Un metodo passo-passo per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV utilizzando un test colorimetrico basato su cellule

Riepilogo

Un protocollo di laboratorio completo e un flusso di lavoro di analisi sono descritti per un test colorimetrico basato su cellule rapido, economico e semplice per rilevare elementi neutralizzanti rispetto ad AAV6.

Abstract

I virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) hanno dimostrato di essere un vettore sicuro e di successo per il trasferimento di materiale genetico per il trattamento di varie condizioni di salute sia in laboratorio che in clinica. Tuttavia, gli anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi AAV rappresentano una sfida continua per la somministrazione di successo delle terapie geniche sia in modelli sperimentali su grandi animali che in popolazioni umane. Lo screening preliminare per l'immunità dell'ospite contro l'AAV è necessario per garantire l'efficacia delle terapie geniche basate su AAV sia come strumento di ricerca che come agente terapeutico clinicamente valido. Questo protocollo descrive un test colorimetrico in vitro per rilevare fattori neutralizzanti contro il sierotipo 6 AAV (AAV6). Il test utilizza la reazione tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e il suo substrato NBT / BCIP, che genera una macchia viola quantificabile insolubile sulla combinazione.

In questo protocollo, i campioni di siero sono combinati con un AP che esprime AAV e incubati per consentire il verificarsi di una potenziale attività neutralizzante. La miscela di siero virale viene successivamente aggiunta alle cellule per consentire la trasduzione virale di eventuali AAV che non sono stati neutralizzati. Il substrato NBT/BCIP viene aggiunto e subisce una reazione cromogenica, corrispondente alla trasduzione virale e all'attività neutralizzante. La proporzione di area colorata viene quantificata utilizzando uno strumento software libero per generare titoli neutralizzanti. Questo test mostra una forte correlazione positiva tra colorazione e concentrazione virale. La valutazione di campioni di siero di pecora prima e dopo la somministrazione di un AAV6 ricombinante ha portato ad un drammatico aumento dell'attività neutralizzante (da 125 a >10.000 volte). Il test ha mostrato un'adeguata sensibilità per rilevare l'attività neutralizzante in >1:32.000 diluizioni sieriche. Questo test fornisce un metodo semplice, rapido ed economico per rilevare nAbs contro AAV.

Introduzione

I virus adeno-associati (AAV) sono sempre più utilizzati come vettori per la somministrazione di terapie geniche a trattamenti sperimentali per varie condizioni di salute che hanno un impatto sul sistema cardiovascolare, polmonare, circolatorio, oculare e nervoso centrale1,2,3,4,5. La popolarità dei vettori AAV come piattaforma leader nella terapia genica deriva dal loro profilo di sicurezza positivo, dall'espressione transgenica a lungo termine e dai trofismi tessuto-specifici ad ampio ^raggio1,6. I risultati positivi negli studi sugli animali hanno spianato la strada a oltre cinquanta studi clinici di terapia genica AAV che hanno raggiunto con successo i loro endpoint di ^efficacia7, nonché al rilascio del primo farmaco per la terapia genica AAV disponibile in commercio approvato dalla Food and Drug Administration degli Stati ^Uniti8. Dopo i successi iniziali, AAV ha continuato a guadagnare terreno nei settori della ricerca di base e clinica come vettore di scelta ed è attualmente l'unica terapia genica in vivo approvata per uso clinico negli Stati Uniti e in ^Europa9. Tuttavia, la presenza di anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi vettori AAV rimane un ostacolo sia alla ricerca preclinica che all'efficacia degli studi clinici. I NAb sono presenti sia in popolazioni naïve umane che animali e inibiscono la trasduzione genica a seguito della somministrazione in vivo di un vettore AAV1. La sieropositività AAV è un criterio di esclusione per la maggior parte degli studi di terapia genica e pertanto lo screening preliminare per l'immunità dell'ospite è cruciale sia in laboratorio che in clinica. Stabilire un test in grado di rilevare la presenza di NAbs contro AAV è un passo essenziale nella pipeline di qualsiasi progetto di ricerca basato sulla terapia genica AAV. Questo rapporto si concentra su AAV6 che è stato di interesse per i ricercatori grazie alla sua trasduzione efficiente e selettiva nel muscolo striato (cuore e muscolo scheletrico)1,10,11,12. La terapia genica è considerata una strategia promettente per il targeting del cuore perché è difficile indirizzare specificamente il cuore senza procedure invasive a cuore aperto.

L'attività neutralizzante viene solitamente determinata utilizzando un test di inibizione della trasduzione in vitro o in vivo basato su cellule. In vivo I saggi NAb di solito comportano la somministrazione di siero da un soggetto del test (ad esempio, umano o animale di grandi dimensioni) nei topi, seguito da un AAV con un gene reporter, seguito da test per l'espressione del gene reporter o dell'antigene corrispondente. I saggi in vitro determinano i titoli di NAb incubando siero o plasma da un essere umano o da un grande animale in diluizioni seriali con un AAV ricombinante (rAAV) che esprime un gene reporter. Le cellule sono infettate dalla miscela siero/virus e la misura in cui l'espressione genica reporter è inibita viene valutata rispetto ai controlli. I saggi in vitro sono ampiamente utilizzati per lo screening NAb a causa del loro costo relativamente inferiore, della rapidità nei test e della maggiore capacità di standardizzazione e ^{convalida13,14} rispetto ai saggi in vivo. I saggi in vivo sono spesso segnalati per avere una maggiore sensibilità15,16, ma la stessa affermazione è stata fatta per quanto riguarda i saggi in ^vitro14,17.

Ad oggi, i saggi NAb in vitro hanno utilizzato principalmente la luminescenza (luciferasi) come gene reporter per rilevare la neutralizzazione. Sebbene un metodo basato sulla luce abbia meriti in molti contesti, un test NAb colorimetrico / cromogenico può essere vantaggioso in alcune circostanze. Saggi colorimetrici per valutare la neutralizzazione sono stati impiegati con successo per altri virus come l'influenza e l'adenovirus18,19. La loro attrattiva deriva dalla loro semplicità, dal costo inferiore e dalla necessità di utilizzare solo apparecchiature e strumenti di laboratorio di uso ^quotidiano20. I saggi NAb che utilizzano un gene reporter basato sulla luminescenza richiedono costosi kit di substrato, un luminometro e un software corrispondente per ^l'analisi21. Questo test colorimetrico ha il vantaggio di richiedere solo un microscopio ottico e un substrato molto economico. La segnalazione della sensibilità dei saggi colorimetrici rispetto a quelli luminescenti ha prodotto risultati contrastanti. Uno studio ha suggerito che i saggi ELISA basati sulla luminescenza mostrano una maggiore sensibilità e una riproducibilità comparabile ai saggi ^{colorimetrici22}, mentre un altro ha scoperto che i saggi ELISA basati sulla colorimetria conferiscono una maggiore ^{sensibilità23}. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per un test NAb in vitro contro AAV che utilizza la reazione cromogenica tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e un substrato nitro blu tetrazolio /5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP). Questo protocollo passo-passo è stato sviluppato sulla base di un precedente rapporto che utilizzava un gene reporter hPLAP (fosfatasi alcalina placentare umana) (AAV6-hPLAP) per rilevare l'attività neutralizzante contro ^AAV24. Questo test è conveniente, efficiente in termini di tempo, facile da configurare e richiede competenze tecniche minime, attrezzature di laboratorio e reagenti. Inoltre, la semplicità di questo test gli conferisce il potenziale per essere ottimizzato per ampie applicazioni su diversi tipi di cellule, tessuti o sierotipi virali.

Protocollo

Tutti gli aspetti della cura e della sperimentazione degli animali sono stati condotti seguendo le linee guida del Florey Institute of Neuroscience and Mental Health e il Codice australiano per la cura e l'uso degli animali a fini scientifici seguendo ^Reference25. Per lo studio sono state utilizzate pecore Merino di 1,5-3 anni. Una panoramica schematica del protocollo di analisi è fornita nella Figura 1.

Figura 1: Diagramma schematico del protocollo di analisi NAb. (A) Rappresentazione visiva del test NAb che illustra i passaggi primari coinvolti nel protocollo di tre giorni. In breve, le cellule vengono coltivate e placcate durante la notte. Il giorno seguente, vengono preparate diluizioni seriali di siero, incubate con AAV e quindi incubate con le cellule durante la notte. Il giorno successivo, le cellule vengono fissate, lavate, incubate, combinate con il substrato e incubate di nuovo, seguite da imaging e quantificazione. (B) Immagini rappresentative di un controllo minimo del segnale (inibizione AAV completa), un controllo massimo del segnale (nessuna inibizione) e un campione di siero ovino con inibizione del segnale ~ 50%. Barra della scala = 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione iniziale

1. Per la valutazione negli ovini: raccogliere il sangue in provette di attivazione del coagulo separatore di siero da 8 ml (vedere Tabella dei materiali), lasciare il campione di sangue a temperatura ambiente (RT) per 20-30 minuti e successivamente ruotare a 2.100 x g per 15 minuti. Il surnatante chiaro che si forma nella parte superiore dei tubi è il siero. Aliquotare la fase acquosa limpida in tubi di microcentrifuga e conservare a -80 °C.
   NOTA: Il siero a -80 °C rimane stabile per ~5 anni. Il sangue è stato raccolto dalla vena carotidea usando un ago da 16 G (punta tagliata) e una siringa da animali coscienti.
2. Il calore inattiva il siero bovino fetale (FBS) mettendolo a bagnomaria a 56 °C per 30 minuti e ruotando in modo intermittente. Per precisione, posizionare un termometro in una seconda bottiglia contenente un volume equivalente di acqua e aggiungerlo al bagno di calore contemporaneamente alla bottiglia FBS. Iniziare la temporizzazione quando il termometro raggiunge i 56 °C.
3. Impiegare una corretta tecnica asettica e pratica di coltura cellulare per tutte le fasi successive eseguite nella cappa di coltura ^{cellulare26,27}. Spruzzare il 70% di etanolo su tutti gli oggetti e sul cappuccio prima dell'uso e pulire con ipoclorito di sodio all'1% al termine.
4. Completa il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco combinando glucosio alto (4,5 g / L) DMEM (89%) con FBS inattivato dal calore (10%) e penicillina streptomicina (1%). Combinare e filtrare utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto sterile (dimensione dei pori di 0,22 μm, membrana di polietersolfone) (vedere Tabella dei materiali). Conservare il DMEM completo avvolto in un foglio a 4 °C.
5. Stabilire celle HT1080 (vedere Tabella dei materiali) e passare in un pallone quadrato di 75 ^cm2 come descritto in ^{Riferimento28}. Crea più scorte congelate di cellule. Non utilizzare cellule dopo 20 passaggi poiché un ulteriore passaggio può influenzare i risultati del test.

2. Giorno 1 - Placcatura delle cellule

1. Passaggio delle cellule HT1080 quando raggiungono ~ 80% di confluenza.
2. DMEM completo preriscaldato (preparato nella fase 1.4), 0,05% di tripsina-EDTA e 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 37 °C a bagnomaria. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule passate utilizzando un sistema di aspirazione.
   NOTA: Tutte le aspirazioni in questo protocollo utilizzano un sistema di vuoto con un tubo collegato a una pipetta sierologica sterile da 5 ml.
3. Lavare le cellule in 10 mL di PBS preriscaldato (37 °C) e tripsinizzare le cellule per 3-4 minuti in 4 mL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,05% per staccare le cellule dal pallone.
4. Inattivare la tripsina aggiungendo 6 mL di DMEM completo preriscaldato e pipettare le cellule in un tubo da 50 ml. Calcolare il numero e la concentrazione di cellule vitali utilizzando un emocitometro e il metodo di esclusione blu del ^tripano29.
5. Diluire le cellule ad una concentrazione di 1 x ¹⁰⁵ cellule/mL in DMEM completo preriscaldato. Semina 100 μL di cellule / pozzo in piastre chiare a fondo piatto a 96 pozzetti (1 x ¹⁰⁴ cellule per pozzetto). Incubare la piastra a 37 °C, 5% di anidride carbonica (_CO2) durante la notte per 16-22 ore.

3. Giorno 2 - Infettare le cellule

1. Rimuovere le piastre dall'incubatore e utilizzare un microscopio ottico per confermare che le cellule sono uniformemente disperse all'interno dei pozzetti e che la confluenza è ~ 50%. Se le cellule non rientrano in un intervallo di confluenza del 45%-55%, ripetere il protocollo "Giorno 1" e regolare di conseguenza la concentrazione cellulare iniziale.
2. Generare diluizioni seriali dei campioni di siero di interesse in tubi microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando DMEM completo preriscaldato come diluente. La Tabella 1 mostra la generazione di una cascata di diluizione per campioni di triplice copia.
   1. Per eseguire il test in triplice copia, preparare un genoma vettoriale (vg)/μL di 7,5 x ¹⁰⁶ genomi vettoriali (vg)/μL di soluzione di lavoro di AAV6-hPLAP (vedi Tabella dei materiali) diluendo una soluzione madre di virus in 1x PBS.
   2. Aggiungere 66 μL della soluzione di lavoro virale 7,5 x ¹⁰⁶ vg/μL a ciascun tubo contenente 264 μL di diluizione siero/mezzo (330 μL di volume/diluizione totale, vedere Tabella 1).
      NOTA: questo è un test robusto che non richiede condizioni di coltura perfette. Tuttavia, per quantificare con precisione e garantire che ogni esecuzione del test sia affidabile, è necessario includere quanto segue: (1) un controllo solo virus e media, (2) un controllo solo media e (3) un campione di controllo NAb positivo su tutte le piastre nelle stesse condizioni sperimentali. Il volume descritto (330 μL) rappresenta per i campioni di triplice copia +10% della miscela di siero e virus. L'esecuzione di repliche è altamente raccomandata per la determinazione accurata dell'attività di neutralizzazione.
3. Mescolare le diluizioni virus/siero mediante pipettaggio e posizionare le provette contenenti le miscele virus/siero in un incubatore a 37 °C, 5% _CO2 per 30 minuti per consentire la potenziale neutralizzazione.
4. Pipettare 100 μL della miscela virus/siero per ogni pozzetto sulla piastra a 96 pozzetti contenente 1 x ¹⁰⁴ cellule/pozzetto per ogni diluizione.
   NOTA: Questo genererà una concentrazione virale finale di 15k virus / molteplicità cellulare di infezione (MOI) in ciascun pozzo. La tabella 2 fornisce un esempio di layout della piastra campione a 96 pozzetti per valutare i campioni a una diluizione 1/512.
5. Avvolgere la piastra a 96 pozzetti contenente cellule, siero e AAV-hPLAP in un foglio e metterla in un incubatore a 37 ° C, 5% _CO2 durante la notte per 16-24 ore per consentire l'ingresso di AAV nelle cellule.

Etichetta a cascata di diluizione	Diluizione	3 x campione (240 μL) + 10% di volume tampone (24 μL)	Rapporto tra siero:media
Diluizione 1 (D1)	1/2	264 μL siero 264 μL mezzi	50:50
Diluizione 2 (D2)	1/4	264 μL D1 + 264 μL di fluidi	25:75
Diluizione 3 (D3)	1/8	264 μL D2 +264μL fluido	12.5:87.5
Diluizione 4 (D4)	1/16	264 μL D3 +264 μL di fluidi	6.25:93.75
Diluizione 5 (D5)	1/32	264 μL D4 +264 μL di fluidi	3.13:96.87
Diluizione 6 (D6)	1/64	264 μL D5 +264 μL di fluidi	1.56:98.44
Diluizione 7 (D7)	1/128	264 μL D5 +264 μL di fluidi	0.78:99.22
Diluizione 8 (D8)	1/256	264 μL D5 +264 μL di fluidi	0.39:99.61
Diluizione 9 (D9)	1/512	264 μL D7 + 264 μL di mezzi	0.2:99.8
Diluizione 10 (D10)	1/2048	132 μL D8 + 396 μL di fluidi	0.05:99.95
Diluizione 11 (D11)	1/8192	132 μL D9 + 396 μL di fluidi	0.01:99.99
Diluizione 12 (D12)	1/32768	132 μL D10 + 396 μL di fluidi	0.003:99.997

Tabella 1: Volumi di siero e diluente necessari per generare diluizioni seriali di siero in triplice copia.

Esempio di siero #1

Esempio di siero #2

Esempio di siero #3

Mono AB (mAB), controlli e campioni extra

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Un

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng MAb

50 ng MAb

50 ng MAb

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng MAb

5 ng MAb

5 ng MAb

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0,5 ng MAb

0,5 ng MAb

0,5 ng MAb

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

Esempio #1 1/512

Esempio #1 1/512

Esempio #1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

Esempio #2 1/512

Esempio #2 1/512

Esempio #2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

Esempio #3 1/512

Esempio #3 1/512

Esempio #3 1/512

Tabella 2: Esempio di layout della piastra a 96 pozzetti per la valutazione di campioni di siero naïve in diluizioni comprese tra 1/2 e 1/512. Diluizioni più elevate sono incorporate nel test se si valuta un campione noto per essere positivo per AAV NAbs (campioni post-somministrazione) o se è richiesto un titolo più elevato. MO (-C): controllo solo multimediale. VO (+C): controllo solo di virus e supporti. mAb: Anticorpo monoclonale contro AAV (controllo positivo NAb).

4. Giorno 3 - Fissaggio e aggiunta di substrato alle cellule

1. Preriscaldare un'aliquota da 1x PBS a 37 °C (~25 mL/piastra a 96 pozzetti). Aliquote separate fredde di PBS (~25 mL/piastra a 96 pozzetti) e _H2O a doppio distillato (DDW, piastra da ~25 mL/96 pozzetti) a 4 °C. Sciogliere un pellet di BCIP/NBT (vedi Tabella dei materiali) in 10 mL di DDW in un tubo centrifugo conico da 50 mL mediante vortice (10 mL sono sufficienti per 2 x 96 piastre di pozzo).
2. Aspirare il fluido dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica o simile collegata a un sistema di aspirazione basato sull'aspirazione o a un vuoto della cappa aspirante. Posizionare delicatamente la punta della pipetta sierologica nel pozzetto e rimuovere il supporto facendo attenzione a non interrompere le cellule aderenti.
   1. Aggiungere 50 μL di RT 4% PFA a ciascun pozzo utilizzando una pipetta. Avvolgere la piastra in un foglio e lasciarla a RT per 10 minuti per fissare le cellule.
      ATTENZIONE: La paraformaldeide (PFA) è un probabile cancerogeno ed è tossica per contatto con la pelle o gli occhi o per inalazione. Maniglia in una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale e una maschera facciale. Produrre PFA fresco al 4% diluito in PBS (~ 7 ml richiesti per piastra da 96 pozzetti).
3. Lavare e aspirare le celle con 200 μL di RT 1x PBS. Ripetere questo passaggio due volte.
   NOTA: una pipetta multicanale è un'opzione efficiente per le fasi di pipettaggio.
4. Pipettare 200 μL di PBS preriscaldato in ciascun pozzetto, avvolgere la piastra in un foglio e incubare a 65 °C per 90 minuti per denaturare l'attività endogena della fosfatasi ^alcalina30.
5. Aspirare pozzi e celle di lavaggio con 200 μL di PBS freddo (4 °C). Aspirare di nuovo, lavare in 200 μl di DDW freddo e aspirare di nuovo.
6. Pipettare 50 μL del BCIP/NBT disciolto (preparato al punto 4.1) in ciascun pozzetto.
7. Avvolgere la piastra in un foglio e incubare a RT per 2-24 ore.
   NOTA: essere coerenti con il tempo di incubazione tra le esecuzioni; la flessibilità temporale consente agli utenti di fotografare i pozzi il giorno 3 o il giorno successivo.
8. Utilizzando una fotocamera al microscopio ottico, scattare foto di ciascun pozzo utilizzando un obiettivo 4x, garantendo la stessa esposizione, il bilanciamento del bianco e le impostazioni della luce vengono utilizzati in modo coerente per tutti i test eseguiti.
   1. Posiziona ciascun pozzetto in modo identico e assicurati che i bordi del pozzo non siano visibili nelle foto. Salva le foto in formato TIF o simile.
      NOTA: le impostazioni specifiche variano tra i microscopi, ma la quantificazione sarà più efficace se l'illuminazione di fondo è elevata e coerente in tutti i pozzetti (Figura 1B).

5. Quantificazione per determinare l'attività di neutralizzazione utilizzando ImageJ

1. Scarica e installa il software disponibile gratuitamente "ImageJ" (vedi Tabella dei materiali).
2. Aprire l'immagine da analizzare in ImageJ selezionando File > Apri (Figura 2).
3. Se utilizzate immagini colorate, convertitele in scala di grigi selezionando Immagine > Tipo > 8 bit.
4. Clicca su Immagine > Regola > Soglia. Regolare la soglia fino a quando tutte le aree colorate sono colorate in rosso, ma lo sfondo non lo è. Dopo l'aggiunta di NBT / BCIP, il prodotto colorato si depositerà nell'area intorno alle cellule che esprimono hPLAP.
   NOTA: si consiglia di utilizzare la stessa impostazione di soglia per tutte le immagini acquisite sulla stessa piastra.
5. Fare clic su Analizza > Imposta misurazioni e selezionare le caselle di controllo Area, Limita a soglia, Frazione di area e Visualizza etichetta e fare clic su OK.
6. Per determinare la lettura del segnale (percentuale di colorazione) di un dato pozzo, fare clic su Analizza > Misura. La colonna '% Area' della finestra pop-up visualizza la lettura del segnale.
7. Eseguire la quantificazione per tutte le repliche di campioni. Escludere eventuali pozzi contaminati, pozzi che mostrano una distribuzione cellulare irregolare o pozzi che variano in densità cellulare o illuminazione.
   NOTA: vedere la Figura 1 supplementare per esempi di pozzi che devono essere considerati per l'esclusione. In genere, 3-4 pozzi possono richiedere l'esclusione da una piastra da 96 pozzetti. La Figura 2 fornisce una rappresentazione visiva del processo di quantificazione utilizzando ImageJ.

Figura 2: Passaggi per determinare la colorazione percentuale utilizzando il software ImageJ. (A) Aprire l'immagine da analizzare con il software ImageJ. (B) Convertire l'immagine in scala di grigi a 8 bit. (C) Aprire la finestra di soglia. (D) Regolare la soglia massima in modo che tutte le aree colorate siano coperte, ma l'area di sfondo non lo è (questa soglia dovrebbe essere coerente su un'intera piastra). (E) Seleziona il dropbox "Analizza", fai clic su "Imposta misurazioni" e seleziona "Area", "Frazione di area", "Soglia limite" e "Etichetta di visualizzazione" e fai clic su "OK". (F) Fare clic su "Misura" per misurare l'area coperta. L'area % indica la proporzione dell'immagine che è stata colorata. Questo può quindi essere utilizzato con i campioni di controllo per determinare il titolo _TI50 . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Determinazione del titolo di inibizione della trasduzione (_TI50)

1. Determinare la lettura media dalle repliche (utilizzando i passaggi descritti nel passaggio 5) per quanto segue: (1) Controllo solo multimediale (lettura del segnale di base). (2) Controllo solo virus + media (lettura massima del segnale). (3) Virus + campioni di siero di interesse.
2. Calcola la percentuale di inibizione usando la seguente formula:
   100 - [(Test sample signal readout (virus + serum sample of interest) - baseline signal readout (media only control)) / (maximum signal readout (media and virus only) - baseline signal readout) x 100] = % Trasduzione ^inhibition13.
3. Calcolare l'inibizione % della trasduzione da tutte le repliche di ciascuna diluizione per tutti i campioni utilizzando la formula di cui al punto 6.2. Determinare l'inibizione media della trasduzione tra le repliche tecniche per ogni diluizione per tutti i campioni e i controlli.
4. Calcolare il titolo di inibizione della trasduzione al 50% (titolo _TI50 ) di un campione di interesse determinando la diluizione più bassa del campione che produce il 50% o superiore di inibizione della trasduzione dell'attività hPLAP. ad esempio, se una diluizione di 1/8 di un campione ha un'inibizione della trasduzione superiore al 50% in base al calcolo eseguito in 6.2 (e una diluizione di 1/4 no), riportare il titolo _TI50 come 1/8.

7. Determinazione delle particelle AAV neutralizzate

1. Calcolare il numero di particelle AAV neutralizzate per μL di siero per un dato campione utilizzando la seguente formula:
   ((MOI x conteggio cellulare/pozzo) / (volume di siero / fattore di diluizione del titolo _TI50 )) / 2 = particelle AAV neutralizzate / μL di ^siero9.
   NOTA: Dividendo per 2 si ottiene il _{TI50 che} misura il 50% delle particelle neutralizzate. Per un campione che fornisce un titolo _TI50 di 1/4 (25% siero, 75% diluente) in cui il test ha utilizzato 80 μL di siero non diluito e un MOI di 15k placcato su 1 x ¹⁰⁴ cellule, verrebbe utilizzato il seguente calcolo: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3,75x106 particelle neutralizzate / μL di siero.

Risultati

Saggio di trasduzione per stabilire il dosaggio virale ottimale per la copertura delle piastre
Le cellule HT1080, una linea di cellule di fibrosarcoma ben consolidata, sono state selezionate per questo test. Una concentrazione di 1 x ¹⁰⁴ cellule HT1080 / pozzo ha fornito ~ 50% di confluenza cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Per determinare la concentrazione virale ottimale per il test, un rAAV che codifica per un gene reporter hPLAP (fosfatasi alcalina placentare u...

Discussione

Questo rapporto descrive un saggio colorimetrico che valuta l'entità della neutralizzazione AAV in un dato campione di siero valutando una reazione cromogenica corrispondente al grado di trasduzione virale in vitro. Lo sviluppo del protocollo si è basato sulla nota reazione cromogenica tra l'enzima fosfatasi alcalina e NBT/BCIP, che è stato ampiamente utilizzato come strumento di colorazione per la rilevazione di bersagli proteici in applicazioni come l'immunoistochimica e come strumento reporter per la valut...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin/EDTA	Gibco	25300-054
50 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-432-22	Or equivalent
75 cm2 square flasks	Falcon	353136	Or equivalent
96 well flat bottomed plate	Falcon	353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector			Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)	PROGEN	610159	Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT	SIGMAFAST	B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette			5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965118
HT1080 cells	ATCC
ImageJ Software			Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator			37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera			Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven			For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde	MERCK	30525-89-4
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips			20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter	Millipore	S2GPU10RE	Used for combining media reagents
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator	Greiner BIO-ONE	455071	Used for serum collection & processing from sheep
Water bath