שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

Summary

תהליך עבודה מקיף של פרוטוקול מעבדה וניתוח מתוארים לבדיקה מהירה, חסכונית ופשוטה המבוססת על תאים צבעוניים כדי לזהות אלמנטים מנטרלים מול AAV6.

Abstract

וירוסים הקשורים אדנו רקומביננטי (rAAV) הוכיחו להיות וקטור בטוח ומוצלח להעברת חומר גנטי לטיפול במצבים בריאותיים שונים הן במעבדה והן במרפאה. עם זאת, נוגדנים מנטרלים קיימים (NAbs) נגד קפסידי AAV מהווים אתגר מתמשך לניהול מוצלח של טיפולים גנטיים הן במודלים ניסיוניים של בעלי חיים גדולים והן באוכלוסיות אנושיות. סינון ראשוני עבור חסינות מארח נגד AAV יש צורך להבטיח את היעילות של טיפולים גנטיים מבוססי AAV הן ככלי מחקר והן כסוכן טיפולי בר קיימא מבחינה קלינית. פרוטוקול זה מתאר בדיקת אין ויטרו צבעונית כדי לזהות גורמים מנטרלים מול סרוטיפ AAV 6 (AAV6). הבדיקה מנצלת את התגובה בין AAV קידוד גן פוספטאז אלקליין (AP) כתב ואת המצע שלה NBT / BCIP, אשר מייצר כתם סגול מסיס לכימות על שילוב.

בפרוטוקול זה, דגימות סרום משולבות עם AAV המביע AP ודגר כדי לאפשר פעילות נטרול פוטנציאלית להתרחש. תערובת סרום וירוס מתווסף לאחר מכן לתאים כדי לאפשר transduction ויראלי של כל AAVs שלא נוטרלו. מצע NBT/ BCIP מתווסף ועובר תגובה כרומוגנית, המתאימה לפעילות טרנסדוקציה ויראלית ונטרול. חלקו היחסי של האזור הצבעוני הוא כמות באמצעות כלי תוכנה חופשית כדי ליצור titers מנטרל. בדיקה זו מציגה מתאם חיובי חזק בין צבע לריכוז ויראלי. הערכת דגימות סרום מכבשים לפני ואחרי מתן AAV6 רקומביננטי הובילה לעלייה דרמטית בנטרול הפעילות (עלייה של פי 125 עד >10,000). הבדיקה הפגינה רגישות נאותה לזיהוי פעילות מנטרלת בדילול סרום >1:32,000. בדיקה זו מספקת שיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לזיהוי NAbs נגד AAVs.

Introduction

וירוסים הקשורים אדנו (AAV) משמשים יותר ויותר וקטורים להעברת טיפולים גנטיים לטיפולים משפטיים עבור מצבים בריאותיים שונים המשפיעים על הלב וכלי הדם, הריאות, מחזור הדם, העין, ומערכות העצבים המרכזיות1,2,3,4,5. הפופולריות של וקטורים AAV כפלטפורמה מובילה לטיפול גנטי נובעת מפרופיל הבטיחות החיובי שלהם, ביטוי טרנסג'ן לטווח ארוך, וטרופיזם רחב היקף ספציפי ^{לרקמות1,6}. תוצאות מוצלחות במחקרים בבעלי חיים סללו את הדרך ליותר מחמישים ניסויים קליניים של טיפול גנטי AAV שהגיעו בהצלחה לנקודות הקצה של היעילות ^שלהם7, כמו גם את שחרורו של התרופה הראשונה לטיפול גנטי AAV הזמינה מסחרית שאושרה על ידי מינהל המזון והתרופות ^{האמריקאי8}. בעקבות ההצלחות הראשוניות, AAV המשיכה לצבור תאוצה במגזרי המחקר הבסיסיים והקליניים כווקטור בחירה וכיום היא היחידה בטיפול הגנטי של vivo שאושר לשימוש קליני בארה"ב ^{ובאירופה9}. עם זאת, נוכחותם של נוגדנים מנטרלים קיימים (NAbs) נגד קפסידים וקטוריים של AAV נותרה מכשול הן למחקר הפרה-קליני והן ליעילות הניסויים הקליניים. NAbs נמצאים הן באוכלוסיות אנושיות נאיביות והן באוכלוסיות בעלי חיים ומעכבים את העברת הגנים בעקבות ניהול vivo של וקטור ^AAV1. AAV seropositivity הוא קריטריון בלעדיה עבור רוב הניסויים בריפוי גנטי, ולכן סינון ראשוני עבור חסינות מארח הוא קריטי הן במעבדה והן במרפאה. הקמת בדיקה שיכולה לזהות את נוכחותם של NAbs נגד AAV היא צעד חיוני בצנרת של כל פרויקט מחקר מבוסס טיפול גנטי AAV. דו"ח זה מתמקד AAV6 אשר כבר עניין לחוקרים בשל transduction יעיל וסלקטיבי שלה שריר מפוספס (שריר הלב והשלד)^{1,10,10,11,12}. ריפוי גנטי נחשב אסטרטגיה מבטיחה למיקוד הלב כי קשה למקד באופן ספציפי את הלב ללא הליכי לב פתוח פולשניים.

נטרול פעילות נקבע בדרך כלל באמצעות או אין ויטרו מבוסס תא או in vivo transduction עיכוב בדיקה. In vivo בדיקות NAb כוללות בדרך כלל מתן סרום מנושא ניסוי (למשל, אדם או בעל חיים גדול) לעכברים, ואחריו AAV עם גן עיתונאי, ואחריו בדיקות לביטוי של הגן העיתונאי או אנטיגן מתאים. בדיקות במבחנה לקבוע NAb titers על ידי דגירה סרום או פלזמה מבעל חיים אנושי או גדול בדילולים סדרתיים עם AAV רקומביננטי (rAAV) המבטא גן עיתונאי. תאים נגועים בתערובת הסרום/ וירוס, ואת המידה שבה ביטוי הגנים הכתב הוא מוערך לעומת פקדים. בדיקות הפריה חוץ גופית נמצאות בשימוש נרחב להקרנת NAb בשל העלות הנמוכה יחסית שלהן, מהירות הבדיקות ויכולת גדולה יותר לתקנון ^{ולאימות13,14} בהשוואה לבדיקות vivo. בבדיקות vivo מדווחים לעתים קרובות יש רגישות רבה יותר ^15,16, אבל אותה טענה הועלתה לגבי בדיקות במבחנה ^14,17.

עד כה, אין ויטרו NAb assays השתמשו בעיקר אור (לוציפראז) כגן הכתב כדי לזהות נטרול. למרות שלשיטה מבוססת אור יש ערך בהקשרים רבים, בדיקת NAb צבעונית/כרומוגנית עשויה להיות יתרון בנסיבות מסוימות. בדיקות צבעוניות להערכת נטרול הועסקו בהצלחה עבור וירוסים אחרים כגון שפעת ^{ואדנווירוס18,19}. האטרקטיביות שלהם נובעת מהפשטות שלהם, העלות הנמוכה יותר, והדרישה למנגנוני מעבדה וכלים יומיומיים ^בלבד20. בדיקות NAb המשתמשות בגן עיתונאי מבוסס זוהר דורשות ערכות מצע יקרות, לומינומטר ותוכנה מתאימה ^{לניתוח21}. בדיקה צבעונית זו יש את היתרון של רק צורך מיקרוסקופ אור ומצע זול מאוד. דיווח על הרגישות של בדיקות צבע לעומת זוהרות הניב תוצאות סותרות. מחקר אחד הציע בדיקות ELISA מבוססות אור להציג רגישות רבה יותר ושחזור דומה לבדיקות ^צבע22, בעוד אחר מצא צבע מבוסס ELISA בדיקות להעניק רגישות רבה ^יותר23. כאן, פרוטוקול מפורט עבור בדיקת במבחנה NAb נגד AAV המשתמש בתגובה הכרומוגנית בין AAV קידוד פוספטאז אלקליין (AP) גן כתב טטרזוליום כחול ניטרו /5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט (NBT / BCIP) מסופק. פרוטוקול שלב אחר שלב זה פותח בהתבסס על דו"ח קודם שהשתמש בגן עיתונאי hPLAP (פוספטאז אלקליין שליה אנושית) (AAV6-hPLAP) כדי לזהות נטרול פעילות נגד ^AAV24. בדיקה זו היא חסכונית, חסכונית בזמן, קלה להתקנה, ודורשת מיומנויות טכניות מינימליות, ציוד מעבדה ורגנטים. יתר על כן, הפשטות של בדיקה זו נותנת לו את הפוטנציאל להיות ממוטב עבור יישומים רחבים על פני סוגים שונים של תאים, רקמות, או סרוטיפים ויראליים.

Protocol

כל ההיבטים של טיפול בבעלי חיים וניסויים נערכו בעקבות הנחיות מכון פלורי למדעי המוח ובריאות הנפש והקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות לאחר ^{התייחסות25}. מרינו ewes בן 1.5-3 שנים שימשו למחקר. סקירה סכמטית של פרוטוקול הבדיקה מסופקת באיור 1.

איור 1: דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול בדיקת NAb. (א) ייצוג חזותי של בדיקת NAb הממחישה את השלבים העיקריים הכרוכים בפרוטוקול בן שלושת הימים. בקצרה, תאים גדלים מצופים בן לילה. למחרת, דילול סדרתי של סרום מוכנים, דגירה עם AAV, ולאחר מכן דגירה עם התאים לילה. למחרת, תאים קבועים, נשטפים, דוגרים, משולבים עם המצע, ומדגרים שוב, ואחריו הדמיה וכמות. (B) תמונות מייצגות של בקרת אות מינימלית (עיכוב AAV מלא), בקרת אות מקסימלית (ללא עיכוב), ודגימת סרום ביצית עם כ-50% עיכוב אות. סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנה ראשונית

1. להערכה בכבשים: לאסוף דם בצינורות מפעיל קריש מ"ל מפריד סרום 8 מ"ל (ראה טבלת חומרים), להשאיר את דגימת הדם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20-30 דקות, ולאחר מכן לסובב למטה ב 2,100 x g במשך 15 דקות. הסופר-נרטיב הברור שנוצר בחלק העליון של הצינורות הוא סרום. Aliquot את השלב מימית ברור לתוך צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
   הערה: הסרום בטמפרטורה של -80 °C נשאר יציב במשך ~ 5 שנים. דם נאסף מן הווריד התרדמה באמצעות מחט 16 G (קצה מנותק) ומזרק מבעלי חיים מודעים.
2. מחממים סרום בקר עוברי (FBS) מחממים אותו באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומסתובבים לסירוגין. ליתר דיוק, הניחו מדחום בבקבוק שני המכיל נפח מים שווה ערך והוסיפו אותו לאמבטיית החום באותו זמן כמו בקבוק ה- FBS. התחל תזמון כאשר המדחום מגיע 56 °C (56 °F).
3. השתמש בטכניקה אספטית מתאימה ובתרגול תרבית תאים עבור כל השלבים הבאים שבוצעו במכסה המנוע של תרבית ^{התאים26,27}. יש לרסס 70% אתנול על כל החפצים ועל מכסה המנוע לפני השימוש ולנקות עם 1% נתרן היפוכלוריט בסיום.
4. הפוך את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco על ידי שילוב של גלוקוז גבוה (4.5 גרם / ליטר) DMEM (89%) עם FBS מושבת בחום (10%) וסטרפטומיצין פניצילין (1%). לשלב ולסנן באמצעות מערכת סינון ואקום סטרילית (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר, קרום פוליאתרסלפפון) (ראה טבלת חומרים). יש לאחסן DMEM מלא עטוף בנייר כסף בטמפרטורה של 4 °C (60 °F).
5. צור תאי HT1080 (ראה טבלת חומרים) ומעבר בבקבוק מרובע בגודל 75 ס"^מ2 כמתואר ^{בהפניה28}. צור מלאי קפוא מרובה של תאים. אין להשתמש בתאים לאחר 20 קטעים, שכן מעבר נוסף עשוי להשפיע על תוצאות הבדיקה.

2. יום 1 - ציפוי תאים

1. מעבר תאי HT1080 כאשר הם מגיעים ~ 80% מפגש.
2. DMEM מלא מראש (מוכן בשלב 1.4), 0.05% טריפסין-EDTA, ו 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עד 37 °C (37 °C (37 °F) באמבט מים. הסר את מדיום הצמיחה מתאים שעברו באמצעות מערכת שאיפה.
   הערה: כל השאיפה בפרוטוקול זה משתמשת במערכת ואקום עם צינור המחובר לפיפטה סרולוגית סטרילית של 5 מ"ל.
3. לשטוף את התאים ב 10 מ"ל של טרום מחומם (37 °C) 1x PBS ו trypsinize תאים במשך 3-4 דקות ב 4 מ"ל של טרום מחומם 0.05% טריפסין-EDTA לנתק את התאים מן הבקבוק.
4. להשבית את הטריפסין על ידי הוספת 6 מ"ל של DMEM מלא שחומם מראש ופיפטה התאים לתוך צינור 50 מ"ל. חשב את המספר והריכוז של תאים קיימא באמצעות hemocytometer ואת שיטת אי הכללה כחול ^{טריפאן29}.
5. לדלל את התאים לריכוז של 1 x ¹⁰⁵ תאים / מ"ל ב DMEM מלא שחומם מראש. זרע 100 μL של תאים / גם לתוך לוחות ברורים 96-well שטוח תחתית (1 x ¹⁰⁴ תאים לבאר). לדגור על הצלחת ב 37 °C (5 °F), 5% דו תחמוצת הפחמן (_CO2) לילה עבור 16-22 שעות.

3. יום 2 - הדבקת התאים

1. הסר צלחת / s מן האינקובטור ולהשתמש מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי תאים מפוזרים באופן שווה בתוך הבארות וכי המפגש הוא ~ 50%. אם תאים אינם בטווח של 45%-55% מפגש, חזור על פרוטוקול 'יום 1' והתאם את ריכוז התא ההתחלתי בהתאם.
2. צור דילול סדרתי של דגימות סרום של עניין בצינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל באמצעות DMEM מלא שחומם מראש כמו דילול. טבלה 1 מדגימה את היצירה של מפל דילול עבור דוגמאות משולשות.
   1. כדי לבצע את הבדיקה בשלושה עותקים, הכן 7.5 x ¹⁰⁶ גנומים וקטוריים (vg)/μL של פתרון עבודה של AAV6-hPLAP (ראה טבלת חומרים) על-ידי דילול פתרון מלאי וירוסים ב- 1x PBS.
   2. הוסף 66 μL של 7.5 x ¹⁰⁶ vg / μL וירוס עובד פתרון לכל צינור המכיל 264 μL של סרום / דילול מדיה (330 μL של נפח הכולל / דילול, ראה טבלה 1).
      הערה: זוהי בדיקה חזקה שאינה דורשת תנאי תרבות מושלמים. עם זאת, כדי לחשב במדויק ולהבטיח שכל ריצת בדיקה אמינה, יש צורך לכלול את הדברים הבאים: (1) בקרת וירוס ומדיה בלבד, (2) בקרת מדיה בלבד, ו-(3) דגימת בקרה חיובית של NAb על כל הלוחות באותם תנאי ניסוי. הנפח המתואר (330 μL) מהווה דגימות משולשות +10% מתערובת הסרום והוירוסים. ביצוע שכפולים מומלץ מאוד לקביעה מדויקת של נטרול פעילות.
3. מערבבים את דילול הנגיף/סרום על ידי צנרת ומניחים את הצינורות המכילים את תערובות הנגיף / סרום בחממה ב 37 °C (57 °F), 5% _CO2 במשך 30 דקות כדי לאפשר נטרול פוטנציאלי להתרחש.
4. Pipette 100 μL של תערובת וירוס / סרום לכל באר על צלחת 96-well המכיל 1 x ¹⁰⁴ תאים / טוב עבור כל דילול.
   הערה: זה ייצור ריכוז ויראלי סופי של וירוסים 15k / ריבוי תאים של זיהום (MOI) בכל באר. טבלה 2 מספקת פריסת לוח מדגם לדוגמה של 96 באר לדוגמה להערכת דוגמאות לדילול של 1/512.
5. עוטפים את הצלחת המכילה תאים, סרום ו-AAV-hPLAP בנייר כסף ומניחים באינקובטור ב-37°C, 5% _CO2 במהלך הלילה למשך 16-24 שעות כדי לאפשר כניסת AAV לתאים.

תווית מדורגת דילול	דילול	3 x מדגם (240 μL) + 10% נפח מאגר (24 μL)	יחס סרום:מדיה
דילול 1 (D1)	1/2	264 μL סרום 264 μL מדיה	50:50
דילול 2 (D2)	1/4	264 μL D1 + 264 μL מדיה	25:75
דילול 3 (D3)	1/8	264 μL D2 +264μL מדיה	12.5:87.5
דילול 4 (D4)	1/16	264 μL D3 +264 μL מדיה	6.25:93.75
דילול 5 (D5)	1/32	264 μL D4 +264 μL מדיה	3.13:96.87
דילול 6 (D6)	1/64	264 μL D5 +264 μL מדיה	1.56:98.44
דילול 7 (D7)	1/128	264 μL D5 +264 μL מדיה	0.78:99.22
דילול 8 (D8)	1/256	264 μL D5 +264 μL מדיה	0.39:99.61
דילול 9 (D9)	1/512	264 μL D7 + 264 μL מדיה	0.2:99.8
דילול 10 (D10)	1/2048	132 μL D8 + 396 μL מדיה	0.05:99.95
דילול 11 (D11)	1/8192	132 μL D9 + 396 μL מדיה	0.01:99.99
דילול 12 (D12)	1/32768	132 μL D10 + 396 μL מדיה	0.003:99.997

טבלה 1: כמויות של סרום ודילול נדרשים כדי ליצור דילול סדרתי של סרום בשלושה עותקים.

דגימת סרום מס' 1

דגימת סרום מס' 2

דגימת סרום מס' 3

מונו AB (mAB), פקדים ודגימות נוספות

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ננוגרם של MAb

50 ננוגרם של MAb

50 ננוגרם של MAb

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ננוגרם MAb

5 ננוגרם MAb

5 ננוגרם MAb

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

דוגמה מס' 1 1/512

דוגמה מס' 1 1/512

דוגמה מס' 1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

מדגם מס' 2 1/512

מדגם מס' 2 1/512

מדגם מס' 2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

מדגם מס' 3 1/512

מדגם מס' 3 1/512

מדגם מס' 3 1/512

טבלה 2: פריסת צלחת דוגמה של 96 באר להערכת דגימות סרום נאיביות בדילולים הנעים בין 1/2 ל-1/512. דילולים גבוהים יותר משולבים בבדיקה אם מעריכים מדגם הידוע כחיובי עבור AAV NAbs (דגימות לאחר מתן ניהול) או אם נדרש טיטר גבוה יותר. MO (-C): בקרת מדיה בלבד. VO (+C): שליטה בווירוסים ומדיה בלבד. mAb: נוגדן חד שבטי נגד AAV (שליטה חיובית NAb).

4. יום 3 - תיקון והוספת מצע לתאים

1. מחממים מראש aliquot של 1x PBS עד 37 °C (~ 25 מ"ל / 96 -צלחת היטב). צלחת מגניבה ונפרדת של PBS (כ-25 מ"ל/96-well) _ו-H2O מזוקק כפול (DDW, כ-25 מ"ל/96-well plate) עד 4 °C (4 °F). להמיס גלולה של BCIP / NBT (ראה טבלת חומרים) ב 10 מ"ל של DDW בצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל על ידי מערבולת (10 מ"ל מספיק עבור 2 x 96 לוחות באר).
2. שאפו את המדיה מהבארות של צלחת 96 באר באמצעות פיפטה סרולוגית או דומה מחובר למערכת שאיפה מבוססת יניקה או ואקום מכסה המנוע אדים. מניחים בעדינות את קצה הפיפטה הסרולוגית לתוך הבאר ומסירים את המדיה תוך זהירות שלא לשבש את התאים הדבוקים.
   1. הוסף 50 μL של RT 4% PFA לכל באר באמצעות פיפטה. לעטוף את הצלחת בנייר כסף ולהשאיר אותו ב RT במשך 10 דקות כדי לתקן את התאים.
      אזהרה: Paraformaldehyde (PFA) הוא מסרטן סביר והוא רעיל מקשר עור או עין או שאיפה. יש לטפל במכסה המנוע של אדים עם ציוד מגן אישי מתאים ומסכת פנים. הפוך טרי 4% PFA מדולל PBS (~ 7 מ"ל נדרש לכל צלחת 96-well).
3. לשטוף ולשאוף את התאים עם 200 μL של RT 1x PBS. חזור על שלב זה פעמיים.
   הערה: פיפטה רב-ערוצית היא אפשרות יעילה לשלבי הצנרת.
4. Pipette 200 μL של PBS שחומם מראש לתוך כל באר, לעטוף את הצלחת בנייר כסף ודגור ב 65 °C (65 °F) במשך 90 דקות כדי denature פעילות פוספטאז אלקליין ^{אנדוגני30}.
5. שאיפה בארות ולשטוף תאים עם 200 μL של קור (4 °C )) PBS. לשאוף שוב, לשטוף ב 200 μl של DDW קר, ולשאוף שוב.
6. פיפטה 50 μL של BCIP / NBT מומס (מוכן בשלב 4.1) לתוך כל באר.
7. עוטפים את הצלחת בנייר כסף ודגורים ב-RT למשך 2-24 שעות.
   הערה: להיות עקבי עם זמן הדגירה בין ריצות; גמישות הזמן מאפשרת למשתמשים לצלם בארות ביום 3 או למחרת.
8. באמצעות מצלמת מיקרוסקופ אור, צלם תמונות של כל באר באמצעות עדשה אובייקטיבית של 4x, מה שמבטיח שאותה חשיפה, איזון לבן והגדרות אור ישמשו באופן עקבי עבור כל הבדיקות המבוצעות.
   1. מקם כל באר באופן זהה וודא ששולי הבאר אינם נראים בתמונות. שמור תמונות בתבנית TIF או דומה.
      הערה: הגדרות ספציפיות ישתנו בין מיקרוסקופים, אך הכמות תהיה היעילה ביותר אם תאורת הרקע גבוהה ועקבית בכל הבארות (איור 1B).

5. כמות לקביעת הפעילות המנטרלת באמצעות ImageJ

1. הורד והתקן את התוכנה הזמינה באופן חופשי "ImageJ" (ראה טבלת חומרים).
2. פתחו את התמונה לניתוח ב-ImageJ על-ידי בחירה באפשרות 'קובץ > פתוח' (איור 2).
3. בשעת שימוש בתמונות צבעוניות, המר לגווני אפור על-ידי בחירה באפשרות 'תמונה' > 'אות' > 8 סיביות.
4. לחץ על תמונה > התאם סף >. התאם את הסף עד שכל האזורים הצבעוניים ייצבעו באדום, אך הרקע לא. עם הוספת NBT / BCIP, המוצר הצבעוני יופקד באזור סביב התאים המבטאים hPLAP.
   הערה: מומלץ להשתמש באותה הגדרת סף עבור כל התמונות שצולמו באותה צלחת.
5. לחץ על נתח > הגדר מדידות וסמן את תיבות הסימון אזור, הגבל לסף, שבר שטח והצג תוויות ולחץ על אישור.
6. כדי לקבוע את קריאת האות (אחוז הצבע) של באר נתונה, לחץ על נתח > למדוד. העמודה '% אזור' בחלון המוקפץ מציגה את קריאת האות.
7. בצע כמות עבור כל העותקים המשוכפלים לדוגמה. אל תכלול בארות מזוהמות, בארות המציגות התפלגות תאים לא אחידה, או בארות המשתנות בצפיפות התא או בתאורה.
   הערה: ראה איור משלים 1 לקבלת דוגמאות של בארות שיש לשקול להחרגה. בדרך כלל, 3-4 בארות עשויות לדרוש הרחקה מצלחת של 96 בארות. איור 2 מספק ייצוג חזותי של תהליך הכמויות באמצעות ImageJ.

איור 2: שלבים לקביעת צביעת אחוזים באמצעות תוכנת ImageJ. (א) פתח את התמונה לניתוח באמצעות תוכנת ImageJ. (B) המר את התמונה לגווני אפור של 8 סיביות. (ג) פתח את חלון הסף. (D) התאם את הסף המרבי כך שכל האזורים הצבעוניים מכוסים, אך אזור הרקע אינו (סף זה צריך להיות עקבי על-פני לוח שלם). (ה) בחר את תיבת הטיפות 'ניתוח', לחץ על 'הגדר מדידות' וסמן 'אזור', 'שבר שטח', 'סף הגבלה' ו'תווית תצוגה', ולחץ על 'אישור'. (ו) לחץ על 'מדידה' כדי למדוד את האזור המקורה. האזור %מציין את חלקה היחסי של התמונה שנצבעה. לאחר מכן ניתן להשתמש באפשרות זו עם דוגמאות הבקרה כדי לקבוע את טיטר _TI50 . לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6. קביעת עיכוב טרנסדוקציה (_TI50) טיטר

1. קבע את הקריאה הממוצעת ממשכפלים (באמצעות השלבים המתוארים בשלב 5) עבור הפריטים הבאים: (1) פקד מדיה בלבד (קריאת אות בסיסית). (2) וירוס + בקרת מדיה בלבד (קריאת אותות מקסימלית). (3) וירוס + דגימות סרום של עניין.
2. חשב את אחוז העיכוב באמצעות הנוסחה הבאה:
   100 - [(בדיקת קריאת אות מדגם מדגם (וירוס + מדגם סרום של עניין) - קריאת אות בסיסית (בקרת מדיה בלבד)) / (קריאת אות מקסימלית (מדיה ווירוס בלבד) - קריאת אות בסיסית) x 100] = % עיכוב ^{Transduction13}.
3. חשב את עיכוב התמרת % מכל השכפולים של כל דילול עבור כל הדגימות באמצעות הנוסחה ב- 6.2. לקבוע את עיכוב transduction הממוצע בין העתקים טכניים עבור כל דילול עבור כל הדגימות והפקדים.
4. חשב את 50% עיכוב transduction עיכוב titer (_TI50 titer) של מדגם של עניין על ידי קביעת הדילול הנמוך ביותר של המדגם המניב 50% או יותר עיכוב transduction של פעילות hPLAP. לדוגמה, אם דילול של 1/8 של מדגם יש יותר מ 50% עיכוב transduction בהתבסס על החישוב שבוצע ב 6.2 (ודילול 1/4 לא), לדווח על Titer _TI50 כמו 1/8.

7. קביעת חלקיקי AAV מנוטרלים

1. חשב את מספר חלקיקי AAV מנוטרלים לכל μL של סרום עבור מדגם נתון על ידי שימוש בנוסחה הבאה:
   ((MOI x ספירת תאים/טוב) / (נפח של סרום / גורם דילול של _TI50 titer)) / 2 = חלקיקי AAV מנוטרלים / μL של ^סרום9.
   הערה: חלוקה ב- 2 חשבונות עבור _TI50 המודד 50% מהחלקיקים המנוטרלים. עבור מדגם שנותן _TI50 titer של 1/4 (25% סרום, 75% דילול) שבו הבדיקה השתמשה 80 μL של סרום לא מדולל MOI של 15k מצופה על 1 x ¹⁰⁴ תאים, החישוב הבא ישמש: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3.75x106 חלקיקים מנוטרלים / μL של סרום.

תוצאות

בדיקת Transduction כדי לקבוע את המינון הנגיפי האופטימלי לכיסוי צלחת
תאי HT1080, קו תאי פיברוסרקומה מבוסס היטב, נבחרו לבדיקה זו. ריכוז של 1 x ¹⁰⁴ HT1080 תאים / היטב סיפק ~ 50% מפגש תאים בכל באר של צלחת 96-well. כדי לקבוע את הריכוז הנגיפי האופטימלי עבור הבדיקה, rAAV קידוד hPLAP (פוספטאז אלקליין שליה אנו...

Discussion

דו"ח זה מתאר בדיקה צבעונית המעריכת את מידת נטרול AAV במדגם סרום נתון על ידי הערכת תגובה כרומוגנית המתאימה למידת התמרת הנגיף במבחנה. פיתוח הפרוטוקול התבסס על התגובה הכרומוגנית הידועה בין האנזים פוספטאז אלקליין לבין NBT/BCIP, אשר נעשה בו שימוש נרחב ככלי מכתים לאיתור מטרות חלבון ביישומים כגו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin/EDTA	Gibco	25300-054
50 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-432-22	Or equivalent
75 cm2 square flasks	Falcon	353136	Or equivalent
96 well flat bottomed plate	Falcon	353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector			Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)	PROGEN	610159	Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT	SIGMAFAST	B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette			5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965118
HT1080 cells	ATCC
ImageJ Software			Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator			37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera			Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven			For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde	MERCK	30525-89-4
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips			20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter	Millipore	S2GPU10RE	Used for combining media reagents
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator	Greiner BIO-ONE	455071	Used for serum collection & processing from sheep
Water bath