Un metodo passo-passo per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV utilizzando un test colorimetrico basato su cellule

Riepilogo

Un protocollo di laboratorio completo e un flusso di lavoro di analisi sono descritti per un test colorimetrico basato su cellule rapido, economico e semplice per rilevare elementi neutralizzanti rispetto ad AAV6.

Abstract

I virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) hanno dimostrato di essere un vettore sicuro e di successo per il trasferimento di materiale genetico per il trattamento di varie condizioni di salute sia in laboratorio che in clinica. Tuttavia, gli anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi AAV rappresentano una sfida continua per la somministrazione di successo delle terapie geniche sia in modelli sperimentali su grandi animali che in popolazioni umane. Lo screening preliminare per l'immunità dell'ospite contro l'AAV è necessario per garantire l'efficacia delle terapie geniche basate su AAV sia come strumento di ricerca che come agente terapeutico clinicamente valido. Questo protocollo descrive un test colorimetrico in vitro per rilevare fattori neutralizzanti contro il sierotipo 6 AAV (AAV6). Il test utilizza la reazione tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e il suo substrato NBT / BCIP, che genera una macchia viola quantificabile insolubile sulla combinazione.

In questo protocollo, i campioni di siero sono combinati con un AP che esprime AAV e incubati per consentire il verificarsi di una potenziale attività neutralizzante. La miscela di siero virale viene successivamente aggiunta alle cellule per consentire la trasduzione virale di eventuali AAV che non sono stati neutralizzati. Il substrato NBT/BCIP viene aggiunto e subisce una reazione cromogenica, corrispondente alla trasduzione virale e all'attività neutralizzante. La proporzione di area colorata viene quantificata utilizzando uno strumento software libero per generare titoli neutralizzanti. Questo test mostra una forte correlazione positiva tra colorazione e concentrazione virale. La valutazione di campioni di siero di pecora prima e dopo la somministrazione di un AAV6 ricombinante ha portato ad un drammatico aumento dell'attività neutralizzante (da 125 a >10.000 volte). Il test ha mostrato un'adeguata sensibilità per rilevare l'attività neutralizzante in >1:32.000 diluizioni sieriche. Questo test fornisce un metodo semplice, rapido ed economico per rilevare nAbs contro AAV.

Introduzione

I virus adeno-associati (AAV) sono sempre più utilizzati come vettori per la somministrazione di terapie geniche a trattamenti sperimentali per varie condizioni di salute che hanno un impatto sul sistema cardiovascolare, polmonare, circolatorio, oculare e nervoso centrale1,2,3,4,5. La popolarità dei vettori AAV come piattaforma leader nella terapia genica deriva dal loro profilo di sicurezza positivo, dall'espressione transgenica a lungo termine e dai trofismi tessuto-specifici ad ampio ^ra....

Protocollo

Tutti gli aspetti della cura e della sperimentazione degli animali sono stati condotti seguendo le linee guida del Florey Institute of Neuroscience and Mental Health e il Codice australiano per la cura e l'uso degli animali a fini scientifici seguendo ^Reference25. Per lo studio sono state utilizzate pecore Merino di 1,5-3 anni. Una panoramica schematica del protocollo di analisi è fornita nella Figura 1.

Figura 1....

Risultati

Saggio di trasduzione per stabilire il dosaggio virale ottimale per la copertura delle piastre
Le cellule HT1080, una linea di cellule di fibrosarcoma ben consolidata, sono state selezionate per questo test. Una concentrazione di 1 x ¹⁰⁴ cellule HT1080 / pozzo ha fornito ~ 50% di confluenza cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Per determinare la concentrazione virale ottimale per il test, un rAAV che codifica per un gene reporter hPLAP (fosfatasi alcalina placentare u.......

Discussione

Questo rapporto descrive un saggio colorimetrico che valuta l'entità della neutralizzazione AAV in un dato campione di siero valutando una reazione cromogenica corrispondente al grado di trasduzione virale in vitro. Lo sviluppo del protocollo si è basato sulla nota reazione cromogenica tra l'enzima fosfatasi alcalina e NBT/BCIP, che è stato ampiamente utilizzato come strumento di colorazione per la rilevazione di bersagli proteici in applicazioni come l'immunoistochimica e come strumento reporter per la valut.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin/EDTA	Gibco	25300-054
50 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-432-22	Or equivalent
75 cm2 square flasks	Falcon	353136	Or equivalent
96 well flat bottomed plate	Falcon	353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector			Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)	PROGEN	610159	Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT	SIGMAFAST	B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette			5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965118
HT1080 cells	ATCC
ImageJ Software			Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator			37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera			Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven			For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde	MERCK	30525-89-4
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips			20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter	Millipore	S2GPU10RE	Used for combining media reagents
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator	Greiner BIO-ONE	455071	Used for serum collection & processing from sheep
Water bath