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요약

본 프로토콜은 혈소판 활성화 인자(PAF) 유도 형질전환을 연구하기 위해 변형된 형질전환되지 않은 유방 상피 세포주인 MCF10A의 3D '온탑 ' 배양의 설정을 설명합니다. 면역-형광은 형질전환을 평가하기 위해 사용되었으며 상세히 논의된다.

초록

설치류 모델 및 확립 된 세포주와 같은 암을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 발암에 대한 귀중한 통찰력은 이러한 모델을 사용한 연구에 의해 제공되었습니다. 세포주는 유방 종양 발생과 관련된 분자 신호 전달의 조절 완화에 대한 이해를 제공하는 반면, 설치류 모델은 생체 내에서 유방암의 세포 및 분자 특성을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 유방 상피 및 암세포의 3D 배양의 확립은 in vivo 조건을 모방하여 in vivo 모델과 in vitro 모델 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 이 모델은 복잡한 분자 신호 전달 이벤트의 조절 완화와 유방 발암 중 세포 특성을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 인지질 매개체-유도(혈소판 활성화 인자, PAF) 형질전환을 연구하기 위해 3D 배양 시스템을 변형한다. 면역 조절제 및 기타 분비 된 분자는 유방에서 종양 시작 및 진행에 중요한 역할을합니다. 본 연구에서, PAF에 노출된 유방 상피 세포의 3D acinar 배양물은 극성 손실 및 변경된 세포 특성과 같은 형질전환 특성을 나타내었다. 이 3D 배양 시스템은 종양 미세 환경에서 다양한 소분자 개체에 의해 유도된 유전적 및/또는 후성유전학적 섭동을 밝히는 데 도움이 됩니다. 또한, 이 시스템은 또한 형질전환 과정에 관여할 수 있는 신규한 유전자뿐만 아니라 알려진 유전자의 식별을 위한 플랫폼을 제공할 것이다.

서문

암의 진행을 연구하기 위해 수많은 모델을 사용할 수 있으며, 각 모델은 고유하며이 복잡한 질병의 하위 유형을 나타냅니다. 각 모델은 암 생물학에 대한 독특하고 가치 있는 통찰력을 제공하며 실제 질병 상태를 모방하는 수단을 개선했습니다. 단일층으로 성장한 확립된 세포주는 증식, 침습성, 이동 및 세포자멸사와 같은 시험관 내 중요한 과정에 대한 귀중한 통찰력을제공했습니다1. 2차원(2D) 세포 배양이 여러 환경 섭동에 대한 포유류 세포의 반응을 조사하는 전통적인 도구였지만 조직 수준 반응을 예측하기 위한 이러한 발견의 외삽은 충분히 설득력이 없어 보입니다. 2D 배양의 주요 한계는 생성 된 미세 환경이 유방 조직 자체의 미세 환경과 크게 다르다는 것입니다2. 2D 배양은 세포와 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하며, 이는 모든 조직의 성장에 필수적입니다. 또한 단층 배양에서 세포가 경험하는 인장력은 이러한 세포의 극성을 방해하여 세포 신호 전달 및 거동 3,4,5를 변경합니다. 3차원(3D) 배양 시스템은 체외 조건을 모방할 수 있는 능력으로 암 연구 분야의 새로운 길을 열었습니다. 2D 세포 배양에서 손실되는 많은 중요한 미세환경 신호는 라미닌이 풍부한 세포외 기질(lrECM)의 3D 배양을 사용하여 재설정할 수 있습니다6.

다양한 연구에서 발암 7,8에서 종양 미세 환경의 중요성이 확인되었습니다. 염증 관련 요인은 미세 환경의 주요 부분입니다. 혈소판 활성화 인자 (PAF)는 다중 면역 반응 9,10을 매개하는 다양한 면역 세포에 의해 분비되는 인지질 매개체입니다. 높은 수준의 PAF는 상이한 유방암 세포주에 의해 분비되며 향상된 증식과 관련이 있습니다11. 우리 연구실의 연구에 따르면 아시나 배양에서 PAF가 장기간 존재하면 유방 상피 세포가 변형되는 것으로 나타났습니다12. PAF는 PAF 수용체 (PAFR)를 활성화시켜 PI3K / Akt 신호 전달 축13을 활성화시킵니다. PAFR은 또한 EMT, 침습 및 전이14와 관련이있는 것으로보고되었습니다.

본 프로토콜은 Chakravarty et al.12에 의해 이전에 기술된 바와 같이, 유방 상피 세포의 3D 배양을 사용하여 PAF-유도된 형질전환을 연구하기 위한 모델 시스템을 입증한다. 세포외 기질(3D 배양)에서 성장한 유방 상피 세포는 편광된 성장 정지 스페로이드를 형성하는 경향이 있습니다. 이들은 acini라고 불리며 생체내 15에서 유선의 가장 작은 기능 단위 인 유방 조직의 acini와 매우 유사합니다. 이러한 스페로이드(그림 1A,B)는 속이 빈 내강을 둘러싸고 기저막에 부착된 밀접하게 채워진 편광 상피 세포의 단층으로 구성됩니다(그림 1C). 이러한 형태 형성 과정은 문헌16에 잘 설명되어 있습니다. lrECM에 파종하면 세포가 분열과 분화를 거쳐 세포 클러스터를 형성한 다음 4일째부터 분극화됩니다. 8일차까지 acini는 세포외 기질과 직접 접촉하는 편광 세포 그룹과 기질에 접촉하지 않고 외부 편광 세포 내에 둘러싸인 분극되지 않은 세포 클러스터로 구성됩니다. 이러한 분극되지 않은 세포는 배양 12일째까지 세포사멸을 거쳐 속이 빈 내강을 형성하는 것으로 알려져 있습니다. 16 일째까지, 성장 정지 구조가 형성됩니다16.

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그림 1: 핵 염색으로 염색된 acini의 세포핵 . (A) acini의 3D 구성. (B) 20일 동안 마트리겔에서 성장한 MCF10A 아시니의 위상차 이미지. (C) 가장 중앙 부분은 중공 루멘의 존재를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2D 배양과 달리 acinar 배양은 명백한 형태 변화를 통해 정상 세포와 형질전환 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다. 형질전환되지 않은 유방 상피 세포는 속이 빈 내강을 가진 acini를 형성하여 정상적인 인간 유방 acini를 모방합니다. 이러한 스페로이드는 변형시 다양한 유전자의 조절 완화로 인해 유도 될 수있는 극성의 주요 손실 (암의 특징 중 하나), 내강의 부재 또는 중공 내강의 파괴 (세포 사멸의 회피로 인한)를 특징으로하는 분열 된 형태를 보여줍니다17,18,19,20 . 이러한 형질전환은 면역형광법과 같이 일반적으로 사용되는 기술을 사용하여 연구할 수 있습니다. 따라서, 3D 세포 배양 모델은 유방 무시나르 형태형성 및 유방 발암 과정을 조사하는 간단한 방법으로 기능할 수 있다. 인지질 매개체인 PAF의 효과를 이해하기 위한 3D 배양 시스템을 구축하면 고처리량 전임상 약물 스크리닝에 도움이 됩니다.

이 연구는 PAF 22에 의해 유도 된 형질 전환을 연구하기 위해 3D '상단'배양 프로토콜16,21을 채택했습니다. 인지질 매개체에 대한 acini의 노출에 의해 유도 된 표현형 변화는 면역 형광법을 사용하여 연구되었다. 다양한 극성 및 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT) 마커12,16이 연구에 사용되었습니다. 표 1은 이들의 정상적인 국소화와 형질전환 시 예상되는 표현형을 언급한다.

항 체표시일반 현지화형질 전환 된 표현형
α6-인테그린기저측약한 측면 얼룩이있는 기초강한 측면 / 정점 얼룩
β-카테닌세포-세포 접합기저측비정상/핵 또는 세포질 국소화
비 멘틴증권 시세 표시기부재 / 약한 존재상향 규제

표 1: 연구에 사용된 마커. PAF 치료의 유무에 따라 국소화와 함께 사용되는 다른 마커.

이 방법은 다양한 유방암 아형에 대한 그럴듯한 약물 및 표적 유전자를 연구/스크리닝하는 데 가장 잘 활용될 수 있습니다. 이는 생체 내 시나리오에 더 가까운 약물 반응 데이터를 제공하여 더 빠르고 신뢰할 수 있는 약물 개발을 지원할 수 있습니다. 또한이 시스템은 약물 반응 및 약물 내성과 관련된 분자 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. lrECM에 MCF10A 세포 파종

  1. MCF10A 세포(부착성 유방 상피 세포)를 성장 배지에 유지합니다. 4 일마다 세포를 계대하십시오.
    참고: 성장 배지의 구성: 말 혈청(5%), 인슐린(10μg/mL), 하이드로코르티손(0.5μg/mL), 표피 성장 인자, EGF(20ng/mL), 콜레라 독소(100ng/mL) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL)을 포함하는 나트륨 피루브산이 없는 고포도당 DMEM( 재료 표 참조).
  2. 실험 시작 20분 전에 얼음에서 lrECM( 재료 표 참조)을 해동합니다. 세포를 파종하는 날은 일반적으로 Day 0으로 간주됩니다.
  3. 세포를 트립신화하기 위해, 배지를 흡인하고, 2 mL의 PBS로 세척한다. 900 μL의 0.05 % 트립신 -EDTA를 추가하고 ~ 15 분 동안 또는 세포가 완전히 트립신 화 될 때까지 37 ° C에서 배양합니다.
  4. 챔버 커버 유리 슬라이드의 8 개 웰에 lrECM 베드를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
    1. 세포가 트립시니징 중일 때, 각 웰을 60 μL의 lrECM으로 코팅하고 최대 15분 동안 37°CCO2 인큐베이터에 둔다.
  5. 아래 단계에 따라 세포 현탁액을 준비합니다.
    1. 세포를 완전히 제거한 후 5mL의 재현탁 배지를 추가하여 트립신 활성을 소멸시키고 세포를 112 x g 에서 25°C에서 10분 동안 회전시킵니다.
      참고: 재현탁 배지의 구성: 피루브산 나트륨이 없는 고포도당 DMEM, 말 혈청(20%) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL)이 보충됨.
    2. 사용한 배지를 흡인하고 2mL의 분석 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 단일 세포 현탁액의 형성을 보장하기 위해 현탁액을 잘 혼합하십시오.
      참고: 분석 배지의 구성: 피루브산 나트륨이 없는 고포도당 DMEM, 말 혈청(2%), 하이드로코르티손(0.5μg/mL), 콜레라 독소(100ng/mL), 인슐린(10μg/mL) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL).
    3. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 각 웰에 6 x 103 세포를 시드하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.
      참고: 일반적으로 파이펫팅 오류를 설명하기 위해 계산에 웰을 하나 더 포함하는 것이 좋습니다.
    4. 필요한 웰의 수에 따라, 세포 현탁액을 오버레이 배지에서 희석한다.
      참고: 단일 웰의 오버레이 배지 조성은 분석 배지 400μL, lrECM 8μL(최종 2%), EGF 100μg/mL 0.02μL(최종 5ng/mL)입니다.
  6. 세포의 시드를 수행하십시오.
    1. 준비된 lrECM 베드에 희석된 세포 현탁액 400μL를 추가하여(단계 1.4), lrECM 베드를 방해하지 않도록 조심스럽게 확인합니다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.

2. PAF 치료

  1. 세포의 파종 후에 PAF 3 h를 첨가하십시오. PBS 중 PAF의 100 μM 스톡을 준비하고, 각 웰에 0.2 μL의 필요한 부피를 첨가한다(이는 200 nM에 해당).
  2. 모든 배지 교체 중에 동일한 농도의 PAF를 추가하십시오.

3. 신선한 미디어로 다시 먹이기

  1. 세포를 4일마다(즉, 4일, 8일, 12일, 및 16일) 새로운 배지로 보충한다.

4. 장기간 PAF 노출로 인한 표현형 변화를 검출하기 위한 면역형광 연구

  1. 배양 20일 후, 각 웰에서 배지를 조심스럽게 피펫팅하고 400μL의 예열된 PBS로 웰을 세척합니다.
  2. 400μL의 4% 파라포름알데히드(1x PBS에서 16% 파라포름알데히드를 희석하여 새로 제조)를 추가하고 실온에서 20분 동안 배양하여 acinar 구조를 고정합니다.
  3. 얼음처럼 차가운 PBS로 웰을 한 번 헹구고 0.5% 트리톤 X-100을 함유한 PBS로 4°C에서 10분 동안 투과화합니다.
  4. 10분 후, 즉시 그러나 조심스럽게 Triton-X 100 용액을 피펫팅하고 400μL의 PBS-글리신으로 헹굽니다(1x PBS에 글리신 한 꼬집을 추가하여 새로 준비). 이것은 각각 15 분 동안 세 번 반복됩니다.
  5. 면역형광(IF) 완충액에 10% 염소 혈청( 재료 표 참조)을 포함하는 1차 차단 용액 400μL를 추가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
    참고 : IF 완충액의 조성 : 0.05 % 아지드 화 나트륨, 0.1 % BSA, 0.2 % 트리톤 -X 100 및 0.05 % 트윈 (20 in 1 PBS).
  6. 1차 블로킹 용액을 제거하고 1차 블로킹 용액에 준비된 2% 2차 블로킹 항체(마우스 항원에 대해 염소에서 자란 항체의 F(ab')2 단편, 재료 표 참조) 200μL를 추가하고 실온에서 45-60분 동안 그대로 둡니다.
  7. 1차 항체( 재료 표 참조)를 1:100 희석액의 2% 2차 차단 항체 용액에 준비합니다. 2차 블로킹 용액을 제거한 후, 새로 제조된 항체를 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다.
  8. 이전 단계는 기저막의 액화를 유도 할 수 있습니다. 실험을 진행하기 전에 슬라이드가 실온에 도달 할 때까지 기다리십시오. 1차 항체 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 400μL의 IF 완충액으로 3회 세척합니다.
  9. IF 완충액으로 마지막으로 세척하는 동안, 1차 블로킹 용액에서 형광단-접합된 2차 항체 ( 물질 표 참조)의 1:200 희석물을 준비한다. 슬라이드를 실온에서 40-60분 동안 2차 항체 용액에서 인큐베이션한다.
  10. 슬라이드를 400μL의 IF 완충액으로 20분 동안 헹구고, 이어서 PBS로 각각 10분 동안 2회 세척한다.
  11. 실온에서 5-6분 동안 0.5ng/mL의 핵 염색( 재료 표 참조)이 포함된 PBS로 핵을 반대 염색합니다. 슬라이드를 400μL의 PBS로 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다.
  12. 전체 PBS를 조심스럽게 피펫팅하고 잔류 용액을 제거하십시오. 각 웰에 장착 시약 한 방울( 재료 표 참조)을 넣고 실온에서 밤새 방치합니다.
  13. 슬라이드를 실온에 보관하고 가능한 한 빨리 슬라이드를 이미지화합니다.
  14. 컨포칼 현미경에서 40x 또는 63x 배율 아래의 이미지( 재료 표 참조), 0.6mm 스텝 크기(NA = 1.4)의 광학 Z 절편 촬영.
  15. 이미지 처리 소프트웨어로 획득한 이미지를 엽니다( 재료 표 참조). 3D 투영을 사용하여 형태학적 차이를 보여줍니다.
    알림: 가장 중앙 광학 Z 섹션은 극성 마커의 위치 차이를 표시하는 데 가장 잘 사용할 수 있습니다. 이들은 특정 염색 패턴을 보여주는 스페로이드의 백분율을 나타내기 위해 수동으로 정량화될 수 있습니다.
  16. 단백질 발현의 차이를 설명하기 위해 평균 회색 값을 측정하거나 보정된 총 세포 형광(CTCF)23을 계산하는 반정량 분석을 수행합니다. 데이터를 바이올린 또는 점도표로 표현합니다.

결과

MCF10A 세포는 PAF 치료에 노출되면 매우 뚜렷한 표현형을 가진 아시나 구조를 형성합니다. α6-인테그린은 더 많은 정점 염색으로 잘못 국소화된 것으로 밝혀졌습니다. 몇몇 acini는 또한 불연속 염색을 나타내었다 (도 2A). 이 두 표현형은 문헌24,25에서 입증 된 바와 같이 기저 극성의 상실을 나타냅니다. 이전 보고서는 암 전이에서 α6-...

토론

확립 된 세포주 기반 모델은 발암 과정을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 세포의 단일층 배양은 암세포의 특징적인 변화를 매개하는 다양한 분자 신호전달 경로에 대한 통찰력을 지속적으로 제공한다32. Ras, Myc 및 돌연변이 된 p53과 같은 잘 알려진 종양 유전자의 역할에 대한 연구는 단층 배양을 모델 시스템33,34,35,36

공개

저자는 잠재적 인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

장비 및 인프라에 대한 접근과 실험 지원에 대해 IISER Pune 현미경 시설에 감사드립니다. 이 연구는 생명 공학부 (DBT), 인도 정부 (BT / PR8699 / MED / 30 / 1018 / 2013), 과학 및 공학 연구위원회 (SERB), 인도 정부 (EMR / 2016 / 001974) 및 부분적으로 IISER, Pune Core 자금. AK는 CSIR-SRF 펠로우십, LA는 DST-INSPIRE 펠로우십, V.C.는 DBT(BT/PR8699/MED/30/1018/2013)에서 자금을 지원받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin EDTAInvitrogen25300062
16% paraformaldehydeAlfa AesarAA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488InvitrogenA11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488InvitrogenA-11008
BSASigmaA7030
Chamber CoverglassNunc155409
Cholera ToxinSigmaC8052-1MG1 mg/mL in dH2O
Confocal MicroscopeLeicaLeica SP8
DMEMGibco11965126
EDTASigmaE6758
EGFSigmaE9644-0.2MG100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigenJackson Immunoresearch115-006-006
GM130 antibodyAbcamab52649
Goat SerumAbcamab7481
HoechstInvitrogen33258
Horse SerumGibco16050122
HydrocortisoneSigmaH08881 mg/mL in ethanol
Image Processing SoftwareImageJ
InsulinSigmaI188210 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)Corning356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)InvitrogenS36937
Nuclear Stain  (Hoechst)Invitrogen33258
PAFCayman Chemicals91575-58-5Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-StreptomycinLonza17-602E
Sodium AzideSigmaS2002
Tris BaseSigmaB9754
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
Vimentin antibodyAbcamab92547
α6-integrin antibodyMilliporeMAB1378

참고문헌

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