספיק כדי למנוע קרע בכלי הדם¹².

המחברים השתמשו עד כה בהצלחה במערכת זלוף זו כדי לזהות נוכחות של α-סינוקלאין זרחני במודל עכברי של מחלת פרקינסון. במהלך תקופה זו, לא נתקלו במגבלות משמעותיות בשיטת זלוף זו שאינן קיימות בשיטת אספקת זילוף משאבה. המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא האופי הגוזל זמן של פרפוזיה לעומת קיבוע טיפה. טכניקה זו עדיפה על קיבוע טיפה שכן פרפוזיה גורמת לחדירה עמוקה יותר של מקבעים למבני מערכת העצבים המרכזית. מגבלה שנייה של טכניקה זו היא שהיא דורשת מיומנות כירורגית מסוימת כדי לבצע, שכן הלב חייב להיות משומר במהירות לאחר הכניסה לחלל בית החזה. עם זאת, עם ניסיון, משתמשים מאומנים יכולים באופן שגרתי canulating את הלב בתוך דקה אחת של החתך הראשוני לתוך הבטן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound	Fisher Scientific	NC1029572
Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors	Amazon	B0752XHK2X	"fine scissors"
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G	Fisher Scientific	14-826-5D
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826B
Corning PES Syringe Filters	Fisher Scientific	09-754-29
Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x	Fisher Scientific	SH30258
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	"curved fenestrated forceps"
Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisher Scientific	16-100-123	"curved fine forceps"
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122	"straight fine forceps"
Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends	Fisher Scientific	21-401-5
Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates	Fisher Scientific	FB966J
Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50	Fisher Scientific	12-548-5M
Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel	Fisher Scientific	13-820-074	"skin forceps"
Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks	Fisher Scientific	FB3002000
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-951-20	"dissecting scissors"
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464
Fisherbrand Straight Locking Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in.	Fisher Scientific	14-174-1C
Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles	Fisher Scientific	09-790-12F
Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID - Polypropylene - QC	Fisher Scientific	01-000-686
Garvey Economy Single Edge Cutter Blade	Amazon	B001GXFAEQ
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488	ThermoFisher Scientific	35552
Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps	Fisher Scientific	14-198-5A	"hose clamps"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable	Fisher Scientific	NC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set	Fisher Scientific	22-010-137	"butterfly needle"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666
Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Fisher Scientific	P36962
Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles	ThermoFisher Scientific	2425-0506	"buffer bottles"
PAP pen	abcam	ab2601
Paraformaldehyde Granular	Electron Microscopy Systems	19210
Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm	Fisher Scientific	15-242D
Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y]	abcam	ab51253
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465-2.5kg
Stainless Steel Drinking Cup 18-oz	amazon	B0039PPO9U
Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1	Us Biological	S8010
Triton X-100	Us Biological	T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP	MWI Animal Health	502017