Массовое выращивание и молекулярные исследования насекомых-вредителей Tortricidae

Резюме

Настоящий протокол описывает метод выращивания насекомых-вредителей в лабораториях. Процедуры различения пола насекомых и извлечения нуклеиновых кислот для высокопроизводительного секвенирования установлены с использованием двух вредителей тортрицидов.

Аннотация

Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей, которые вызывают серьезные сельскохозяйственные потери. Чтобы понять биологию таких мотыльков-вредителей, фундаментальные методы были очень востребованы. Здесь методы массового выращивания, наблюдений и молекулярных исследований разрабатываются с использованием двух чайных тортриксов, Homona magnanima и Adoxophyes honmai (Чешуекрылые: Tortricidae). Насекомые массово выращивались с помощью нарезанной искусственной диеты и поддерживались путем инбридинга в течение более 100 поколений, учитывая их биологические особенности. Насекомые имеют различные половые диморфизмы; следовательно, трудно различить пол на развивающихся стадиях, что помешало последующим анализам. В настоящей работе подчеркивается, что пол личинок тортрицидов может быть определен путем наблюдения за яичками или молочно-уксусным окрашиванием орцеина для визуализации женско-специфической W-хромосомы. Кроме того, используя методы определения пола, настоящее исследование позволило экстрагировать нуклеиновые кислоты из эмбрионов, определенных полом, и применять их для секвенирования с высокой пропускной способностью. Эти советы применимы для других насекомых-вредителей и облегчат дальнейшие морфологические и генетические исследования.

Введение

Чешуекрылые насекомые составляют более 10% всех описанных живых видов¹, а некоторые виды таксонов наносят серьезный ущерб растениям и серьезные сельскохозяйственные потери ^2,3. Хотя молекулярные и генетические исследования были разработаны с использованием модельных насекомых, таких как шелкопряд Bombyx mori ^4,5, насекомые-вредители остаются неисследованными, отчасти из-за трудностей с выращиванием и обработкой ^6,7. Поэтому необходимы фундаментальные исследования и методы, чтобы понять биологию таких немодельных насекомых-вредителей.

Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей⁸. Из таксонов насекомых восточный чайный тортрикс Homona magnanima Diakonoff и летний фруктовый тортрикс Adoxophyes honmai Yasuda являются серьезными полифаговыми вредителями, которые, как известно, повреждают чайные деревья в Восточной Азии⁷. Два вида откладывают плоские и овальные чешуйчатые скопления яиц (или яичные массы), состоящие из тонких, мягких и хрупких яиц, покрытых материнскими выделениями. Хотя стадии эмбриогенеза имеют решающее значение для развития насекомых и определения пола⁹, структуры яиц препятствуют дальнейшему анализу понимания биологии насекомых. Важно преодолеть трудности для дальнейшего изучения вредителей, яйцекладущих такую сложную яичную массу.

Здесь, чтобы понять биологию тортрицидов, методы массового выращивания, наблюдения и молекулярные исследования были разработаны с использованием A. honmai и H. magnanima. Во-первых, методы массового выращивания поддерживают обоих рубцов более 100 поколений инбредными. Отделение яиц от сцепленной чешуйчатой яичной массы облегчило наблюдение за эмбриогенезом рубцов с использованием щелочных и органических растворителей, ранее разработанных на основе методов, используемых у мух¹⁰. Кроме того, в настоящем исследовании установлена дискриминация по признаку пола мелких эмбрионов путем разработки методов окрашивания полового хроматина самок чешуекрылых с использованием молочно-уксусного орцеина¹¹. Комбинируя эти методы, высокое качество и количество нуклеиновых кислот извлекали из эмбрионов, определяемых полом, что в противном случае было трудно установить⁶. Извлеченная РНК использовалась для секвенирования следующего поколения. В совокупности методы, представленные здесь, применимы к другим чешуекрылым насекомым и другим таксонам насекомых.

протокол

1. Сбор насекомых и массовое выращивание

1. Собирайте тортрицидных насекомых с полей в соответствии с ранее опубликованными ссылками ^8,12.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки H. magnanima и A. honmai собирают из поврежденных чайных листьев (рисунок 1А); взрослых привлекают с помощью портативного ультрафиолетового света мощностью 4 Вт (длина волны 365 нм, см. Таблицу материалов, рисунок 1B).
2. Выращивайте собранных личинок (рисунок 1C, D) индивидуально на искусственной диете в чашке 1/2 унции в течение 2-3 недель до эклозии взрослого человека (рисунок 1E,F). Подтверждают пол куколок и взрослых особей по морфологическим признакам (рисунок 1G,I).
3. Соедините самцов и самок в пластиковой коробке (30 см х 20 см х 5 см) для яйцекладки яйцевидных масс на парафиновой бумаге (рисунок 1J-L). Поместите самку и двух самцов в пластиковый стаканчик объемом 120 мл с кусочком парафиновой бумаги, чтобы установить матрилин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сделать складки на парафиновой бумаге. Для H. magnanima парафиновая бумага должна быть на дне корпуса. Между тем, для A. honmai, положите бумагу на потолок корпуса для сбора яиц (рисунок 1L), так как H. magnanima яйцекладет яичную массу на верхней стороне чайных листьев, но A. honmai откладывает яйца на нижней стороне листьев⁸. Процедуры были также проверены на других видах тотеррикидов, и лучше размещать документы с обеих сторон, если экология и поведение целевых видов не прояснены.
4. Вырежьте яичные массы (примерно 100-200 яиц на яичную массу¹², рисунок 1М) на парафиновой бумаге ножницами. Поместите яйца в стаканчик по 1/2 унции с сброшенной бумагой на 5-7 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелый эмбрион демонстрирует угревую капсулу (рисунок 1N). Периоды эмбриогенеза по-разному относятся к тортрицидным видам, но обычно 5 дней после яйцекладки (dpo) для H. magnanima и 4 dpo для A. honmai при 25 °C при 60% относительной влажности, 16 ч света / 8 ч темных циклов⁷.
5. Хранить яичные массы с черной головкой капсул при 4-8 °C в течение 7 дней.
6. Нарежьте ~60 г искусственных диет с помощью терки для массового выращивания. Поместите яичную массу, наполненную созревшими эмбрионами, на нарезанную искусственную диету в пластиковый контейнер (23 см х 16 см х 8 см). Поместите парафиновую бумагу на яичную массу с нарезанными диетами (рисунок 10).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Относительная влажность ниже 30% считается более сухой, в то время как более 70% слишком влажной. Создание отверстий на крышке пластикового контейнера лучше для обеспечения лучшей вентиляции. Заполните отверстия хлопком, чтобы предотвратить побег мелких личинок.
7. Для устранения поверхностных загрязнений из яиц замочите яичную массу в 3% формалине и 0,2% растворе бензалкония хлорида в течение 5 мин, соответственно¹². Чтобы искоренить кишечные или внутриклеточные бактерии, используйте искусственную диету, дополненную 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлоридом или 0,06% (мас./мас.) рифампицином вместо обычной искусственной диеты (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Важно замешивать Silk Mate 2S и 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлорида или 0,06% (мас./мас.) рифампицина, равнозначно консистенции.
8. Соберите куколок из пластикового контейнера и различайте пол на основе морфологических¹² характеристик (рисунок 1G-I).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, тортрициды имеют 5-6 звезд до окукливания¹². Личинкам H. magnanima и A. honmai требуется 3 недели и 2 недели соответственно после вылупления до окукливания.
9. Поместите 15 самцов и 10 самок в пластиковый ящик (30 см х 20 см х 5 см, рисунок 1К) для спаривания с 25 °C, 16 л/8 D. Соберите яйца за 5-7 дней и повторите шаги 1,4-1,9. для каждого поколения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется сбор вновь яйцекладущих яйцекладущих яичных масс для последующего анализа, установите начало и конец темного периода, например, с 9 утра до 5 вечера. В этом состоянии H. magnanima и A. honami обычно яйцекладут яйца через 5 ч (2 часа дня).

2. Отделение яиц и личинок фарата от яичных масс для фиксации, пермеабилизации и окрашивания

1. Замочите яичную массу в 1000 мкл 1,2% водного раствора гипохлорита натрия в течение 10 мин или в 1000 мкл водного раствора 5 М гидроксида калия в течение 30 мин для отделения яиц.
2. Вымойте отделенные яйца в 1000 мкл PBSt (137 мМ NaCl, 8,1 мМ Na₂HPO₄, 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH₂PO₄, 0,05% полиоксиэтилена (20) сорбитана монолаурата [Tween-20] pH 7,4, см. Таблицу материалов) после ранее опубликованного отчета⁷.
3. Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 4% раствора параформальдегида-ПБСт (мас./об.). Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин с помощью вихревого смесителя.
4. Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 100% метанола. Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин.
5. Дважды промыть яйца 1000 мкл 100% метанола и хранить при 4 °C в 100% метаноле до дальнейших экспериментов (рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут храниться не менее 1 года при температуре 4 °C.
6. Замачивайте яйца последовательно в 99%, 70%, 50% этаноле и PBSt в течение 5 мин каждый для гидрофилизации после ранее опубликованного отчета⁷.
7. Вымойте яйца с PBSt, погрузите яйца в 1 мкг/мл раствора DAPI на 5 мин, а затем дважды вымойте яйца 1x PBS. Замочите яйца в 20 мкл 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусном орцеиновом растворе (см. Таблицу материалов)¹¹ для визуализации гетерохроматина до тех пор, пока ядра не проявят ярко-красный цвет (это варьируется от 5 до 60 мин) (рисунок 2B,C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Периоды окрашивания молочно-уксусного орцеина зависят от температуры и влажности. Лучше проверить правильность окрашивания с помощью микроскопа с увеличением 4х-10х.
8. Переложите витражи с помощью пипетки на стеклянную горку. Заключите витражные яйца в антизатухающий реагент (см. Таблицу материалов) и покровное стекло⁷.
9. Извлеките фарат H. magnanima и личинки A. honmai (через 4-5 дней после яйцекладки (dpo)) из яичных масс с помощью щипцов (рисунок 2D). Разделите личинок пополам на стеклянной горке (рисунок 2Е).
10. Фиксируют любые ткани (например, субэзофагеальные ганглии, грудные ганглии, мальпигиевы канальцы и др.) смесью 1:3 (v/v) 99,7% уксусной кислоты/100% метанола в течение 5 мин. Окрашивают их 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусным орцеином^{раствором 11} до окрашивания ядер (это может занять 5-60 мин, в зависимости от температуры и влажности).
11. Определите пол каждого образца, наблюдая за наличием (женским) или отсутствием (мужской) гетерохроматина (W-хромосома, рисунок 2F, G) под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пол определяется путем визуализации полового хроматина. Каждая клетка представляет собой половой хроматин в виде точки у самок ^11,12, в то время как оставшаяся часть фаратных личиночных тканей (не фиксированная) должна быть немедленно погружена в буфер лизиса клеток¹² (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) или фенолсодержащие реагенты экстракции РНК для экстракции ДНК или РНК. Перед рассечением дозируйте 20 мкл реагентов в 0,2 мл ПЦР-пробирок заранее (рисунок 3А). Погружайте и храните образцы при температуре -80 °C до дальнейшей экстракции. Образцы могут храниться не менее 3 месяцев, но лучше приступить к последующим экспериментам, чтобы предотвратить деградацию нуклеиновых кислот.

3. Извлечение ДНК и РНК из половых детерминированных личинок фарата

1. Объедините 12 определяемых полом мужских или женских личинок фарата (эмбрион 5 дпо) и добавьте либо буфер лизиса клеток, либо реагенты экстракции РНК (см. этап 2.11 и Таблицу материалов) в одну трубку объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.2-3.7 для экстракции ДНК и шаги 3.8-3.11 для экстракции РНК.
2. Гомогенизировать ткани в 600 мкл буфера лизиса клеток (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) и центрифугировать образцы при 10 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
3. Собирают супернатант (500 мкл) с помощью пипетки и инкубируют при 50 °C с 1,5 мкл протеиназы K (20 мг/мл, см. Таблицу материалов) в течение 5 ч на тепловом блоке.
4. Обрабатывайте образцы 1,0 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы (см. Таблицу материалов) при 37 °C в течение 30 мин.
5. Добавляют 200 мкл раствора осаждения белка (см. Таблицу материалов) в пробирки⁷, а затем центрифугу при 17 000 х г в течение 10 мин при 4°С.
6. Смешайте супернатант (500 мкл) с 500 мкл 100% изопропанола, а затем центрифугу при 20 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
7. Дважды промыть гранулированную ДНК 1000 мкл 70% этанола. Затем, высушив на воздухе (5-10 мин при комнатной температуре), растворяют ДНК в 30 мкл 10 мМ буфера Tris-Cl (рН 8,5).
8. Гомогенизировать ткани в 600 мкл реагентов для экстракции РНК и добавить в пробирку 240 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте пробирки при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
9. Смешайте супернатант (600 мкл) с 600 мкл 100% изопропанола и перенесите смесь в спиновую колонну кремнезема (см. Таблицу материалов). Центрифугируйте пробирки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
10. Промыть колонну 750 мкл 70% этанола и дважды центрифугировать колонну по 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
11. Загрузите в колонну 15 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте трубки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C для элюляции РНК.
12. Рассчитайте и проверьте качество и количество ДНК и РНК с помощью спектрофотометра на основе ультрафиолета. Оцените чистоту нуклеиновых кислот, используя соотношения A260/A280 (нуклеиновые кислоты/белок) и A260/A230 (нуклеиновые кислоты/соли и другие загрязняющие вещества)¹³.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции РНК соблюдалась ранее опубликованная процедура¹² , в результате чего приводило к фенольному загрязнению (таблица 1). Извлеченная ДНК и РНК из одного эмбриона или личинок фарата дает образцы низкого количества и низкого качества. Как правило, экстракция ДНК из 12 личинок фарата дает 100-600 нг, в то время как экстракция РНК с использованием текущего метода генерирует 900-1 500 нг, как показано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.13-3.15 являются необязательными для дальнейших анализов последовательности высокой пропускной способности.
13. Рассчитайте количество ДНК и РНК с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки качества для дальнейшего экспериментального применения было рассчитано соотношение количеств РНК (концентрация на основе УФ-излучения (нг/мкл)/концентрация на основе флуоресценции (нг/мкл)). Например, когда концентрации на основе УФ и флуоресценции составляют 80 нг/ул и 60 нг/ул соответственно, соотношение будет составлять 1,5 (80/60). Обычно коэффициенты ниже 1,5 указывают на достаточную чистоту для последующих применений с использованием высокопроизводительного секвенирования¹³.
14. Анализ качества РНК с помощью микрочипового электрофореза¹⁴.
15. Используйте квалифицированные РНК для подготовки библиотеки РНК с помощью комплекта для подготовки библиотеки РНК (см. Таблицу материалов). Упорядочивайте библиотеки с помощью платформы, подходящей для подготовленных библиотек.

Результаты

Создание хост-линий и их обслуживание
Жизнеспособность собранных в полевых условиях личинок по-разному объясняется расположением поля, сезонами и условиями выращивания (например, 90% жизнеспособности на Тайване, Таоюань, как показано в Arai et ^al.12). Примерно 30%-50% пар ...

Обсуждение

Tortricid включает в себя несколько сельскохозяйственных и лесных вредителей; в настоящем исследовании представлены методы выращивания черепахи на протяжении поколений, наблюдения за эмбриогенезом и полом насекомых и проведения молекулярного анализа с использованием зрелых эмбрионов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 ounce cup	FP CHUPA	CP070009	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit	Agilent Technologies	5067-1511	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf
benzalkonium chloride solution	Nihon Pharmaceutical Co., Ltd	No.4987123116046	Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton	AOUME	8-1611-02	insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution	Dojindo, Tokyo, Japan	340-07971	stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit	Invitrogen	Q33231	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column	Epoch Life Science Inc.	EP-11201	RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper	HEIKO	2100010	insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7770S	Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	160-16061	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)	Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan	not shown	Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution	Merck	71049-4CN	DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution	Qiagen	158912	DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4	Invitrogen	Q33238	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit	Invitrogen	Q32855	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution	Nippon Gene	313-01461	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015