Tortricidae 해충 곤충의 대량 사육 및 분자 연구

요약

본 프로토콜은 실험실에서 tortricid 해충 곤충의 사육 방법을 설명합니다. 곤충의 성별을 구별하고 높은 처리량의 시퀀싱을 위해 핵산을 추출하는 절차는 두 개의 tortricid 해충을 사용하여 확립됩니다.

초록

Tortricidae (Lepidoptera)는 일반적으로 tortrix 또는 leafroller 나방으로 알려져 있으며 심각한 농업 손실을 초래하는 많은 농업 및 임업 해충으로 구성됩니다. 그러한 해충 나방의 생물학을 이해하기 위해서는 근본적인 기술이 많이 요구되어 왔습니다. 여기에서, 질량 사육, 관찰 및 분자 연구를위한 방법은 두 개의 차 tortrix, Homona magnanima 및 Adoxophyes honmai (Lepidoptera : Tortricidae)를 사용하여 개발됩니다. 곤충은 얇게 썬 인공 식단으로 대량 사육되었으며 생물학적 특성을 고려하여 100 세대 이상 근친 교배로 유지되었습니다. 곤충은 다양한 성 이형성을 가지고 있습니다. 따라서 후속 분석을 방해 한 개발 단계에서 성별을 구별하는 것은 어렵습니다. 본 연구는 토트리시드 유충의 성별이 여성 특이적 W 염색체를 시각화하기 위해 고환 또는 락틱 - 아세트산 오르세인 염색을 관찰함으로써 결정될 수 있음을 강조했다. 또한, 성 결정 방법을 사용하여, 본 연구는 성 결정된 배아로부터 핵산 추출을 가능하게 하고 높은 처리량 시퀀싱을 향한 응용을 가능하게 하였다. 이 팁은 다른 해충 곤충에 적용 할 수 있으며 더 많은 형태 학적 및 유전 적 연구를 촉진 할 것입니다.

서문

Lepidopteran 곤충은 설명 된 모든 살아있는 종 1의¹⁰ % 이상을 나타내며, 특정 택시 종은 식물에 심각한 피해와 심각한 농업 손실 ^2,3을 초래합니다. 누에 봄비엑스 모리^4,5와 같은 모델 곤충을 사용하여 분자 및 유전 연구가 개발되었지만 해충 곤충은^{부분적으로 6,7}을 사육하고 처리하는 데 어려움이 있기 때문에 조사되지 않은 채로 남아 있습니다. 따라서 이러한 비 모델 해충 곤충의 생물학을 이해하기 위해서는 근본적인 연구와 기술이 필요합니다.

Tortricidae (Lepidoptera)는 일반적으로 tortrix 또는 leafroller 나방으로 알려져 있으며 많은 농업 및 임업 해충^{을 포함합니다 8}. 곤충 택시 중 동양 차 토트릭스 호모나 마그나니 마 디아코노프와 여름 과일 토르트릭 스 아독소피에스 혼마이 야스다(Adoxophyes honmai Yasuda)는 동아시아⁷의 티 트리를 손상시키는 것으로 알려진 심각한 다식성 해충이다. 두 종은 모성 분비물로 덮인 얇고 부드럽고 깨지기 쉬운 알로 구성된 평평하고 타원형의 비늘과 같은 달걀 클러스터 (또는 달걀 덩어리)를 낳습니다. 배아 발생 단계는 곤충 발달과 성 결정⁹에 중요하지만, 난자의 구조는 추가 분석이 곤충의 생물학을 이해하는 것을 방해합니다. 이러한 복잡한 난자 덩어리를 산란시키는 해충에 대한 추가 연구를위한 어려움을 극복하는 것이 중요합니다.

여기에서, tortricids의 생물학을 이해하기 위해, 대량 양육, 관찰 및 분자 연구를위한 방법이 A. honmai 및 H. magnanima를 사용하여 개발되었습니다. 첫째, 대량 사육 방법은 교배에 의해 100 세대 이상 두 토트리시드를 유지합니다. 연접 스케일 유사 난자 질량으로부터 난자를 분리하는 것은 파리¹⁰에서 사용 된 기술로부터 이전에 개발 된 알칼리성 및 유기 용매를 사용하여 토트리시드의 배아 발생 관찰을 촉진시켰다. 또한, 본 연구는 락틱-아세트산 오르세인¹¹을 이용한 레피도프테란 암컷의 성염색물의 염색법을 개발함으로써 작은 배아의 성차별을 확립하였다. 이러한 방법들을 조합함으로써, 높은 품질과 양의 핵산이 결정성 배아로부터 추출되었고, 이는 그렇지 않으면 확립하기 어려웠던⁶. 추출된 RNA는 차세대 시퀀싱에 활용되었다. 총체적으로, 여기에 제시된 방법은 다른 lepidopteran 곤충 및 다른 곤충 택시에 적용됩니다.

프로토콜

1. 곤충 수집 및 대량 사육

1. 이전에 출판 된 참고 문헌 ^8,12에 따라 들판에서 tortricid 곤충을 수집^하십시오.
   참고 : H. magnanima 및 A. honmai 유충은 손상된 찻잎에서 수집됩니다 (그림 1A); 성인은 4W 휴대용 UV 광 (365nm 파장, 재료 표, 그림 1B 참조)을 사용하여 끌립니다.
2. 수집 된 유충 (그림 1C, D)을 성인이 될 때까지 2-3 주 동안 1/2-oz 컵의 인공 식단에 개별적으로 보관하십시오 (그림 1E, F). 형태 학적 특성으로 번데기와 성인의 성별을 확인하십시오 (그림 1G, I).
3. 남성과 여성을 플라스틱 상자 (30cm x 20cm x 5cm)에 짝짓기하여 파라핀 종이에 난자 덩어리를 산란시킵니다 (그림 1J-L). 암컷과 수컷 두 마리를 파라핀 종이 조각과 함께 120mL 플라스틱 컵에 담아 모계를 만든다.
   참고 : 파라핀 종이에 주름을 만드는 것이 중요합니다. H. magnanima의 경우, 파라핀 종이는 케이스의 바닥에 있어야합니다. 한편, A. honmai의 경우, H. magnanima 산란 달걀 덩어리가 찻잎의 윗면에 있기 때문에 계란을 수집하기 위해 케이스 천장에 종이를 넣었지만 A. honmai는 잎의 아래쪽에 알을 낳습니다⁸. 이 절차는 다른 tortricid 종에서도 확인되었으며, 대상 종의 생태와 행동이 명확하지 않은 경우 양쪽에 논문을 배치하는 것이 좋습니다.
4. 가위로 파라핀 종이에 달걀 덩어리 (달걀 질량 당 약 100-200 개의 계란¹², 그림 1M)를 잘라냅니다. 계란을 5-7 일 동안 버려진 종이와 함께 1/2 온스 컵에 넣으십시오.
   참고: 성숙된 배아는 블랙헤드 캡슐을 나타냅니다(그림 1N). 배아 발생의 기간은 tortricid 종에 다양하게 기인하지만, 일반적으로 H. magnanima 의 경우 산란 후 5 일, A. honmai 의 경우 4 dpo는 25 °C에서 60 % 상대 습도, 16 h 빛 / 8 시간 암흑 사이클⁷.
5. 검은 머리 캡슐을 보여주는 계란 덩어리를 4-8 °C에서 7 일 동안 보관하십시오.
6. 대량 사육을위한 강판을 사용하여 ~ 60g의 인공 식단을 슬라이스하십시오. 성숙한 배아로 채워진 계란 덩어리를 얇게 썬 인공 식단에 플라스틱 용기 (23cm x 16cm x 8cm)에 놓습니다. 얇게 썬 식단으로 달걀 덩어리에 파라핀 종이를 놓습니다 (그림 10).
   참고: 상대 습도가 30% 미만이면 건조한 것으로 간주되지만 70% 이상은 너무 습기가 많습니다. 플라스틱 용기의 뚜껑에 구멍을 만드는 것이 더 나은 환기를 가능하게하는 것이 좋습니다. 작은 애벌레의 탈출을 막기 위해 구멍을 면화로 채 웁니다.
7. 계란에서 표면 오염 물질을 제거하려면 계란 덩어리를 3 % 포르말린과 0.2 % 벤잘코늄 클로라이드 용액에 각각 5 분 동안 담그^{십시오 12}. 장내 또는 세포 내 박테리아를 근절하려면 정상적인 인공 식단 대신 0.05 % (w / w) 테트라 사이클린 염산염 또는 0.06 % (w / w) 리팜피신이 보충 된 인공 식단을 사용하십시오 ( 자료 표 참조).
   참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 실크 메이트 2S와 0.05 % (w / w) 테트라 사이클린 염산염 또는 0.06 % (w / w) 리팜피신을 일관성을 위해 동등하게 반죽하는 것이 중요합니다.
8. 플라스틱 용기에서 번데기를 수집하고 형태 학적¹² 특성에 따라 성별을 구별하십시오 (그림 1G-I).
   참고 : 일반적으로 tortricids는 번데기¹²까지 5-6 개의 별을 나타냅니다. H. magnanima 와 A. honmai 유충은 번식 할 때까지 부화 한 후 각각 3 주와 2 주가 걸립니다.
9. 25°C, 16L/8D로 짝짓기를 하기 위해 플라스틱 상자(30cm x 20cm x 5cm, 그림 1K)에 수컷 15마리와 암컷 10마리를 넣고 5-7일마다 알을 모으고 1.4-1.9단계를 반복한다. 각 세대를 위해.
   참고 : 후속 분석을 위해 새로 산란 된 난자 덩어리를 수집해야하는 경우 암흑기의 시작과 끝 (예 : 오전 9 시부 터 오후 5 시까 지)을 설정하십시오. 이 상태에서 H. magnanima 와 A. honami 는 보통 5 h (2 PM) 후에 산란 알을 낳습니다.

2. 고정, 투과 및 염색을 위해 난자 덩어리에서 난자와 pharate 유충을 분리합니다.

1. 달걀 덩어리를 1,000 μL의 1.2% 차아염소산나트륨 수용액에 넣고 10분 동안 담그거나 1,000 μL의 5 M 수산화칼륨 수용액을 넣고 30분 동안 달걀을 분리하였다.
2. 분리된 난자를 1,000 μL의 PBSt (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM_KH2PO4, 0.05% 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트[Tween-20] pH 7.4, 물질표 참조)로 세척하고, 앞서 발표된 보고서⁷에 이어.
3. 500 μL의 100 % 헵탄과 500 μL의 4 % 파라포름 알데히드 - PBSt 용액 (w / v)의 혼합물에 계란을 담그십시오. 와류 혼합기를 사용하여 1,500 rpm에서 10분 동안 혼합한다.
4. 계란을 500 μL의 100% 헵탄과 500 μL의 100% 메탄올의 혼합물에 담그십시오. 1,500 rpm에서 10 분 동안 혼합하십시오.
5. 계란을 100% 메탄올 중 1,000μL로 두 번 세척하고 추가 실험이 있을 때까지 4°C에서 100% 메탄올에 보관한다(도 2A).
   참고 : 계란은 4 ° C에서 적어도 1 년 동안 보관할 수 있습니다.
6. 계란을 99%, 70%, 50% 에탄올 및 PBSt에 순차적으로 담그고 친수화를 위해 각각 5분 동안 이전에 발표된 보고서⁷에 이어 담그십시오.
7. PBSt로 달걀을 씻고 달걀을 1 μg / mL의 DAPI 용액에 5 분 동안 담근 다음 1x PBS로 계란을 두 번 씻으십시오. 1.25% (w/w) 락틱-아세트산 오르세인 용액 20μL에 알을 담그십시오 ( 물질 표 참조)¹¹ 핵이 화려한 붉은 색을 나타낼 때까지 헤테로 크로마틴을 시각화하십시오 (이것은 5-60 분에서 다름) (그림 2B, C).
   참고 : lactic-acetic orcein 염색 기간은 온도와 습도에 따라 다릅니다. 4x-10x 배율의 현미경을 사용하여 적절한 염색을 확인하는 것이 좋습니다.
8. 피펫을 사용하여 스테인드 에그를 유리 슬라이드로 옮깁니다. 얼룩진 달걀을 안티페이드 시약 ( 재료 표 참조)과 커버 글라스⁷로 감싸십시오.
9. 포셉을 사용하여 난자 덩어리로부터 pharate H. magnanima 및 A. honmai 유충 (산란 후 4-5 일 (dpo))을 추출합니다 (그림 2D). 유리 슬라이드에 비스 세트 유충 (그림 2E).
10. 모든 조직(예: 식도 신경절, 흉부 신경절, 말피기안 세뇨관 등)을 1:3(v/v) 99.7% 아세트산/100% 메탄올의 혼합물로 5분 동안 고정시킨다. 핵이 염색 될 때까지 1.25 % (w / w) 락틱 - 아세트산 오르세인 용액⁽¹¹⁾ 을 가진 사람들을 얼룩지게하십시오 (이것은 온도와 습도에 따라 5-60 분이 걸릴 수 있음).
11. 헤테로크로마틴(W 염색체, 도 2F, G)의 존재(여성) 또는 부재(남성)를 현미경으로 관찰하여 각 표본의 성별을 확인하였다.
    참고 : 성별은 성 크로마틴을 시각화하여 결정됩니다. 각 세포는 암컷^11,12에서 점으로 크로마틴성을 나타내고, pharate larval 조직의 나머지 부분 (고정되지 않음)은 즉시 세포 용해 완충액 ¹² (10 mM Tris-HCl^{, 100} mM EDTA, 및 1 % SDS, pH 8.0) 또는 DNA 또는 RNA 추출을위한 페놀 함유 RNA 추출 시약에 침지되어야합니다. 해부 전에 시약 20μL를 0.2 mL PCR 튜브에 미리 분주한다(도 3A). 샘플을 침지하고 추가 추출될 때까지 -80°C에서 보관한다. 샘플은 적어도 3개월 동안 저장될 수 있지만, 핵산의 분해를 방지하기 위해 하류 실험을 진행하는 것이 더 좋다.

3. 성별 결정된 pharate 유충으로부터의 DNA 및 RNA 추출

1. 풀(12)성 결정된 수컷 또는 암컷 pharate 유충 (5 dpo 배아) 및 세포 용해 완충액 또는 RNA 추출 시약 (단계 2.11 및 표 참조) 중 하나를 하나의 1.5 mL 튜브에 첨가 한다.
   참고: DNA 추출의 경우 3.2-3.7단계, RNA 추출의 경우 3.8-3.11단계를 따르십시오.
2. 조직을 600 μL의 세포 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 및 1% SDS, pH 8.0)으로 균질화하고, 샘플을 4°C에서 5분 동안 10,000 x g 에서 원심분리한다.
3. 피펫을 사용하여 상청액 (500 μL)을 수집하고, 열 블록 상에서 5 h 동안 1.5 μL의 프로테이나제 K (20 mg/mL, 표 참조)와 함께 50°C에서 인큐베이션한다.
4. 샘플을 10 mg/mL의 RNase 용액 1.0 μL로 30분 동안 37°C에서 처리한다( 물질 표 참조).
5. 200 μL의 단백질 침전 용액 ( 표 참조)을 튜브⁷에 첨가하고, 4°C에서 10분 동안 17,000 x g 에서 원심분리하였다.
6. 상청액(500 μL)을 500 μL의 100% 이소프로판올과 혼합한 다음, 4°C에서 10분 동안 20,400 x g 에서 원심분리한다.
7. 펠릿화된 DNA를 1,000 μL의 70% 에탄올로 두 번 세척한다. 이어서, 공기-건조 (실온에서 5-10분), DNA를 30 μL의 10 mM Tris-Cl 완충액 (pH 8.5)에 용해시킨다.
8. 600 μL의 RNA 추출 시약으로 조직을 균질화하고 튜브에 초순수 증류수 240 μL를 첨가한다. 튜브를 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.
9. 상청액(600 μL)을 600 μL의 100% 이소프로판올과 혼합하고 혼합물을 실리카 스핀 컬럼으로 옮긴다( 표 참조). 튜브를 4°C에서 1분 동안 17,900 x g 에서 원심분리한다.
10. 컬럼을 750 μL의 70% 에탄올로 세척하고, 컬럼을 4°C에서 각각 1분 동안 17,900 x g 에서 두 번 원심분리한다.
11. 초순수 증류수 15 μL를 컬럼에 적재합니다. 튜브를 4°C에서 1분 동안 17,900 x g 에서 원심분리하여 RNA를 용출시켰다.
12. UV 기반 분광광도계를 사용하여 DNA 및 RNA의 품질과 양을 계산하고 검증합니다. A260/A280(핵산/단백질) 및 A260/A230(핵산/염 및 기타 오염물질) 비율¹³을 사용하여 핵산의 순도를 평가합니다.
    주: RNA 추출을 위해, 이전에 공개된 절차¹² 를 따랐고, 이는 페놀 오염을 초래하였다(표 1). 단일 배아 또는 pharate 유충으로부터 추출된 DNA 및 RNA는 저량 및 저품질 샘플을 산출한다. 일반적으로 12 마리의 pharate 유충에서 DNA 추출은 100-600 ng을 산출하는 반면, 현재의 방법을 사용한 RNA 추출은 표 1과 같이 900-1,500 ng을 생성합니다.
    참고: 3.13-3.15단계는 고처리량 시퀀싱의 추가 분석을 위해 선택 사항입니다.
13. 형광 기반 분광광도계를 사용하여 DNA 및 RNA의 양을 계산한다.
    참고: RNA 양(UV 기반 농도(ng/μL)/형광 기반 농도(ng/μL))의 비율은 추가 실험 적용을 위한 품질을 평가하기 위해 계산되었습니다. 예를 들어, UV 및 형광 기반 농도가 각각 80ng/uL 및 60ng/uL인 경우 비율은 1.5(80/60)가 됩니다. 일반적으로 1.5 미만의 비율은 높은 처리량 시퀀싱⁽¹³)을 사용하는 다운스트림 애플리케이션에 대해 충분한 순도를 나타낸다.
14. 마이크로칩 전기영동(¹⁴)을 이용하여 RNA의 품질을 분석한다.
15. RNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 RNA 라이브러리를 제조하기 위해 정규화된 RNA를 활용한다( 표 문헌 참조). 준비된 라이브러리에 적합한 플랫폼을 사용하여 라이브러리를 시퀀스합니다.

결과

호스트 라인의 설립 및 유지 보수
현장에서 수집 된 유충의 생존 가능성은 현장 위치, 계절 및 양육 조건 (예 : Arai et ^al.12에 표시된 바와 같이 대만, 타오 위안에서의 생존 가능성의 90 %)에 따라 다르게 기인합니다. 약 30 % -50 %의 쌍이 평소와 같이 다음 세대를 생성합니다. H. magnanima 와 A. honmai의 경우, 모계는 100 세대 이상 근친 교배에 의해 유지되었습?...

토론

Tortricid는 여러 농업 및 임업 해충을 포함합니다. 본 연구는 세대에 걸쳐 토트릭스를 후방하고, 곤충의 배아 발생과 성별을 관찰하고, 성숙한 배아를 사용하여 분자 분석을 수행하는 방법을 제시했습니다.

해충 곤충 연구의 장애물 중 하나는 사육 방법을 수립하는 것입니다. 특히, 근친 교배는 때때로 종의 적합성에 부정적인 영향을 미칩니다. 근친 교배 우울증이라고 불리는 ?...

자료

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1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
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heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
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ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
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MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
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ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
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rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
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Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015