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要約

本議定書は、実験室におけるトルトリシッド害虫昆虫の飼育方法を記載する。昆虫の性別を区別し、ハイスループットシーケンシングのために核酸を抽出する手順は、2つのトルトリシッド害虫を使用して確立されています。

要約

一般的にトルトリックスまたはリーフローラーの蛾として知られているトルトリシダ科(鱗翅目)は、深刻な農業損失を引き起こす多くの農業および林業害虫を含む。このような害虫の蛾の生物学を理解するために、基本的な技術が強く求められている。ここでは、2つの茶癇翅目、 ホモナ・マグナニマ と アドキソフィエス・ホンマイ (鱗翅目:トルトリシダ科)を用いて、大量飼育、観察、および分子研究のための方法が開発されている。昆虫はスライスした人工食で大量飼育され、その生物学的特性を考慮して100世代以上にわたって近親交配によって維持された。昆虫には様々な性二型性があります。したがって、その後のアッセイを妨げている発達段階における性別を区別することは困難である。今回の研究は、トルトリシッド幼虫の性別は、精巣を観察するか、または乳酸酢酸オルセイン染色を観察することによって決定し、女性特異的W染色体を視覚化することによって決定できることを強調した。さらに、本研究では、性決定法を用いて、性決定胚からの核酸抽出とハイスループットシーケンシングへの応用を可能にした。これらのヒントは、他の害虫の昆虫にも適用可能であり、さらなる形態学的および遺伝的研究を容易にする。

概要

鱗翅目昆虫は、記載されたすべての生物種1の10%以上を占め、特定の分類群種は植物に深刻な被害および深刻な農業損失を引き起こす2,3。カイコBombyx mori4,5などのモデル昆虫を用いて分子的および遺伝的研究が開発されているが、害虫昆虫は、飼育および取り扱いの困難さもあって、未調査のままである6,7。したがって、そのような非モデル害虫昆虫の生物学を理解するためには、基本的な研究および技術が必要である。

一般的にトルトリックスまたはリーフローラーの蛾として知られているトルトリシダ科(鱗翅目)は、多くの農業および林業害虫8を含む。昆虫分類群のうち、オリエンタル・ティー・トルトリックス・ ホモナ・マグナニマ ・ディアコノフとサマーフルーツ・トルトリックス・ アドキソフィエス・ホンマイ・ ヤスダは、東アジアのティーツリーにダメージを与えることが知られている深刻な多食性害虫です7。2つの種は、母親の分泌物で覆われた薄くて柔らかく壊れやすい卵からなる平らで楕円形の鱗片のような卵塊(または卵塊)を産む。胚発生段階は昆虫の発生と性決定9にとって極めて重要であるが、卵の構造は昆虫の生物学を理解するのを妨げるさらなる分析を妨げる。このような複雑な卵塊を産卵させる害虫に関するさらなる研究のための困難を克服することが重要である。

ここでは、トルトリシドの生物学を理解するために、 A. honmai と H. magnanimaを用いて、大量飼育、観察、および分子研究のための方法が開発されている。第一に、大量飼育方法は、近親交配によって100世代にわたって両方のトルトリシッドを維持する。連結された鱗片状の卵塊から卵を分離することは、ハエ10で用いられる技術から以前に開発されたアルカリ性および有機溶媒を用いたトルトリシドの胚発生観察を容易にした。また、本研究は、乳酸酢酸オルセインを用いた鱗翅目雌の性クロマチンの染色法の開発により、小胚の性差別を確立した11。これらの方法を組み合わせることにより、性決定された胚から高品質および量の核酸が抽出されたが、そうでなければ確立することは困難であった6。抽出したRNAを次世代シーケンシングに利用しました。集合的に、ここで提示された方法は、他の鱗翅目昆虫および他の昆虫分類群に適用される。

プロトコル

1. 昆虫の収集と大量飼育

  1. 以前に出版された参考文献8,12に続く畑からトルトリシッド昆虫を集める。
    注:H. magnanima および A. honmai 幼虫は、損傷した茶葉から収集される(図1A)。成虫は、4Wの携帯用UV光(波長365nm、 材料表、 図1B参照)を用いて誘引される。
  2. 採取した幼虫(図1C、D)を1/2オンスカップに入れた人工飼料片上で、成虫の開墾まで2~3週間、個別に飼育する(図1E、F)。形態学的形質により蛹と成虫の性別を確認する(図1G,I)。
  3. プラスチック製の箱(30 cm x 20 cm x 5 cm)の中の男性と女性をパラフィン紙の卵塊に嵌合させます(図1J-L)。女性1人と男性2人をパラフィン紙と一緒に120mLのプラスチックカップに入れて、マトリリンを確立します。
    注:パラフィン紙にしわを作ることが重要です。H. magnanimaの場合、パラフィン紙はケースの底に貼っておく必要があります。一方、A.ホンマイについては、茶葉の上側にH.マグナニマ産卵卵塊が入るので、ケース天井に紙を貼って卵を集める(図1L)が、A.ホンマイは葉8の下側に卵を産む。手順は他のトルトリシッド種でも検証されており、対象種の生態や行動が明らかにならない場合は、両面に論文を貼った方が良いでしょう。
  4. はさみでパラフィン紙上の卵塊(卵塊12、 図1Mあたり約100〜200個の卵)を切り取ります。卵をダンプされた紙と一緒に1/2オンスのカップに5〜7日間入れます。
    注:成熟した胚は黒ずみのカプセルを呈する(図1N)。胚発生の期間は、トルトリシド種に多様に起因しているが、一般に、 H. magnanima では産卵後5日間、 A. honmai では4 dpoが相対湿度60%、16時間明暗/8時間のサイクルで25°Cで7.
  5. 黒い頭部カプセルを示す卵塊を4〜8°Cで7日間保存する。
  6. 大量飼育用のおろし金を使用して〜60gの人工食をスライスする。成熟した胚で満たされた卵塊をプラスチック容器(23 cm x 16 cm x 8 cm)のスライスした人工飼料の上に置きます。スライスした食事と一緒に卵塊にパラフィン紙を置きます(図10)。
    注: 相対湿度が 30% 未満は乾燥しすぎていると見なされ、70% を超えると湿度が高すぎます。プラスチック容器の蓋に穴を開けることは、より良い換気を可能にするためにより良いです。小さな幼虫の脱出を防ぐために、穴を綿で満たしてください。
  7. 卵から表面汚染物質を除去するために、卵塊を3%ホルマリンおよび0.2%塩化ベンザルコニウム溶液にそれぞれ5分間浸す12。腸内細菌や細胞内細菌を根絶するには、通常の人工食の代わりに、塩酸テトラサイクリン0.05%(w/w)またはリファンピシン0.06%(w/w)を添加した人工食を利用してください( 資料表参照)。
    メモ: この手順はオプションです。一貫性を保つために、シルクメイト2Sと0.05%(w / w)テトラサイクリン塩酸塩または0.06%(w / w)リファンピシンを均等に混練することが重要です。
  8. プラスチック容器から蛹を収集し、形態学的12 の特徴に基づいて性別を区別する(図1G-I)。
    注:一般的に、トルトリシドは蛹化12まで5〜6個のインスターを呈する。 H. magnanima と A. honmai 幼虫は、孵化後蛹化するまでそれぞれ3週間と2週間かかります。
  9. 15人の男性と10人の女性をプラスチック製の箱(30 cm x 20 cm x 5 cm、 図1K)に入れ、25°C、16 L/8 Dで交配します。各世代のために。
    注:その後の分析のために新たに産卵した卵塊を収集する必要がある場合は、暗期の開始と終了(例えば、午前9時から午後5時まで)を設定します。この状態では、 H. magnanima と A. honami は通常5時間後(午後2時)に産卵卵します。

2.固定、透過処理、染色のための卵塊からの卵およびフェレート幼虫の分離

  1. 卵塊を1,000 μLの1.2%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分間または1,000 μLの5 M水酸化カリウム水溶液に30分間浸して卵を分離します。
  2. 分離した卵を1,000 μLのPBSt(137 mM NaCl、8.1 mM Na2 HPO4、2.68 mM KCl、1.47 mMKH2 PO4、0.05%のポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート[Tween-20] pH 7.4、材料表を参照)で洗浄し、以前に公表された報告7に従ってください。
  3. 卵を500 μLの100%ヘプタンと500 μLの4%パラホルムアルデヒド-PBSt溶液(w / v)の混合物に浸します。ボルテックスミキサーを用いて1,500rpmで10分間混合する。
  4. 卵を500 μLの100%ヘプタンと500 μLの100%メタノールの混合物に浸します。1,500rpmで10分間混合する。
  5. 卵を1,000 μLの100%メタノールで2回洗浄し、さらなる実験まで100%メタノール中で4°Cで保存する(図2A)。
    注:卵は4°Cで少なくとも1年間保存することができます。
  6. 卵を99%、70%、50%エタノール、およびPBStにそれぞれ5分間順次浸し、以前に発表された報告7に続いて親水化を行う。
  7. 卵をPBStで洗浄し、卵を1μg/mLのDAPI溶液に5分間浸漬した後、1x PBSで卵を2回洗浄する。卵を20 μLの1.25%(w/w)乳酸 - 酢酸オルセイン溶液( 材料表を参照)11 に浸して、核が鮮やかな赤色を示すまでヘテロクロマチンを視覚化する(これは5〜60分で変化する)(図2B、C)。
    注:乳酸 - 酢酸オルセイン染色期間は、温度および湿度に依存する。4x-10倍の倍率の顕微鏡を使用して適切な染色を確認することをお勧めします。
  8. 染色した卵をピペットを用いてスライドガラスに移す。染色した卵を退色防止試薬( 材料表参照)で囲み、カバーガラス7とする。
  9. 鉗子を用いて卵塊からファレート H. magnanima および A. honmai 幼虫(産卵後4〜5日(dpo))を抽出する(図2D)。スライドガラス上の幼虫を二等分する(図2E)。
  10. 任意の組織(例えば、食道下神経節、胸部神経節、マルピギ尿細管など)を1:3(v/v)99.7%酢酸/100%メタノールの混合物で5分間固定する。核が染色されるまで、1.25%(w / w)乳酸 - 酢酸オルセイン溶液11 でそれらを染色する(これは、温度および湿度に応じて5〜60分かかることがある)。
  11. ヘテロクロマチン(W染色体、 図2F、G)の有無(雌)または非存在(雄)を顕微鏡で観察することにより各検体の性を求めた。
    注:性別は、性クロマチンを視覚化することによって決定される。各細胞は、雌11、12において性クロマチンをドットとして表し、一方、相長幼虫組織の残りの部分(固定されていない)は、直ちに細胞溶解緩衝液12(10mM Tris-HCl、100mM EDTA、および1% SDS、pH 8.0)またはDNAまたはRNA抽出のためのフェノール含有RNA抽出試薬に浸漬すべきである。解剖の前に、20 μLの試薬を事前に0.2 mL PCRチューブに分注してください(図3A)。サンプルを浸漬し、さらに抽出するまで-80°Cで保存する。サンプルは少なくとも3ヶ月間保存することができますが、核酸の分解を防ぐために下流の実験を進める方が良いです。

3. 性決定されたファレート幼虫からのDNAおよびRNA抽出

  1. 性決定された雄または雌のファレート幼虫(5dpo胚)を12個プールし、細胞溶解緩衝液またはRNA抽出試薬(ステップ2.11および 材料表を参照)のいずれかを1本の1.5mLチューブに加える。
    注: DNA 抽出の場合は手順 3.2 ~ 3.7、RNA 抽出の場合は手順 3.8 ~ 3.11 に従います。
  2. 600 μL の細胞溶解バッファー (10 mM Tris-HCl、100 mM EDTA、および 1% SDS、pH 8.0) で組織を均質化し、サンプルを 10,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
  3. ピペットを使用して上清(500 μL)を回収し、1.5 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL、 材料表を参照)とともに50°Cでヒートブロック上で5時間インキュベートします。
  4. サンプルを 1.0 μL の 10 mg/mL の RNase 溶液 ( 材料表を参照) で 37 °C で 30 分間処理します。
  5. 200 μLのタンパク質沈殿溶液( 材料表を参照)をチューブ7に加え、続いて17,000 x g で遠心分離機で4°Cで10分間行った。
  6. 上清(500 μL)を500 μLの100%イソプロパノールと混合し、20,400 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  7. ペレット化したDNAを1,000 μLの70%エタノールで2回洗浄する。次いで、風乾(室温で5〜10分間)し、DNAを30 μLの10 mM Tris-Cl緩衝液(pH 8.5)に溶解する。
  8. 600 μLのRNA抽出試薬で組織を均質化し、240 μLの超純粋な蒸留水をチューブに加えます。チューブを 12,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。
  9. 上清(600 μL)を600 μLの100%イソプロパノールと混合し、混合物をシリカスピンカラムに移す( 材料表を参照)。チューブを 17,900 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。
  10. カラムを750 μLの70%エタノールで洗浄し、カラムを17,900 x g で2回、4°Cでそれぞれ1分間遠心分離した。
  11. 15 μL の超高純度蒸留水をカラムにロードします。チューブを 17,900 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離し、RNA を溶出します。
  12. UVベースの分光光度計を使用してDNAとRNAの品質と量を計算し、検証します。A260/A280(核酸/タンパク質)およびA260/A230(核酸/塩およびその他の汚染物質)比13を使用して核酸の純度を評価します。
    注:RNA抽出については、以前に公表された手順12 に従い、フェノール汚染をもたらした(表1)。単一の胚またはフェレート幼虫から抽出されたDNAおよびRNAは、低量および低品質のサンプルを生成する。典型的には、12個のファレート幼虫からのDNA抽出は100〜600ngを生じるが、現在の方法を用いたRNA抽出は、 表1に示すように900〜1,500ngを生成する。
    注: ステップ 3.13 ~ 3.15 は、ハイスループットシーケンシングのさらなるアッセイではオプションです。
  13. 蛍光ベースの分光光度計を使用してDNAおよびRNAの量を計算する。
    注:RNA量の比(UVベースの濃度(ng/μL)/蛍光ベースの濃度(ng/μL))を計算し、さらなる実験適用のための品質を評価した。たとえば、UV および蛍光ベースの濃度がそれぞれ 80 ng/uL および 60 ng/uL の場合、その比は 1.5 (80/60) になります。通常、1.5未満の比は、ハイスループットシーケンシング13を使用する下流アプリケーションに対して十分な純度を示します。
  14. マイクロチップ電気泳動を用いてRNAの品質を分析する14.
  15. 修飾されたRNAを利用して、RNAライブラリー調製キットを使用してRNAライブラリーを調製する( 材料表を参照)。準備されたライブラリに適したプラットフォームを用いてライブラリを配列決定する。

結果

ホスト回線の整備と維持管理
野外で採集された幼虫の生存率は、圃場の場所、季節、および飼育条件(例えば、台湾、桃園における生存率の90%、新井ら12に示されているように)に異なる原因がある。ペアの約30%〜50%が、通常どおり次世代を生み出します。 H. magnanima と A. honmaiにとって、母系は100世代以上にわたって近親交配によって維持されてき...

ディスカッション

トルトリシドは、いくつかの農業および林業害虫を含む。本研究では、何世代にもわたってトルトリックスを飼育し、昆虫の胚発生と性別を観察し、成熟した胚を用いて分子解析を行う方法を提示した。

害虫昆虫研究の障害の一つは、飼育方法を確立することである。特に、近親交配は時々種の適応度に悪影響を及ぼすことがあります。近親交配による適応度低下は、?...

開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、日本学術振興会特別研究員[助成金番号19J13123および21J00895]からの支援に感謝します。

資料

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