גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שיטת הגידול של חרקים מזיקים טורטריים במעבדות. ההליכים להבחנה בין מין החרקים ולמיצוי חומצות גרעין לריצוף בתפוקה גבוהה נקבעים באמצעות שני מזיקים מומנטיים.

Abstract

Tortricidae (Lepidoptera), הידוע בכינויו טורטריקס או עש עלים, כולל מזיקים חקלאיים וייעוריים רבים, הגורמים להפסדים חקלאיים חמורים. כדי להבין את הביולוגיה של עשים מזיקים כאלה, טכניקות בסיסיות היו מבוקשות מאוד. כאן, שיטות לגידול מסה, תצפיות ומחקרים מולקולריים מפותחות באמצעות שני טורטריקס תה, Homona magnanima ו - Adoxophyes honmai (לפידופטרה: Tortricidae). חרקים גודלו באופן המוני עם תזונה מלאכותית פרוסה ונשמרו על ידי רבייה במשך יותר מ-100 דורות על ידי התחשבות בתכונות הביולוגיות שלהם. לחרקים יש דימורפיזמים מיניים שונים; לפיכך קשה להבחין בין המין בשלבי ההתפתחות, שמנעו בדיקות עוקבות. העבודה הנוכחית הדגישה כי ניתן לקבוע את המין של זחלי הטורטרידים על ידי התבוננות באשכים או בכתמי אורצין לקטיים-אצטיים כדי לדמיין את כרומוזום W הספציפי לנקבה. יתר על כן, באמצעות שיטות קביעת המין, המחקר הנוכחי איפשר מיצוי חומצות גרעין ממין קבע עוברים ויישום לקראת ריצוף בתפוקה גבוהה. טיפים אלה ישימים עבור חרקים מזיקים אחרים ויאפשרו מחקרים מורפולוגיים וגנטיים נוספים.

Introduction

חרקי לפידופטרן מייצגים יותר מ-10% מכלל המינים החיים המתוארים¹, ומיני טקסה מסוימים גורמים נזק חמור לצמחים ולאובדן חקלאי חמור ^2,3. למרות שמחקרים מולקולריים וגנטיים פותחו באמצעות חרקי מודל כגון תולעת המשי בומביקס מורי ^4,5, חרקים מזיקים נותרים ללא התערבות, בין היתר בגלל קשיי הגידול והטיפול^ב-6,7. לכן, מחקרים בסיסיים וטכניקות נחוצים כדי להבין את הביולוגיה של חרקים מזיקים כאלה שאינם מודל.

ה-Tortricidae (Lepidoptera), הידוע בכינויו טורטריקס או עש עלים, כולל מזיקים חקלאיים וייעוריים רבים⁸. מבין טקסי החרקים, טורטריקס התה האוריינטלי Homona magnanima Diakonoff ופירות הקיץ Tortrix Adoxophyes honmai Yasuda הם מזיקים פוליפגוטיים רציניים הידועים כמזיקים לעצי תה במזרח אסיה⁷. שני המינים מטילים אשכולות ביצים שטוחים וסגלגלים דמויי קשקשים (או מסות ביצים) המורכבים מביצים דקות, רכות ושבריריות המכוסות בהפרשות אימהיות. אף על פי ששלבי העוברים הם חיוניים להתפתחות החרקים ולקביעת המין⁹, מבנים של הביציות מונעים ניתוח נוסף מהבנת הביולוגיה של החרקים. חשוב להתגבר על הקשיים למחקר נוסף על מזיקים המזיקים המסתבכים עם מסת ביצה מורכבת כזו.

כאן, כדי להבין את הביולוגיה של טורטרידים, פותחו שיטות לגידול מסה, תצפיות ומחקרים מולקולריים באמצעות A. honmai ו - H. magnanima. ראשית, שיטות גידול המוני שומרות על שני הטורטרידים במשך 100 דורות על ידי גזע. הפרדת הביציות ממסת הביצית דמוית הקשקשים המשורשרים אפשרה תצפית עוברית על הטורטרידים באמצעות ממיסים אלקליין ואורגניים שפותחו בעבר מטכניקות ששימשו בזבובים¹⁰. בנוסף, המחקר הנוכחי ביסס אפליה מינית של עוברים קטנים על ידי פיתוח שיטות צביעה של כרומטין המין של נקבות lepidopteran באמצעות orcein לקטי-אצטי¹¹. על ידי שילוב שיטות אלה, חומצות גרעין באיכות גבוהה ובכמות הופקו מעוברים שנקבעו על ידי מין, שאחרת היה קשה לקבוע⁶. הרנ"א שחולץ שימש לריצוף הדור הבא. באופן קולקטיבי, השיטות המוצגות כאן חלות על חרקים לפידופטרנים אחרים ועל טקסות חרקים אחרות.

Protocol

1. איסוף חרקים וגידול המוני

1. לאסוף חרקים טורטריים משדות בעקבות הפניות שפורסמו בעבר ^8,12.
   הערה: זחלי H. magnanima ו-A. honmai נאספים מעלי תה פגומים (איור 1A); מבוגרים נמשכים באמצעות אור UV נייד של 4 W (אורך גל של 365 ננומטר, ראו טבלת חומרים, איור 1B).
2. גבו את הזחלים שנאספו (איור 1C,D) בנפרד על פיסת תזונה מלאכותית בכוס של 1/2 אונקיה במשך 2-3 שבועות עד להסתרה בוגרת (איור 1E,F). אשרו את מין הגלמים והבוגרים על ידי תכונות מורפולוגיות (איור 1G,I).
3. הצמידו את הזכרים והנקבות בקופסת פלסטיק (30 ס"מ על 20 ס"מ על 5 ס"מ) למסות ביצים אוביפוזיט על נייר פרפין (איור 1J-L). הניחו נקבה ושני זכרים בכוס פלסטיק של 120 מ"ל עם פיסת נייר פרפין כדי ליצור מטרלין.
   הערה: חשוב להכין קמטים על נייר הפרפין. עבור H. magnanima, נייר פרפין צריך להיות בתחתית המארז. בינתיים, עבור A. honmai, שים נייר על תקרת המארז כדי לאסוף ביצים (איור 1L) מכיוון שמסת הביצה של H. magnanima oviposit בצד העליון של עלי התה, אך A. honmai מטיל ביצים על החלק התחתון של העלים⁸. הנהלים אומתו גם במינים טורטריים אחרים, ועדיף להניח ניירות משני הצדדים אם האקולוגיה וההתנהגות של מיני המטרה אינם מסווגים.
4. חותכים את מסות הביצים (בערך 100-200 ביצים למסת ביצה¹², איור 1M) על נייר הפרפין עם מספריים. מניחים את הביצים בכוס של 1/2 אונקיה עם נייר זרוק למשך 5-7 ימים.
   הערה: העובר הבוגר מציג קפסולת ראש שחור (איור 1N). התקופות של embryogenesis מיוחסות באופן מגוון למינים טורטריים, אך בדרך כלל 5 ימים לאחר ההטלה (dpo) עבור H. magnanima ו-4 dpo עבור A. honmai ב-25 °C עם 60% לחות יחסית, 16 שעות אור/8 שעות מחזורי חושך⁷.
5. אחסנו את המוני הביצים המציגות כמוסות ראש שחורות בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
6. פורסים כ-60 גרם דיאטות מלאכותיות באמצעות פומפיה לגידול המוני. מניחים את מסת הביצית המלאה בעוברים בוגרים על התזונה המלאכותית הפרוסה במיכל פלסטיק (23 ס"מ על 16 ס"מ על 8 ס"מ). הניחו ניירות פרפין על מסת הביצה בעזרת הדיאטות הפרושות (איור 10).
   הערה: מתחת ל-30% לחות יחסית נחשבת יבשה מדי, בעוד שלמעלה מ-70% לחה מדי. עדיף ליצור חורים במכסה של מיכל הפלסטיק כדי לאפשר אוורור טוב יותר. מלאו את החורים בכותנה כדי למנוע בריחות של זחלים קטנים.
7. כדי לסלק מזהמים פני השטח מהביצים, להשרות את מסת הביצה לתוך 3% פורמלין ו 0.2% תמיסת בנזלקוניום כלוריד במשך 5 דקות, בהתאמה¹². כדי למגר חיידקי מעיים או חיידקים תוך-תאיים, השתמשו בתזונה מלאכותית בתוספת 0.05% (w/w) טטרציקלין הידרוכלוריד או 0.06% (w/w) ריפאמפיצין במקום תזונה מלאכותית רגילה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי. חשוב ללוש את Silk Mate 2S ו-0.05% (w/w) טטרציקלין הידרוכלוריד או 0.06% (w/w) ריפאמפיצין באופן שווה לצורך עקביות.
8. אספו את הגלמים ממיכל הפלסטיק והבדילו את המין על סמך¹² מאפיינים מורפולוגיים (איור 1G-I).
   הערה: באופן כללי, טורטרידים מציגים 5-6 אינסטארים עד לגור¹². הזחלים H. magnanima ו - A. honmai לוקחים 3 שבועות ושבועיים, בהתאמה, לאחר הבקיעה עד הגור.
9. הניחו 15 זכרים ו-10 נקבות בקופסת פלסטיק (30 ס"מ על 20 ס"מ x 5 ס"מ, איור 1K) להזדווגות עם 25 מעלות צלזיוס, 16 ליטר/8 ד', אספו ביצים ל-5-7 ימים וחזור על שלבים 1.4-1.9. לכל דור.
   הערה: אם יש צורך באיסוף המוני ביצים חדשים לניתוח מאוחר יותר, הגדר את ההתחלה והסיום של התקופה החשוכה, למשל, מ-9 בבוקר עד 17:00. במצב זה, H. magnanima ו - A. honami בדרך כלל ביצי oviposit לאחר 5 שעות (14:00).

2. הפרדת ביצים וזחלי pharate ממסות ביצים לקיבוע, חלחול וכתמים

1. השרו את מסת הביצה לתוך 1,000 μL של 1.2% נתרן היפוכלוריט תמיסה מימית למשך 10 דקות או לתוך 1,000 μL של 5 M אשלגן הידרוקסיד תמיסה מימית במשך 30 דקות כדי להפריד את הביצים.
2. שטפו את הביצים המופרדות ב-1,000 μL של PBSt (137 mM NaCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 0.05% של פוליאוקסיאתילן (20) סורביטן מונולאוראט [Tween-20] pH 7.4, ראו טבלת חומרים) בעקבות הדו"ח שפורסם בעבר⁷.
3. השרו ביצים בתערובת של 500 μL של 100% הפטאן ו-500 μL של תמיסת 4% paraformaldehyde-PBSt (w/v). מערבבים במשך 10 דקות ב-1,500 סל"ד באמצעות מערבל מערבל מערבולות.
4. השרו את הביצים לתערובת של 500 מיקרול'ל של 100% הפטאן ו-500 מיקרול' של 100% מתנול. מערבבים במשך 10 דקות ב-1,500 סל"ד.
5. שטפו את הביצים פעמיים עם 1,000 μL של 100% מתנול ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-100% מתנול עד לניסויים נוספים (איור 2A).
   הערה: ניתן לאחסן את הביצים לפחות לשנה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. משרים את הביצים ברצף ב-99%, 70%, 50% אתנול ו-PBSt למשך 5 דקות כל אחת לצורך הידרופיליזציה בעקבות דו"ח⁷ שפורסם בעבר.
7. שטפו את הביצים עם PBSt, טבלו את הביצים ב-1 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת DAPI למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו את הביצים עם 1x PBS פעמיים. השרו את הביצים ב-20 מיקרול' של תמיסת אורצין לקטית-אצטית של 1.25% (w/w) (ראו טבלת חומרים)¹¹ כדי לדמיין את ההטרוכרומטין עד שהגרעינים יציגו צבע אדום בוהק (זה נע בין 5-60 דקות) (איור 2B,C).
   הערה: תקופות הכתמת האורצין הלקטי-אצטי תלויות בטמפרטורה ובלחות. עדיף לבדוק אם יש צביעה נכונה באמצעות מיקרוסקופ עם הגדלה של 4x-10x.
8. מעבירים את הביצים הוויטראז'יות באמצעות פיפטה למגלשת זכוכית. הצמידו את הביצים המוכתמות לריאגנט אנטיפאד (ראו טבלת חומרים) וזכוכית כיסוי⁷.
9. חלצו את הזחלים pharate H. magnanima ו-A. honmai (4-5 ימים לאחר ההטבעה (dpo)) ממסות הביצים באמצעות מלקחיים (איור 2D). זחלים דו-כיווניים על מגלשת זכוכית (איור 2E).
10. לתקן את כל הרקמות (למשל, גנגליון תת-וושט, גרעיני בית החזה, צינורית מלפיגית וכו ') עם תערובת של 1:3 (v/v) 99.7% חומצה אצטית/100% מתנול למשך 5 דקות. הכתימו את אלה בתמיסת אורצין לקטית-אצטית^{11 ב-1.25} % עד שהגרעינים מוכתמים (פעולה זו יכולה להימשך 5-60 דקות, בהתאם לטמפרטורה וללחות).
11. קבעו את המין של כל דגימה על ידי התבוננות בנוכחות (נקבה) או בהיעדר (זכר) של הטרוכרומטין (כרומוזום W, איור 2F,G) תחת מיקרוסקופ.
    הערה: המין נקבע על ידי הדמיה של כרומטין המין. כל תא מייצג את כרומטין המין כנקודה אצל נקבות^11,12, בעוד שהחלק הנותר של רקמות הזחל של pharate (לא קבוע) צריך להיות שקוע באופן מיידי במאגר ליזה של תאים¹² (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, ו-1% SDS, pH 8.0) או ריאגנטים המכילים RNA המכילים פנול עבור מיצוי DNA או RNA. לפני הניתוחים, מחלקים מראש 20 μL של הריאגנטים לתוך צינורות PCR של 0.2 מ"ל (איור 3A). לטבול ולאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) עד למיצוי נוסף. ניתן לאחסן את הדגימות במשך 3 חודשים לפחות, אך עדיף להמשיך בניסויים במורד הזרם כדי למנוע פירוק של חומצות גרעין.

3. מיצויי דנ"א ורנ"א ממין קבעו זחלי פאראט

1. רכזו 12 זחלי פאראט זכרים או נקבות שנקבעו על ידי המין (5 עוברי dpo) והוסיפו את מאגר הליזיס של התא או ריאגנטים להפקת RNA (ראו שלב 2.11 וטבלת החומרים) לצינור אחד של 1.5 מ"ל.
   הערה: בצע את שלבים 3.2-3.7 למיצוי DNA ואת שלבים 3.8-3.11 למיצוי RNA.
2. הומוגניזציה של רקמות ב-600 μL של מאגר הליזיס של התא (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA ו-1% SDS, pH 8.0), וצנטריפוגות הדגימות ב-10,000 x g למשך 5 דקות ב-4 °C (74 °F).
3. אספו את הסופרנאטנט (500 μL) באמצעות פיפטה ודגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם 1.5 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) למשך 5 שעות על בלוק חום.
4. טפלו בדגימות עם 1.0 μL של 10 מ"ג/מ"ל של תמיסת RNase (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
5. הוסף 200 μL של תמיסת משקעים חלבונית (ראה טבלת חומרים) לצינורות⁷, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 17,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (76 °F).
6. מערבבים את הסופרנאטל (500 μL) עם 500 μL של 100% איזופרופנול, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-20,400 x g למשך 10 דקות ב-4 °C (75 °F).
7. לשטוף את הדנ"א הכדורי פעמיים עם 1,000 μL של 70% אתנול. לאחר מכן, יבש באוויר (5-10 דקות בטמפרטורת החדר), ממיס את הדנ"א ב-30 מיקרול'ל של חיץ Tris-Cl של 10 mM (pH 8.5).
8. הומוגניזציה של הרקמות ב-600 μL של ריאגנטים להפקת RNA והוספת 240 μL של מים מזוקקים טהורים במיוחד לצינור. צנטריפוגה את הצינורות ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (64 °F).
9. מערבבים את הסופרנאטנט (600 μL) עם 600 μL של 100% איזופרופנול ומעבירים את התערובת לעמודת ספין סיליקה (ראו טבלת חומרים). צנטריפוגה את הצינורות ב 17,900 x g במשך דקה אחת ב 4 °C (64 °F).
10. שטפו את העמודה ב-750 μL של 70% אתנול, וצנטריפוגה של העמודה פעמיים ב-17,900 x גרם למשך דקה אחת כל אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
11. טען 15 μL של מים מזוקקים טהורים במיוחד לעמוד. צנטריפוגה של הצינורות ב-17,900 x g למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי לחמוק מה-RNA.
12. חישוב ואמת את האיכות והכמות של דנ"א ורנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס UV. הערך את טוהר חומצות הגרעין באמצעות יחס A260/A280 (חומצות גרעין/חלבון) ו-A260/A230 (חומצות גרעין/מלחים ומזהמים אחרים)¹³.
    הערה: עבור מיצוי RNA, בוצע הליך¹² שפורסם בעבר, אשר הביא לזיהום פנול (טבלה 1). הדנ"א והרנ"א המופקים מעובר יחיד או מזחלי pharate מניבים דגימות בעלות כמות נמוכה ובאיכות נמוכה. בדרך כלל, מיצוי דנ"א מ-12 זחלי pharate מניב 100-600 ננוגרם, בעוד שמיצוי RNA בשיטה הנוכחית מייצר 900-1,500 ננוגרם, כפי שמוצג בטבלה 1.
    הערה: שלבים 3.13-3.15 הם אופציונליים לבדיקות נוספות של ריצופי תפוקה גבוהה.
13. חשב את כמויות הדנ"א והרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס פלואורסצנציה.
    הערה: היחס בין כמויות הרנ"א (ריכוז מבוסס UV (ng/μL)/ריכוז מבוסס פלואורסצנציה (ng/μL)) חושב כדי להעריך את האיכות ליישום ניסיוני נוסף. לדוגמה, כאשר ריכוזי UV וריכוזים פלואורסצנטיים הם 80 ng/uL ו-60 ng/uL, בהתאמה, היחס יהיה 1.5 (80/60). בדרך כלל, יחסים מתחת ל-1.5 מצביעים על טוהר מספיק עבור יישומים במורד הזרם באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה¹³.
14. נתח את איכות הרנ"א באמצעות שבב אלקטרופורזה¹⁴.
15. השתמש ב-RNA המוסמך כדי להכין את ספריית הרנ"א באמצעות ערכת הכנת ספריית RNA (ראה טבלת חומרים). רוצף את הספריות באמצעות פלטפורמה המתאימה לספריות המוכנות.

תוצאות

הקמת קווים מארחים ותחזוקתם
הכדאיות של זחלים שנאספו בשדה מיוחסת באופן שונה למיקום השדה, לעונות השנה ולתנאי הגידול (למשל, 90% מהכדאיות בטייוואן, טאויואן, כפי שמוצג ב-Arai et ^al.12). כ-30%-50% מהזוגות ייצרו את הדור הבא כרגיל. עבור H. magnanima ו - A. honmai, מטרילינים נשמרו על ידי רב...

Discussion

טורטרייד כולל מספר מזיקים חקלאיים וייעוריים; המחקר הנוכחי הציג שיטות לגידול טורטריקס במשך דורות, התבוננות באמבריוגנזה ובמין של החרקים, וביצוע אנליזה מולקולרית באמצעות עוברים בוגרים.

אחד המכשולים בחקר חרקי ההדברה הוא קביעת שיטות גידול. במיוחד, הרבייה לפעמים להשפיע על הכוש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 ounce cup	FP CHUPA	CP070009	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit	Agilent Technologies	5067-1511	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf
benzalkonium chloride solution	Nihon Pharmaceutical Co., Ltd	No.4987123116046	Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton	AOUME	8-1611-02	insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution	Dojindo, Tokyo, Japan	340-07971	stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit	Invitrogen	Q33231	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column	Epoch Life Science Inc.	EP-11201	RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper	HEIKO	2100010	insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7770S	Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	160-16061	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)	Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan	not shown	Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution	Merck	71049-4CN	DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution	Qiagen	158912	DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4	Invitrogen	Q33238	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit	Invitrogen	Q32855	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution	Nippon Gene	313-01461	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015