Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает метод выращивания насекомых-вредителей в лабораториях. Процедуры различения пола насекомых и извлечения нуклеиновых кислот для высокопроизводительного секвенирования установлены с использованием двух вредителей тортрицидов.

Аннотация

Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей, которые вызывают серьезные сельскохозяйственные потери. Чтобы понять биологию таких мотыльков-вредителей, фундаментальные методы были очень востребованы. Здесь методы массового выращивания, наблюдений и молекулярных исследований разрабатываются с использованием двух чайных тортриксов, Homona magnanima и Adoxophyes honmai (Чешуекрылые: Tortricidae). Насекомые массово выращивались с помощью нарезанной искусственной диеты и поддерживались путем инбридинга в течение более 100 поколений, учитывая их биологические особенности. Насекомые имеют различные половые диморфизмы; следовательно, трудно различить пол на развивающихся стадиях, что помешало последующим анализам. В настоящей работе подчеркивается, что пол личинок тортрицидов может быть определен путем наблюдения за яичками или молочно-уксусным окрашиванием орцеина для визуализации женско-специфической W-хромосомы. Кроме того, используя методы определения пола, настоящее исследование позволило экстрагировать нуклеиновые кислоты из эмбрионов, определенных полом, и применять их для секвенирования с высокой пропускной способностью. Эти советы применимы для других насекомых-вредителей и облегчат дальнейшие морфологические и генетические исследования.

Введение

Чешуекрылые насекомые составляют более 10% всех описанных живых видов1, а некоторые виды таксонов наносят серьезный ущерб растениям и серьезные сельскохозяйственные потери 2,3. Хотя молекулярные и генетические исследования были разработаны с использованием модельных насекомых, таких как шелкопряд Bombyx mori 4,5, насекомые-вредители остаются неисследованными, отчасти из-за трудностей с выращиванием и обработкой 6,7. Поэтому необходимы фундаментальные исследования и методы, чтобы понять биологию таких немодельных насекомых-вредителей.

Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей8. Из таксонов насекомых восточный чайный тортрикс Homona magnanima Diakonoff и летний фруктовый тортрикс Adoxophyes honmai Yasuda являются серьезными полифаговыми вредителями, которые, как известно, повреждают чайные деревья в Восточной Азии7. Два вида откладывают плоские и овальные чешуйчатые скопления яиц (или яичные массы), состоящие из тонких, мягких и хрупких яиц, покрытых материнскими выделениями. Хотя стадии эмбриогенеза имеют решающее значение для развития насекомых и определения пола9, структуры яиц препятствуют дальнейшему анализу понимания биологии насекомых. Важно преодолеть трудности для дальнейшего изучения вредителей, яйцекладущих такую сложную яичную массу.

Здесь, чтобы понять биологию тортрицидов, методы массового выращивания, наблюдения и молекулярные исследования были разработаны с использованием A. honmai и H. magnanima. Во-первых, методы массового выращивания поддерживают обоих рубцов более 100 поколений инбредными. Отделение яиц от сцепленной чешуйчатой яичной массы облегчило наблюдение за эмбриогенезом рубцов с использованием щелочных и органических растворителей, ранее разработанных на основе методов, используемых у мух10. Кроме того, в настоящем исследовании установлена дискриминация по признаку пола мелких эмбрионов путем разработки методов окрашивания полового хроматина самок чешуекрылых с использованием молочно-уксусного орцеина11. Комбинируя эти методы, высокое качество и количество нуклеиновых кислот извлекали из эмбрионов, определяемых полом, что в противном случае было трудно установить6. Извлеченная РНК использовалась для секвенирования следующего поколения. В совокупности методы, представленные здесь, применимы к другим чешуекрылым насекомым и другим таксонам насекомых.

протокол

1. Сбор насекомых и массовое выращивание

  1. Собирайте тортрицидных насекомых с полей в соответствии с ранее опубликованными ссылками 8,12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки H. magnanima и A. honmai собирают из поврежденных чайных листьев (рисунок 1А); взрослых привлекают с помощью портативного ультрафиолетового света мощностью 4 Вт (длина волны 365 нм, см. Таблицу материалов, рисунок 1B).
  2. Выращивайте собранных личинок (рисунок 1C, D) индивидуально на искусственной диете в чашке 1/2 унции в течение 2-3 недель до эклозии взрослого человека (рисунок 1E,F). Подтверждают пол куколок и взрослых особей по морфологическим признакам (рисунок 1G,I).
  3. Соедините самцов и самок в пластиковой коробке (30 см х 20 см х 5 см) для яйцекладки яйцевидных масс на парафиновой бумаге (рисунок 1J-L). Поместите самку и двух самцов в пластиковый стаканчик объемом 120 мл с кусочком парафиновой бумаги, чтобы установить матрилин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сделать складки на парафиновой бумаге. Для H. magnanima парафиновая бумага должна быть на дне корпуса. Между тем, для A. honmai, положите бумагу на потолок корпуса для сбора яиц (рисунок 1L), так как H. magnanima яйцекладет яичную массу на верхней стороне чайных листьев, но A. honmai откладывает яйца на нижней стороне листьев8. Процедуры были также проверены на других видах тотеррикидов, и лучше размещать документы с обеих сторон, если экология и поведение целевых видов не прояснены.
  4. Вырежьте яичные массы (примерно 100-200 яиц на яичную массу12, рисунок 1М) на парафиновой бумаге ножницами. Поместите яйца в стаканчик по 1/2 унции с сброшенной бумагой на 5-7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелый эмбрион демонстрирует угревую капсулу (рисунок 1N). Периоды эмбриогенеза по-разному относятся к тортрицидным видам, но обычно 5 дней после яйцекладки (dpo) для H. magnanima и 4 dpo для A. honmai при 25 °C при 60% относительной влажности, 16 ч света / 8 ч темных циклов7.
  5. Хранить яичные массы с черной головкой капсул при 4-8 °C в течение 7 дней.
  6. Нарежьте ~60 г искусственных диет с помощью терки для массового выращивания. Поместите яичную массу, наполненную созревшими эмбрионами, на нарезанную искусственную диету в пластиковый контейнер (23 см х 16 см х 8 см). Поместите парафиновую бумагу на яичную массу с нарезанными диетами (рисунок 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Относительная влажность ниже 30% считается более сухой, в то время как более 70% слишком влажной. Создание отверстий на крышке пластикового контейнера лучше для обеспечения лучшей вентиляции. Заполните отверстия хлопком, чтобы предотвратить побег мелких личинок.
  7. Для устранения поверхностных загрязнений из яиц замочите яичную массу в 3% формалине и 0,2% растворе бензалкония хлорида в течение 5 мин, соответственно12. Чтобы искоренить кишечные или внутриклеточные бактерии, используйте искусственную диету, дополненную 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлоридом или 0,06% (мас./мас.) рифампицином вместо обычной искусственной диеты (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Важно замешивать Silk Mate 2S и 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлорида или 0,06% (мас./мас.) рифампицина, равнозначно консистенции.
  8. Соберите куколок из пластикового контейнера и различайте пол на основе морфологических12 характеристик (рисунок 1G-I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, тортрициды имеют 5-6 звезд до окукливания12. Личинкам H. magnanima и A. honmai требуется 3 недели и 2 недели соответственно после вылупления до окукливания.
  9. Поместите 15 самцов и 10 самок в пластиковый ящик (30 см х 20 см х 5 см, рисунок 1К) для спаривания с 25 °C, 16 л/8 D. Соберите яйца за 5-7 дней и повторите шаги 1,4-1,9. для каждого поколения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется сбор вновь яйцекладущих яйцекладущих яичных масс для последующего анализа, установите начало и конец темного периода, например, с 9 утра до 5 вечера. В этом состоянии H. magnanima и A. honami обычно яйцекладут яйца через 5 ч (2 часа дня).

2. Отделение яиц и личинок фарата от яичных масс для фиксации, пермеабилизации и окрашивания

  1. Замочите яичную массу в 1000 мкл 1,2% водного раствора гипохлорита натрия в течение 10 мин или в 1000 мкл водного раствора 5 М гидроксида калия в течение 30 мин для отделения яиц.
  2. Вымойте отделенные яйца в 1000 мкл PBSt (137 мМ NaCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 0,05% полиоксиэтилена (20) сорбитана монолаурата [Tween-20] pH 7,4, см. Таблицу материалов) после ранее опубликованного отчета7.
  3. Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 4% раствора параформальдегида-ПБСт (мас./об.). Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин с помощью вихревого смесителя.
  4. Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 100% метанола. Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин.
  5. Дважды промыть яйца 1000 мкл 100% метанола и хранить при 4 °C в 100% метаноле до дальнейших экспериментов (рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут храниться не менее 1 года при температуре 4 °C.
  6. Замачивайте яйца последовательно в 99%, 70%, 50% этаноле и PBSt в течение 5 мин каждый для гидрофилизации после ранее опубликованного отчета7.
  7. Вымойте яйца с PBSt, погрузите яйца в 1 мкг/мл раствора DAPI на 5 мин, а затем дважды вымойте яйца 1x PBS. Замочите яйца в 20 мкл 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусном орцеиновом растворе (см. Таблицу материалов)11 для визуализации гетерохроматина до тех пор, пока ядра не проявят ярко-красный цвет (это варьируется от 5 до 60 мин) (рисунок 2B,C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Периоды окрашивания молочно-уксусного орцеина зависят от температуры и влажности. Лучше проверить правильность окрашивания с помощью микроскопа с увеличением 4х-10х.
  8. Переложите витражи с помощью пипетки на стеклянную горку. Заключите витражные яйца в антизатухающий реагент (см. Таблицу материалов) и покровное стекло7.
  9. Извлеките фарат H. magnanima и личинки A. honmai (через 4-5 дней после яйцекладки (dpo)) из яичных масс с помощью щипцов (рисунок 2D). Разделите личинок пополам на стеклянной горке (рисунок 2Е).
  10. Фиксируют любые ткани (например, субэзофагеальные ганглии, грудные ганглии, мальпигиевы канальцы и др.) смесью 1:3 (v/v) 99,7% уксусной кислоты/100% метанола в течение 5 мин. Окрашивают их 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусным орцеиномраствором 11 до окрашивания ядер (это может занять 5-60 мин, в зависимости от температуры и влажности).
  11. Определите пол каждого образца, наблюдая за наличием (женским) или отсутствием (мужской) гетерохроматина (W-хромосома, рисунок 2F, G) под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пол определяется путем визуализации полового хроматина. Каждая клетка представляет собой половой хроматин в виде точки у самок 11,12, в то время как оставшаяся часть фаратных личиночных тканей (не фиксированная) должна быть немедленно погружена в буфер лизиса клеток12 (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) или фенолсодержащие реагенты экстракции РНК для экстракции ДНК или РНК. Перед рассечением дозируйте 20 мкл реагентов в 0,2 мл ПЦР-пробирок заранее (рисунок 3А). Погружайте и храните образцы при температуре -80 °C до дальнейшей экстракции. Образцы могут храниться не менее 3 месяцев, но лучше приступить к последующим экспериментам, чтобы предотвратить деградацию нуклеиновых кислот.

3. Извлечение ДНК и РНК из половых детерминированных личинок фарата

  1. Объедините 12 определяемых полом мужских или женских личинок фарата (эмбрион 5 дпо) и добавьте либо буфер лизиса клеток, либо реагенты экстракции РНК (см. этап 2.11 и Таблицу материалов) в одну трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.2-3.7 для экстракции ДНК и шаги 3.8-3.11 для экстракции РНК.
  2. Гомогенизировать ткани в 600 мкл буфера лизиса клеток (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) и центрифугировать образцы при 10 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  3. Собирают супернатант (500 мкл) с помощью пипетки и инкубируют при 50 °C с 1,5 мкл протеиназы K (20 мг/мл, см. Таблицу материалов) в течение 5 ч на тепловом блоке.
  4. Обрабатывайте образцы 1,0 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы (см. Таблицу материалов) при 37 °C в течение 30 мин.
  5. Добавляют 200 мкл раствора осаждения белка (см. Таблицу материалов) в пробирки7, а затем центрифугу при 17 000 х г в течение 10 мин при 4°С.
  6. Смешайте супернатант (500 мкл) с 500 мкл 100% изопропанола, а затем центрифугу при 20 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  7. Дважды промыть гранулированную ДНК 1000 мкл 70% этанола. Затем, высушив на воздухе (5-10 мин при комнатной температуре), растворяют ДНК в 30 мкл 10 мМ буфера Tris-Cl (рН 8,5).
  8. Гомогенизировать ткани в 600 мкл реагентов для экстракции РНК и добавить в пробирку 240 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте пробирки при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  9. Смешайте супернатант (600 мкл) с 600 мкл 100% изопропанола и перенесите смесь в спиновую колонну кремнезема (см. Таблицу материалов). Центрифугируйте пробирки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
  10. Промыть колонну 750 мкл 70% этанола и дважды центрифугировать колонну по 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
  11. Загрузите в колонну 15 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте трубки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C для элюляции РНК.
  12. Рассчитайте и проверьте качество и количество ДНК и РНК с помощью спектрофотометра на основе ультрафиолета. Оцените чистоту нуклеиновых кислот, используя соотношения A260/A280 (нуклеиновые кислоты/белок) и A260/A230 (нуклеиновые кислоты/соли и другие загрязняющие вещества)13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции РНК соблюдалась ранее опубликованная процедура12 , в результате чего приводило к фенольному загрязнению (таблица 1). Извлеченная ДНК и РНК из одного эмбриона или личинок фарата дает образцы низкого количества и низкого качества. Как правило, экстракция ДНК из 12 личинок фарата дает 100-600 нг, в то время как экстракция РНК с использованием текущего метода генерирует 900-1 500 нг, как показано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.13-3.15 являются необязательными для дальнейших анализов последовательности высокой пропускной способности.
  13. Рассчитайте количество ДНК и РНК с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки качества для дальнейшего экспериментального применения было рассчитано соотношение количеств РНК (концентрация на основе УФ-излучения (нг/мкл)/концентрация на основе флуоресценции (нг/мкл)). Например, когда концентрации на основе УФ и флуоресценции составляют 80 нг/ул и 60 нг/ул соответственно, соотношение будет составлять 1,5 (80/60). Обычно коэффициенты ниже 1,5 указывают на достаточную чистоту для последующих применений с использованием высокопроизводительного секвенирования13.
  14. Анализ качества РНК с помощью микрочипового электрофореза14.
  15. Используйте квалифицированные РНК для подготовки библиотеки РНК с помощью комплекта для подготовки библиотеки РНК (см. Таблицу материалов). Упорядочивайте библиотеки с помощью платформы, подходящей для подготовленных библиотек.

Результаты

Создание хост-линий и их обслуживание
Жизнеспособность собранных в полевых условиях личинок по-разному объясняется расположением поля, сезонами и условиями выращивания (например, 90% жизнеспособности на Тайване, Таоюань, как показано в Arai et al.12). Примерно 30%-50% пар ...

Обсуждение

Tortricid включает в себя несколько сельскохозяйственных и лесных вредителей; в настоящем исследовании представлены методы выращивания черепахи на протяжении поколений, наблюдения за эмбриогенезом и полом насекомых и проведения молекулярного анализа с использованием зрелых эмбрионов.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Исследовательских стипендий японского общества содействия развитию науки (JSPS) для молодых ученых [номер гранта 19J13123 и 21J00895].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1/2 ounce cupFP CHUPACP070009insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lidFP CHUPACP070011insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acidFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan36289fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologiesnot shownNucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kitAgilent Technologies5067-1511Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG
.pdf
benzalkonium chloride solutionNihon Pharmaceutical Co., LtdNo.4987123116046Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
CottonAOUME8-1611-02insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solutionDojindo, Tokyo, Japan340-07971stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium HydrogenphosphateFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kitInvitrogenQ33231Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II columnEpoch Life Science Inc.EP-11201RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
EthanolFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan4.98748E+12fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)FUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paperHEIKO2100010insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc&utm_source=
Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCKATTO, Tokyo, Japan4002620incubation; https://www.attoeng.site/
heptaneFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan4.98748E+12fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LFNosan Co., Ltdnot shownArtificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENIINippon Gene311-07361RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanolFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acidFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanolFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan4.98748E+12fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortexBiosanBS-010210-TAKVoltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80Implennot shownNucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wideInomata chemical1859insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%
83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%
E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for IlluminaNew England BioLabsE7770SLibrary preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orceinFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
ParaformaldehydeFUJIFILM Wako Chemicals Co.160-16061fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonolaurateFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japannot shownInsect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium ChlorideFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen PhosphateFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogen, MA, USAP36965antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K SolutionMerck71049-4CNDNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solutionQiagen158912DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4InvitrogenQ33238Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicinFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan4.98748E+12Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kitInvitrogenQ32855Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solutionNippon Gene313-01461RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2SNosan Co., Ltdnot shownArtificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium ChlorideFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl SulfateFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solutionFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan4.98748E+12egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline HydrochlorideFUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan4.98748E+12Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HClFUJIFILM Wako Chemicals Co.4.98748E+12Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled waterInvitrogen10977023RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015

Ссылки

  1. Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
  2. Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
  3. Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
  4. Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
  6. Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
  7. Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
  8. vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. . Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , (1991).
  9. Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
  10. Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
  11. Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
  12. Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
  13. Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
  14. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
  15. Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
  16. Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
  17. Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
  18. Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
  19. Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
  20. Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181Tortricidaeseq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены