מתווך פוספוליפידים המושרה טרנספורמציה בתרבויות תלת מימדיות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הקמתן של תרביות תלת-ממדיות 'על גבי' של קו תאי אפיתל שד ללא טרנספורמציה, MCF10A, ששונה כדי לחקור טרנספורמציה המושרה על-ידי גורם מפעיל טסיות (PAF). אימונו-פלואורסצנציה שימשה להערכת השינוי ונדונה בפירוט.

Abstract

מספר מודלים פותחו כדי לחקור סרטן, כגון מודלים של מכרסמים וקווי תאים מבוססים. תובנות חשובות על קרצינוגנזה סופקו על ידי מחקרים המשתמשים במודלים אלה. קווי תאים סיפקו הבנה של דה-רגולציה של איתותים מולקולריים הקשורים לגידולי שד, בעוד שמודלים של מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב לחקר מאפיינים תאיים ומולקולריים של סרטן השד in vivo. הקמת תרביות תלת-ממד של אפיתל השד ותאים סרטניים מסייעת לגשר על הפער בין מודלים in vivo ו- in vitro על ידי חיקוי תנאי in vivo במבחנה. ניתן להשתמש במודל זה כדי להבין את הדה-רגולציה של אירועי איתות מולקולריים מורכבים ואת המאפיינים התאיים במהלך סרטן השד. כאן, מערכת תרבית תלת-ממדית משתנה כדי לחקור טרנספורמציה המושרה על-ידי מתווך פוספוליפידים (גורם מפעיל טסיות, PAF). אימונומודולטורים ומולקולות מופרשות אחרות ממלאים תפקיד מרכזי בייזום הגידול ובהתקדמותו בשד. במחקר הנוכחי, תרביות אצינאר תלת-ממדיות של תאי אפיתל בשד נחשפות למאפייני טרנספורמציה של PAF כגון אובדן קוטביות ושינויים בתכונות התאים. מערכת תרבית תלת-ממדית זו תסייע לשפוך אור על הפרעות גנטיות ו/או אפיגנטיות המושרות על-ידי ישויות שונות של מולקולות קטנות במיקרו-סביבה של הגידול. בנוסף, מערכת זו תספק גם פלטפורמה לזיהוי גנים חדשים וידועים שעשויים להיות מעורבים בתהליך הטרנספורמציה.

Introduction

מספר עצום של מודלים זמינים כדי לחקור את התקדמות הסרטן, כל אחד מהם להיות ייחודי ומייצג תת סוג של מחלה מורכבת זו. כל מודל מספק תובנות ייחודיות ובעלות ערך על הביולוגיה של הסרטן ושיפר את האמצעים לחקות את מצב המחלה בפועל. קווי תאים מבוססים שגודלו כחד-שכבתיים סיפקו תובנות חשובות על תהליכים חיוניים במבחנה, כגון התפשטות, פולשות, נדידה ואפופטוזיס¹. אף על פי שתרבית תאים דו-ממדית (2D) היא הכלי המסורתי לחקור את התגובה של תאי יונקים למספר הפרעות סביבתיות, אקסטרפולציה של ממצאים אלה כדי לחזות תגובות ברמת הרקמה אינה נראית משכנעת מספיק. המגבלה העיקרית של התרביות הדו-ממדיות היא שהמיקרו-סביבה שנוצרת שונה במידה רבה מזו של רקמת השד עצמה². תרבית דו-ממדית חסרה את האינטראקציה של התאים עם המטריצה החוץ-תאית, החיונית לצמיחה של כל רקמה. כמו כן, כוחות מתיחה שחווה התא בתרביות חד-שכבתיות מעכבים את הקוטביות של תאים אלה, ובכך משנים את האיתות וההתנהגות של התא ^3,4,5. מערכות תרבית תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) פתחו אפיק חדש בתחום חקר הסרטן עם יכולתן לחקות את תנאי ה-in vivo במבחנה. רמזים מיקרו-סביבתיים חיוניים רבים שאבדו בתרבית תאים דו-ממדית יכולים להתבסס מחדש באמצעות תרביות תלת-ממדיות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בלמינין (lrECM)⁶.

מחקרים שונים זיהו את החשיבות של מיקרו-סביבה של הגידול בסרטן ^7,8. גורמים הקשורים לדלקת הם חלק מרכזי מהמיקרו-סביבה. גורם מפעיל טסיות (PAF) הוא מתווך פוספוליפידים המופרש על ידי תאי חיסון שונים המתווך תגובות חיסוניות מרובות ^9,10. רמות גבוהות של PAF מופרשות על ידי קווי תאים שונים של סרטן השד וקשורות לשגשוג מוגבר¹¹. מחקרים מהמעבדה שלנו הראו כי נוכחות ממושכת של PAF בתרביות אצנר מובילה לשינוי של תאי אפיתל השד¹². PAF מפעיל את קולטן ה-PAF (PAFR), ומפעיל את ציר האיתות PI3K/Akt¹³. דווח כי PAFR קשור גם ל-EMT, פלישה וגרורות¹⁴.

הפרוטוקול הנוכחי מדגים מערכת מודל לחקר טרנספורמציה המושרה על ידי PAF, תוך שימוש בתרביות תלת-ממדיות של תאי אפיתל השד, כפי שתואר בעבר על ידי Chakravarty et ^al.12. תאי אפיתל השד הגדלים על המטריצה החוץ-תאית (תרביות תלת-ממדיות) נוטים ליצור ספרואידים מקוטבים שנעצרו על-ידי צמיחה. אלה נקראים acini ודומים מאוד acini של רקמת השד, היחידה הפונקציונלית הקטנה ביותר של בלוטת החלב, in vivo¹⁵. הספרואידים האלה (איור 1A,B) מורכבים ממונו-שכבה של תאי אפיתל מקוטבים צפופים שמקיפים לומן חלול ומחוברים לקרום המרתף (איור 1C). תהליך זה של מורפוגנזה תואר היטב בספרות¹⁶. כאשר הם נזרעים על lrECM, התאים עוברים חלוקה והתמיינות כדי ליצור אשכול תאים, אשר לאחר מכן מקטבים מיום 4 ואילך. עד יום 8, האצ'יני מורכב מקבוצה של תאים מקוטבים הנמצאים במגע ישיר עם המטריצה החוץ-תאית וצביר של תאים לא מקוטבים הסגורים בתוך התאים המקוטבים החיצוניים, ללא מגע עם המטריצה. ידוע כי תאים לא מקוטבים אלה עוברים אפופטוזיס עד יום 12 של התרבית, ויוצרים לומן חלול. עד יום 16, מבנים שנעצרו על ידי צמיחה נוצרים¹⁶.

איור 1: גרעינים של תאים באצ'יני המוכתמים בכתם גרעיני . (A) בנייה תלת-ממדית של האצ'יני. (B) תמונת ניגודיות פאזה של MCF10A acini שגדלה על Matrigel במשך 20 יום. (C) החלק המרכזי ביותר מראה נוכחות של לומן חלול. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שלא כמו תרביות דו-ממדיות, תרביות אצ'ינאר מסייעות להבחין בין תאים נורמליים לתאים שעברו טרנספורמציה באמצעות שינויים מורפולוגיים לכאורה. תאי אפיתל שד שאינם מותמרים יוצרים acini עם לומן חלול, המחקה את אציני השד האנושי הרגיל. ספרואידים אלה, עם הטרנספורמציה, מראים מורפולוגיה משובשת המאופיינת באובדן גדול של קוטביות (אחד מסימני ההיכר של סרטן), היעדר לומן, או שיבוש של לומן חלול (עקב התחמקות מאפופטוזיס) שעלול להיגרם עקב הסרת רגולציה של גנים שונים^17,18,19,20 . ניתן לחקור טרנספורמציות אלה באמצעות טכניקות נפוצות כגון אימונופלואורסצנציה. לפיכך, מודל תרבית התאים התלת-ממדית יכול לתפקד כשיטה פשוטה לחקור את התהליך של מורפוגנזה של אצנר השד וסרטן השד. הקמת מערכת תרבית תלת-ממדית להבנת ההשפעה של מתווך פוספוליפידים, PAF, תסייע בבדיקת תרופות פרה-קלינית בתפוקה גבוהה.

עבודה זו התאימה את פרוטוקול התרבות התלת-ממדית 'על גבי^{' 16,21} לחקר טרנספורמציה המושרה על ידי PAF ²². השינויים הפנוטיפיים הנגרמים על ידי חשיפה של האציני למתווך הפוספוליפידים נחקרו באמצעות אימונופלואורסצנציה. במחקר ^{נעשה שימוש} בסמני קוטביות ואפיתל שונים למעבר מזנכימלי (EMT). טבלה 1 מזכירה את הלוקליזציה הרגילה שלהם ואת הפנוטיפ הצפוי שלהם בעת הטרנספורמציה.

נוגדנים	סימני	לוקליזציה רגילה	פנוטיפ מותמר
α6-אינטגרין	בזולטרלי	בזל עם כתם רוחבי חלש	כתם רוחבי / אפיקלי חזק
β-קטנין	צומת תא-תא	בזולטרלי	לוקליזציה חריגה / גרעינית או ציטופלסמית
וימנטין	EMT	נוכחות נעדרת / חלשה	אפ-רגולציה

טבלה 1: סמנים ששימשו במחקר. סמנים שונים המשמשים עם לוקליזציה שלהם בנוכחות והיעדר טיפול PAF.

ניתן להשתמש בשיטה זו בצורה הטובה ביותר כדי לחקור/לסנן תרופות סבירות ולמקד גנים עבור תתי-סוגים שונים של סרטן השד. זה יכול לספק נתוני תגובה לתרופות קרוב יותר לתרחיש in vivo , ולסייע בפיתוח תרופות מהיר ואמין יותר. כמו כן, ניתן להשתמש במערכת זו כדי לחקור את האיתות המולקולרי הקשור לתגובה לתרופות ולעמידות לתרופות.

Protocol

1. זריעת תאי MCF10A ב-lrECM

1. לשמור על תאי MCF10A (תאי אפיתל שד דבק) במדיום הצמיחה. מעבירים את התאים כל 4 ימים.
   הערה: הרכב הצמיחה בינוני: DMEM גבוה ללא נתרן פירובט המכיל סרום סוסים (5%), אינסולין (10 מיקרוגרם למ"ל), הידרוקורטיזון (0.5 מיקרוגרם/מ"ל), גורם גדילה אפידרמלי, EGF (20 ננוגרם/מ"ל), רעלן כולרה (100 ננוגרם/מ"ל) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל) (ראו טבלת חומרים).
2. הפשרה lrECM (ראו טבלת חומרים) על קרח 20 דקות לפני תחילת הניסוי. יום זריעת התאים נחשב בדרך כלל ליום 0.
3. עבור טריפסינזציה של התאים, לשאוף את המדיום, ולשטוף עם 2 מ"ל של PBS. יש להוסיף 900 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ולדגור ב 37 °C במשך ~ 15 דקות או עד התאים הם טריפסינזציה לחלוטין.
4. הכינו מצע של lrECM בשמונה בארות של שקופית זכוכית עם כיסוי קאמרית (ראו טבלת חומרים).
   1. כאשר התאים עוברים טריפסיניזציה, מצפים כל באר עם 60 μL של lrECM ומניחים אותו באינקובטור 37 °C CO₂ למשך 15 דקות לכל היותר.
5. הכן את השעיית התא לפי השלבים הבאים.
   1. לאחר פירוק מלא של תאים, להוסיף 5 מ"ל של מדיום השעיה מחדש כדי להרוות את פעילות הטריפסין ולסובב את התאים ב 112 x g במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
      הערה: הרכב של מתלה מחדש בינוני: DMEM גלוקוז גבוה ללא נתרן פירובט, בתוספת סרום סוסים (20%) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות למ"ל).
   2. לשאוף את המדיום בילה ולהשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של מדיום בדיקה. מערבבים היטב את המתלים כדי להבטיח היווצרות של השעיה של תא בודד.
      הערה: הרכב הבדיקה בינונית: DMEM גבוה ללא נתרן פירובט, בתוספת סרום סוסים (2%), הידרוקורטיזון (0.5 מיקרוגרם/מ"ל), רעלן כולרה (100 ננוגרם/מ"ל), אינסולין (10 מיקרוגרם/מ"ל) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל).
   3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולחשב את נפח תרחיף התא הדרוש כדי לזרוע 6 x 10^{3 תאים} בכל באר.
      הערה: בדרך כלל עדיף לכלול באר אחת נוספת בחישוב כדי להסביר שגיאות צנרת.
   4. על פי מספר הבארות הנדרשות, לדלל את השעיית התא במדיום כיסוי.
      הערה: הרכב בינוני כיסוי עבור באר יחידה הוא כדלקמן: 400 μL של מדיום בדיקה, 8 μL של lrECM (2% סופי), ו 0.02 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של EGF (5 ng / mL סופי).
6. בצע זריעה של התאים.
   1. הוסף 400 μL של מתלה התא המדולל למיטות lrECM המוכנות (שלב 1.4), תוך הקפדה קפדנית שלא להפריע למיטת lrECM. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה 5% CO₂ .

2. טיפול PAF

1. הוסף PAF 3 שעות לאחר זריעת תאים. הכן מלאי של 100 μM של PAF ב- PBS והוסף את הנפח הנדרש של 0.2 μL בכל באר (המתאימה ל -200 ננומטר).
2. הוסף את אותו ריכוז של PAF במהלך כל שינוי מדיה.

3. האכלה מחדש עם מדיה טרייה

1. יש לחדש את התאים במדיום טרי כל 4 ימים (כלומר, יום 4, יום 8, יום 12 ויום 16).

4. מחקר אימונופלואורסצנציה לזיהוי שינויים פנוטיפיים הנגרמים על ידי חשיפה ממושכת ל-PAF

1. לאחר 20 יום של תרבות, בזהירות pipette החוצה את המדיום מכל באר ולשטוף את הבארות עם 400 μL של PBS מחומם מראש.
2. תקן את מבני האצינר על ידי הוספת 400 μL של 4% paraformaldehyde (מוכן טרי על ידי דילול 16% paraformaldehyde ב 1x PBS) ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
3. שוטפים את הבארות פעם אחת עם PBS קר כקרח ומחלחלים עם PBS המכיל 0.5% טריטון X-100 למשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
4. לאחר 10 דקות, מיד אך בזהירות הוציאו את תמיסת Triton-X 100 ושטפו עם 400 מיקרו-ליטר של PBS-גליצין (מוכן טרי על ידי הוספת קמצוץ גליצין ב-PBS אחד). זה חוזר על עצמו שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
5. יש להוסיף 400 μL מתמיסת החסימה העיקרית הכוללת 10% סרום עיזים (ראו טבלת חומרים) במאגר אימונופלואורסצנטי (IF) ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
   הערה: הרכב מאגר IF: 0.05% נתרן אזיד, 0.1% BSA, 0.2% טריטון-X 100 ו-0.05% טווין (20 ב-1 PBS).
6. הסר את תמיסת החסימה העיקרית, הוסף 200 μL של נוגדן חוסם משני 2% (F(ab')2 שבר של נוגדן שגדל באנטיגן עז נגד עכבר, ראה טבלת חומרים) שהוכנה בתמיסת חסימה ראשונית, והשאר אותה למשך 45-60 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הכן את הנוגדן העיקרי (ראה טבלת חומרים) בתמיסת נוגדנים חוסמת משנית של 2% בדילול של 1:100. לאחר הסרת תמיסת החסימה המשנית, מוסיפים את הנוגדן הטרי והדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. השלב הקודם עשוי לעורר הנזלה של קרום המרתף. לפני שתמשיך בניסוי, המתן עד שהשקופית תגיע לטמפרטורת החדר. בזהירות pipette את תמיסת הנוגדנים העיקרית ולשטוף אותו שלוש פעמים עם 400 μL של חיץ IF.
9. במהלך השטיפה האחרונה עם חיץ IF, הכינו דילול של 1:200 של הנוגדן המשני המצומד לפלואורופור (ראו טבלת חומרים) בתמיסת החסימה הראשונית. דגרו את השקופיות בתמיסת הנוגדנים המשנית למשך 40-60 דקות בטמפרטורת החדר.
10. שטפו את השקופיות עם 400 μL של חיץ IF למשך 20 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם PBS למשך 10 דקות כל אחת.
11. הכתימו את הגרעינים ב-PBS המכיל 0.5 ננוגרם/מ"ל של כתם גרעיני (ראו טבלת חומרים) למשך 5-6 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם 400 מיקרון ויטר PBS כדי להסיר כתמים עודפים.
12. בזהירות pipette החוצה את כל PBS ולהבטיח הסרת הפתרון שיורי. הוסיפו טיפה אחת של מגיב הרכבה (ראו טבלת חומרים) לכל באר ואפשרו לה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
13. אחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר וצלם את השקופיות בהקדם האפשרי.
14. תמונה בהגדלה של 40x או 63x במיקרוסקופ קונפוקלי (ראו טבלת חומרים), תוך צילום מקטעי Z אופטיים בגודל צעד של 0.6 מ"מ (NA = 1.4).
15. פתח את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים). הדגם את ההבדלים המורפולוגיים באמצעות תחזיות תלת-ממדיות.
    הערה: ניתן להשתמש בצורה הטובה ביותר במקטע Z האופטי המרכזי ביותר כדי להראות הבדלים בלוקליזציה של סמני קוטביות. ניתן לכמת אותם באופן ידני כדי לייצג את אחוז הספרואידים המראים את דפוס הכתמים הספציפי הזה.
16. כדי להמחיש הבדלים בביטוי של חלבונים, בצע ניתוח כמותי למחצה המודד את הערך האפור הממוצע או חישוב פלואורסצנציה של תאים כוללים מתוקנים (CTCF)²³. מייצגים את הנתונים ככינור או כתחילי נקודות.

תוצאות

תאי MCF10A, עם החשיפה לטיפול ב-PAF, יוצרים מבנים אסינאריים עם פנוטיפים מובחנים מאוד. α6-integrin נמצא בטעות עם כתמים אפיקליים יותר. כמה אצ'יני גם הראו כתמים בלתי פוסקים (איור 2A). שני הפנוטיפים הללו מצביעים על אובדן הקוטביות הבסיסית, כפי שמעידה ספרות^24,25. ...

Discussion

מודלים מבוססים המבוססים על קווי תאים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את תהליך הסרטן. תרביות חד-שכבתיות של תאים ממשיכות לספק תובנות על מסלולי האיתות המולקולריים השונים המתווכים שינויים אופייניים בתאים סרטניים³². מחקרים על תפקידם של אונקוגנים ידועים כגון Ras, Myc ו-p53 שעברו מוטציה דו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25300062
16% paraformaldehyde	Alfa Aesar	AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
Chamber Coverglass	Nunc	155409
Cholera Toxin	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 antibody	Abcam	ab52649
Goat Serum	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
Horse Serum	Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software	ImageJ
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)	Invitrogen	S36937
Nuclear Stain  (Hoechst)	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E
Sodium Azide	Sigma	S2002
Tris Base	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
α6-integrin antibody	Millipore	MAB1378