Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae

Resumo

O presente protocolo descreve o método de criação de insetos de peste tortricida nos laboratórios. Os procedimentos para distinguir o sexo dos insetos e extrair ácidos nucleicos para sequenciamento de alto rendimento são estabelecidos usando duas pragas tortricidas.

Resumo

O tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais, que causam sérias perdas agrícolas. Para entender a biologia dessas mariposas de pragas, técnicas fundamentais têm sido de alta demanda. Aqui, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares são desenvolvidos usando duas tortrix de chá, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Os insetos foram criados em massa com dieta artificial fatiada e mantidos pela endogamia por mais de 100 gerações, considerando suas características biológicas. Insetos têm vários dimorfismos sexuais; portanto, é difícil distinguir o sexo durante os estágios de desenvolvimento, que impediram ensaios subsequentes. O presente trabalho destacou que o sexo das larvas de tortricóides poderia ser determinado observando testículos ou coloração de orceina láctica-actic para visualizar o cromossomo W específico feminino. Além disso, utilizando os métodos de determinação sexual, o presente estudo possibilitou extrações de ácido nucleico a partir de embriões determinados por sexo e aplicação para sequenciamento de alto rendimento. Essas dicas são aplicáveis para outros insetos pragas e facilitarão estudos morfológicos e genéticos.

Introdução

Os insetos lepidopteranos representam mais de 10% de todas as espécies vivas descritas¹, e certas espécies de taxas causam danos graves às plantas e graves perdas agrícolas ^2,3. Embora estudos moleculares e genéticos tenham sido desenvolvidos usando insetos modelo, como o bicho-da-seda Bombyx mori ^4,5, os insetos pragas permanecem sem investigação, em parte devido às dificuldades para criar e manusear ^6,7. Portanto, estudos e técnicas fundamentais são necessários para entender a biologia desses insetos pestes não-modelo.

O Tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais⁸. Da taxa de insetos, a tortrix oriental Homona magnanima Diakonoff e a tortrix de frutas de verão Adoxophyes honmai Yasuda são pragas polifagosas graves conhecidas por danificar árvores de chá no leste da Ásia⁷. As duas espécies estavam agrupamentos de ovos planos e ovais (ou massas de ovos) consistindo de ovos finos, macios e frágeis cobertos por secreções maternas. Embora os estágios de embriogênese sejam cruciais para o desenvolvimento de insetos e determinações sexuais⁹, as estruturas dos ovos impedem que uma análise mais aprofundada entenda a biologia dos insetos. É importante superar as dificuldades para um estudo mais aprofundado sobre pragas que oviposim essa complexa massa de ovos.

Aqui, para entender a biologia dos tortricídeos, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares foram desenvolvidos usando A. honmai e H. magnanima. Primeiro, os métodos de criação em massa mantêm os dois tortricídeos acima de 100 gerações por inserção. A separação dos ovos da massa de ovos em escala concatenada facilitou a observação embrigênese dos tortricídeos usando solventes alcalinos e orgânicos previamente desenvolvidos a partir de técnicas usadas em moscas¹⁰. Além disso, o presente estudo estabeleceu a discriminação sexual de pequenos embriões, desenvolvendo métodos de coloração da cromatina sexual de fêmeas lepidopteranas utilizando orceina láctica-acética¹¹. Combinando esses métodos, ácidos nucleicos de alta qualidade e quantidade foram extraídos de embriões determinados por sexo, o que de outra forma era difícil de estabelecer⁶. O RNA extraído foi utilizado para sequenciamento de próxima geração. Coletivamente, os métodos aqui apresentados aplicam-se a outros insetos lepidopteranos e outros insetos taxa.

Protocolo

1. Coleta de insetos e criação em massa

1. Coletar insetos tortricídeos de campos após referências^publicadas anteriormente ^8,12.
   NOTA: As larvas H. magnanima e A. honmai são coletadas de folhas de chá danificadas (Figura 1A); adultos são atraídos usando luz UV portátil de 4 W (comprimento de onda de 365 nm, ver Tabela de Materiais, Figura 1B).
2. Colete as larvas coletadas (Figura 1C,D) individualmente em um pedaço de dieta artificial em um copo de 1/2 oz por 2-3 semanas até a eclosão adulta (Figura 1E,F). Confirme o sexo de pupas e adultos por traços morfológicos (Figura 1G,I).
3. Mate os machos e fêmeas em uma caixa de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm) para ovipositar massas de ovos em um papel de parafina (Figura 1J-L). Coloque uma fêmea e dois machos em um copo de plástico de 120 mL com um pedaço de papel de parafina para estabelecer uma matrilina.
   NOTA: É importante fazer vincos no papel parafina. Para H. magnanima, o papel de parafina precisa estar no fundo do caso. Enquanto isso, para A. honmai, coloque um papel no teto da caixa para coletar ovos (Figura 1L) desde h. magnanima oviposit massa de ovos no lado superior das folhas de chá, mas A. honmai coloca ovos na parte inferior das folhas⁸. Os procedimentos também foram verificados em outras espécies de tortricida, e é melhor colocar documentos de ambos os lados se a ecologia e o comportamento das espécies-alvo não forem inclarizados.
4. Corte as massas de ovos (aproximadamente 100-200 ovos por massa de ovo¹², Figura 1M) no papel de parafina com uma tesoura. Coloque os ovos em uma xícara de 1/2 oz com papel despejado por 5-7 dias.
   NOTA: O embrião amadurecido exibe uma cápsula de cabeça negra (Figura 1N). Os períodos de embriogênese são diversas mente atribuídos a espécies tortricidas, mas geralmente 5 dias após a oviposição (dpo) para H. magnanima e 4 dpo para A. honmai a 25 °C com 60% de umidade relativa, 16 h luz/8 h ciclos escuros⁷.
5. Armazene as massas de ovos mostrando cápsulas de cabeça preta a 4-8 °C durante 7 dias.
6. Corte ~60 g dietas artificiais usando um ralador para criação em massa. Coloque a massa de ovos cheia de embriões maduros na dieta artificial fatiada em um recipiente plástico (23 cm x 16 cm x 8 cm). Coloque os papéis de parafina na massa de ovos com as dietas fatiadas (Figura 10).
   NOTA: Abaixo de 30% a umidade relativa é considerada mais seca, enquanto mais de 70% é muito úmida. Criar furos na tampa do recipiente de plástico é melhor para permitir uma melhor ventilação. Encha os buracos com algodão para evitar as fugas de pequenas larvas.
7. Para eliminar contaminantes superficiais dos ovos, mergulhe a massa de ovos em 3% de formalina e 0,2% de solução de cloreto de benzalkonium por 5 min, respectivamente¹². Para erradicar bactérias intestinais ou intracelulares, utilize uma dieta artificial suplementada com 0,05% (w/w) cloridrato de tetraciclina ou 0,06% (w/w) rifampicina em vez de uma dieta artificial normal (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Esta etapa é opcional. É importante amassar o Mate de Seda 2S e 0,05% (w/w) Cloridrato de Tetraciclina ou 0,06% (w/w) rifampicina equificadamente para consistência.
8. Recolhe a pupa do recipiente plástico e distingue o sexo com base nas características morfológicas¹² (Figura 1G-I).
   NOTA: Geralmente, os tortricídeos apresentam 5-6 instars até a pupação¹². As larvas H. magnanima e A. honmai levam 3 semanas e 2 semanas, respectivamente, depois de eclodir até a pupação.
9. Coloque 15 machos e 10 fêmeas em uma caixa de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) para acasalamento com 25 °C, 16 L/8 D. Coletar ovos por 5-7 dias e repetir as etapas 1.4-1.9. para cada geração.
   NOTA: Se for necessário coletar massas de ovos recém-ovipositados para análise subsequente, defina o início e o fim do período escuro, por exemplo, das 9:00 às 17:00. Nesta condição, H. magnanima e A. honami geralmente oviposit ovos após 5 h (2 PM).

2. Separação de ovos e larvas de pharate de massas de ovos para fixação, permeabilização e coloração

1. Mergulhe a massa de ovos em 1.000 μL de 1,2% de solução aquosa hipoclorito de sódio por 10 min ou em 1.000 μL de solução aquosa de hidróxido de potássio de 5 M por 30 minutos para separar os ovos.
2. Lave os ovos separados em 1.000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 0,05% de Polioximetileno (20) Monolaurate Sorbitano [Tween-20] pH 7.4, ver Tabela de Materiais) após o relatório publicado anteriormente⁷.
3. Mergulhe ovos em uma mistura de 500 μL de heptano 100% e 500 μL de solução paraformaldeída-PBSt de 4% (c/v). Misture por 10 min a 1.500 rpm usando um misturador de vórtice.
4. Mergulhe os ovos em uma mistura de 500 μL de 100% de heptano e 500 μL de 100% de metanol. Misture por 10 min a 1.500 rpm.
5. Lave os ovos duas vezes com 1.000 μL de 100% de metanol e armazene a 4 °C em 100% de metanol até novos experimentos (Figura 2A).
   NOTA: Os ovos podem ser armazenados por pelo menos 1 ano a 4 °C.
6. Mergulhe os ovos sequencialmente em 99%, 70%, 50% etanol e PBSt por 5 min cada para hidrofilização seguindo o relatório publicado anteriormente⁷.
7. Lave os ovos com PBSt, mergulhe os ovos em 1 μg/mL de solução DAPI por 5 minutos e depois lave os ovos com 1x PBS duas vezes. Mergulhe os ovos em 20 μL de 1,25% (w/w) solução de orceina láctica-acética (ver Tabela de Materiais)¹¹ para visualizar heterocromatina até que os núcleos exerçam uma cor vermelha brilhante (isso varia de 5 a 60 min) (Figura 2B,C).
   NOTA: Os períodos de coloração de orceínia láctica-acética dependem da temperatura e umidade. É melhor verificar se há uma coloração adequada usando um microscópio com ampliação de 4x-10x.
8. Transfira os ovos manchados usando uma pipeta para um slide de vidro. Inclua os ovos manchados com reagente antifade (ver Tabela de Materiais) e um copo de cobertura⁷.
9. Extraia as larvas de pharate H. magnanima e A. honmai (4-5 dias pós oviposition (dpo)) das massas de ovos usando fórceps (Figura 2D). Larvas de bissecto em uma lâmina de vidro (Figura 2E).
10. Fixar todos os tecidos (por exemplo, gânglio suboesofágico, gânglio torácico, túbulo malpighiano, etc.) com uma mistura de 1:3 (v/v) 99,7% de ácido acético/100% metanol por 5 min. Colora aqueles com 1,25% (w/w) solução de orceina láctica-actic¹¹ até que os núcleos estejam manchados (isso pode levar de 5 a 60 minutos, dependendo da temperatura e umidade).
11. Determine o sexo de cada espécime observando a presença (feminina) ou ausência (masculina) de heterocromatina (o cromossomo W, Figura 2F,G) sob um microscópio.
    NOTA: O sexo é determinado visualizando a cromatina sexual. Cada célula representa a cromatina sexual como ponto em fêmeas^11,12, enquanto a porção restante de tecidos larvais de pharate (não fixo) deve ser imediatamente imersa no tampão de lise celular¹² (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8.0) ou reagentes de extração de RNA contendo fenol para extração de DNA ou RNA. Antes das dissecções, dispense 20 μL dos reagentes em tubos PCR de 0,2 mL com antecedência (Figura 3A). Mergulhe e armazene amostras a -80 °C até uma extração adicional. As amostras podem ser armazenadas por pelo menos 3 meses, mas é melhor prosseguir com os experimentos a jusante para evitar a degradação dos ácidos nucleicos.

3. Extrações de DNA e RNA de larvas de pharate determinadas por sexo

1. Piscina 12 larvas de pharate masculino ou feminino determinadas por sexo (5 embriões dpo) e adicionar tampão de lise celular ou reagentes de extração de RNA (ver passo 2.11 e Tabela de Materiais) em um tubo de 1,5 mL.
   NOTA: Siga as etapas 3.2-3.7 para extração de DNA e etapas 3.8-3.11 para extração de RNA.
2. Homogeneize tecidos em 600 μL do tampão de lise celular (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8.0), e centrifugar as amostras a 10.000 x g por 5 min a 4 °C.
3. Colete o supernante (500 μL) usando uma pipeta e incubar a 50 °C com 1,5 μL de Proteinase K (20 mg/mL, ver Tabela de Materiais) por 5h em um bloco de calor.
4. Trate as amostras com 1,0 μL de 10 mg/mL de solução RNase (ver Tabela de Materiais) a 37 °C por 30 min.
5. Adicione 200 μL de solução de precipitação proteica (ver Tabela de Materiais) aos tubos⁷, seguido de uma centrífuga a 17.000 x g por 10 min a 4 °C.
6. Misture o supernatante (500 μL) com 500 μL de isopropanol de 100% e, em seguida, centrífuga a 20.400 x g por 10 min a 4 °C.
7. Lave o DNA de pelotas duas vezes com 1.000 μL de 70% de etanol. Em seguida, ar-seco (5-10 min à temperatura ambiente), dissolva o DNA em 30 μL de 10 mM tris-cl tampão (pH 8.5).
8. Homogeneize os tecidos em 600 μL de reagentes de extração de RNA e adicione 240 μL de água destilada ultra-pura ao tubo. Centrifugar os tubos a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
9. Misture o supernasciente (600 μL) com 600 μL de isopropanol de 100% e transfira a mistura para uma coluna de giro de sílica (ver Tabela de Materiais). Centrifugar os tubos a 17.900 x g por 1 min a 4 °C.
10. Lave a coluna com 750 μL de 70% de etanol, e centrifugar a coluna duas vezes a 17.900 x g por 1 min cada a 4 °C.
11. Carregue 15 μL de água destilada ultra-pura para a coluna. Centrifugar os tubos a 17.900 x g por 1 min a 4 °C para elute o RNA.
12. Calcule e verifique a qualidade e quantidade de DNA e RNA usando um espectrômetro baseado em UV. Avalie a pureza dos ácidos nucleicos utilizando as razões A260/A280 (ácidos/proteínas nucleicas) e A260/A230 (ácidos/sais nucleicos e outros contaminantes)¹³.
    NOTA: Para a extração do RNA, seguiu-se o procedimento publicado anteriormente¹² , que resultou em contaminação do fenol (Tabela 1). O DNA extraído e RNA de um único embrião ou larvas de pharate produz amostras de baixa quantidade e baixa qualidade. Normalmente, a extração de DNA de 12 larvas de pharate produz 100-600 ng, enquanto a extração de RNA usando o método atual gera 900-1.500 ng, como mostra a Tabela 1.
    NOTA: As etapas 3.13-3.15 são opcionais para outros ensaios de sequenciamentos de alto rendimento.
13. Calcule as quantidades de DNA e RNA usando um espectrofotômetro baseado em fluorescência.
    NOTA: A razão das quantidades de RNA (concentração baseada em UV (ng/μL)/concentração baseada em fluorescência (ng/μL)) foi calculada para avaliar a qualidade para aplicação experimental posterior. Por exemplo, quando as concentrações baseadas em UV e fluorescência são de 80 ng/uL e 60 ng/uL, respectivamente, a razão será de 1,5 (80/60). Normalmente, as razões abaixo de 1,5 indicam pureza suficiente para aplicações a jusante usando sequenciamento de alto rendimento¹³.
14. Analise a qualidade do RNA usando a eletroforese de microchip¹⁴.
15. Utilize as RNAs qualificadas para preparar a biblioteca RNA usando um kit de preparação da biblioteca RNA (ver Tabela de Materiais). Sequencie as bibliotecas usando uma plataforma adequada para as bibliotecas preparadas.

Resultados

Estabelecimento de linhas de hospedagem e sua manutenção
A viabilidade das larvas coletadas em campo é diferentemente atribuída à localização do campo, estações e condições de criação (por exemplo, 90% da viabilidade em Taiwan, Taoyuan, como mostrado em Arai et ^al.12). Aproximadamente 30%-50% dos pares gerarão a próxima geração como de costume. Para H. magnanima e A. honmai, as matrilinas foram mantidas por endogamia por mais de 100 gerações...

Discussão

O tortrida compreende várias pragas agrícolas e florestais; o presente estudo apresentou métodos para retrocoterar ao longo de gerações, observar a embriogênese e o sexo dos insetos e realizar análises moleculares utilizando embriões maduros.

Um dos obstáculos para o estudo de insetos de pragas é estabelecer métodos de criação. Especialmente, a endogamia às vezes afeta negativamente a aptidão da espécie. A redução do condicionamento físico pelo inerido, chamada de depressão...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 ounce cup	FP CHUPA	CP070009	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit	Agilent Technologies	5067-1511	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf
benzalkonium chloride solution	Nihon Pharmaceutical Co., Ltd	No.4987123116046	Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton	AOUME	8-1611-02	insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution	Dojindo, Tokyo, Japan	340-07971	stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit	Invitrogen	Q33231	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column	Epoch Life Science Inc.	EP-11201	RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper	HEIKO	2100010	insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7770S	Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	160-16061	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)	Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan	not shown	Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution	Merck	71049-4CN	DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution	Qiagen	158912	DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4	Invitrogen	Q33238	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit	Invitrogen	Q32855	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution	Nippon Gene	313-01461	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015