Trasformazione indotta dal mediatore dei fosfolipidi in colture tridimensionali

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la messa a punto di colture 3D "on top " di una linea cellulare epiteliale mammaria non trasformata, MCF10A, che è stata modificata per studiare la trasformazione indotta dal fattore attivante piastrinico (PAF). L'immunofluorescenza è stata utilizzata per valutare la trasformazione ed è discussa in dettaglio.

Abstract

Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare il cancro, come modelli di roditori e linee cellulari stabilite. Informazioni preziose sulla carcinogenesi sono state fornite da studi che utilizzano questi modelli. Le linee cellulari hanno fornito una comprensione della deregolazione della segnalazione molecolare associata alla tumorigenesi mammaria, mentre i modelli di roditori sono ampiamente utilizzati per studiare le caratteristiche cellulari e molecolari del cancro al seno in vivo. La creazione di colture 3D di cellule epiteliali e cancerose del seno aiuta a colmare il divario tra modelli in vivo e in vitro imitando le condizioni in vivo in vitro. Questo modello può essere utilizzato per comprendere la deregolazione di eventi di segnalazione molecolare complessi e le caratteristiche cellulari durante la carcinogenesi mammaria. Qui, un sistema di coltura 3D viene modificato per studiare una trasformazione indotta dal mediatore fosfolipidico (Fattore di attivazione piastrinica, PAF). Gli immunomodulatori e altre molecole secrete svolgono un ruolo importante nell'inizio e nella progressione del tumore nel seno. Nel presente studio, le colture acinose 3D di cellule epiteliali mammarie sono esposte a caratteristiche di trasformazione PAF come perdita di polarità e caratteristiche cellulari alterate. Questo sistema di coltura 3D aiuterà a far luce sulle perturbazioni genetiche e / o epigenetiche indotte da varie entità di piccole molecole nel microambiente tumorale. Inoltre, questo sistema fornirà anche una piattaforma per l'identificazione di geni nuovi e noti che potrebbero essere coinvolti nel processo di trasformazione.

Introduzione

Una miriade di modelli sono disponibili per studiare la progressione del cancro, ognuno dei quali è unico e rappresenta un sottotipo di questa complessa malattia. Ogni modello fornisce informazioni uniche e preziose sulla biologia del cancro e ha migliorato i mezzi per imitare la condizione reale della malattia. Le linee cellulari consolidate cresciute come monostrato hanno fornito preziose informazioni sui processi vitali in vitro, come proliferazione, invasività, migrazione e apoptosi¹. Sebbene la coltura cellulare bidimensionale (2D) sia stata lo strumento tradizionale per studiare la risposta delle cellule di mammifero a diverse perturbazioni ambientali, l'estrapolazione di questi risultati per prevedere le risposte a livello tissutale non sembra sufficientemente convincente. La principale limitazione delle colture 2D è che il microambiente creato differisce in gran parte da quello del tessuto mammario stesso². La coltura 2D manca dell'interazione delle cellule con la matrice extracellulare, che è vitale per la crescita di qualsiasi tessuto. Inoltre, le forze di trazione sperimentate dalla cellula in colture monostrato ostacolano la polarità di queste cellule, alterando così la segnalazione e il comportamento cellulare ^3,4,5. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) hanno aperto una nuova strada nel campo della ricerca sul cancro con la loro capacità di imitare le condizioni in vivo in vitro. Molti segnali microambientali cruciali che vengono persi nella coltura cellulare 2D potrebbero essere ristabiliti utilizzando colture 3D di matrice extracellulare ricca di laminina (lrECM)⁶.

Diversi studi hanno identificato l'importanza del microambiente tumorale nella carcinogenesi ^7,8. I fattori associati all'infiammazione sono una parte importante del microambiente. Il fattore attivante piastrinico (PAF) è un mediatore fosfolipidico secreto da varie cellule immunitarie che media le risposte immunitarie multiple ^9,10. Alti livelli di PAF sono secreti da diverse linee cellulari di cancro al seno e sono associati a una maggiore proliferazione¹¹. Studi del nostro laboratorio hanno dimostrato che la presenza prolungata di PAF nelle colture acinose porta alla trasformazione delle cellule epiteliali mammarie¹². PAF attiva il recettore PAF (PAFR), attivando l'asse di segnalazione PI3K/Akt¹³. PAFR è anche segnalato per essere associato a EMT, invasione e metastasi¹⁴.

Il presente protocollo dimostra un sistema modello per studiare la trasformazione indotta da PAF, utilizzando colture 3D di cellule epiteliali mammarie, come è stato precedentemente descritto da Chakravarty et ^al.12. Le cellule epiteliali mammarie cresciute sulla matrice extracellulare (colture 3D) tendono a formare sferoidi polarizzati arrestati dalla crescita. Questi sono chiamati acini e assomigliano molto agli acini del tessuto mammario, la più piccola unità funzionale della ghiandola mammaria, in vivo¹⁵. Questi sferoidi (Figura 1A,B) sono costituiti da un monostrato di cellule epiteliali polarizzate strettamente imballate che circondano un lume cavo e attaccate alla membrana basale (Figura 1C). Questo processo di morfogenesi è stato ben descritto in letteratura¹⁶. Quando seminano su lrECM, le cellule subiscono divisione e differenziazione per formare un gruppo di cellule, che poi si polarizzano dal giorno 4 in poi. Al giorno 8, gli acini sono costituiti da un gruppo di cellule polarizzate che sono in contatto diretto con la matrice extracellulare e un gruppo di cellule non polarizzate racchiuse all'interno delle cellule polarizzate esterne, senza contatto con la matrice. Queste cellule non polarizzate sono note per andare incontro ad apoptosi entro il giorno 12 della coltura, formando un lume cavo. Entro il giorno 16, le strutture in arresto della crescita si formano¹⁶.

Figura 1: Nuclei di cellule in acini colorati con una colorazione nucleare . (A) Costruzione 3D degli acini. (B) Immagine a contrasto di fase di MCF10A acini coltivati su Matrigel per 20 giorni. (C) La sezione più centrale mostra la presenza di un lume cavo. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

A differenza delle colture 2D, le colture di acinosi aiutano a distinguere le cellule normali e trasformate attraverso apparenti cambiamenti morfologici. Le cellule epiteliali mammarie non trasformate formano acini con un lume cavo, imitando i normali acini del seno umano. Questi sferoidi, dopo la trasformazione, mostrano una morfologia perturbata caratterizzata da una grave perdita di polarità (uno dei segni distintivi del cancro), assenza di un lume o rottura del lume cavo (a causa dell'evasione dell'apoptosi) che può essere indotta a causa della deregolazione di vari geni^17,18,19,20 . Queste trasformazioni possono essere studiate utilizzando tecniche comunemente usate come l'immunofluorescenza. Pertanto, il modello di coltura cellulare 3D può funzionare come un metodo semplice per studiare il processo di morfogenesi acinogenesi del seno e la carcinogenesi del seno. Stabilire un sistema di coltura 3D per comprendere l'effetto di un mediatore dei fosfolipidi, PAF, aiuterà nello screening preclinico dei farmaci ad alto rendimento.

Questo lavoro ha adattato il protocollo di coltura 3D "on top"^16,21 per studiare la trasformazione indotta da PAF ²². I cambiamenti fenotipici indotti dall'esposizione degli acini al mediatore fosfolipidico sono stati studiati utilizzando l'immunofluorescenza. Nello studio sono stati utilizzati vari marcatori di polarità ed epiteliale-transizione mesenchimale (EMT)^12,16. La Tabella 1 menziona la loro normale localizzazione e il loro fenotipo atteso dopo la trasformazione.

Anticorpi	Marchi	Localizzazione normale	Fenotipo trasformato
α6-integrina	Basolaterale	Basali con debole macchia laterale	Forte macchia laterale / apicale
β-catenina	Giunzione cellula-cellula	Basolaterale	Localizzazione anomala / nucleare o citoplasmatica
Vimentino	Emt	Presenza assente / debole	Up-regulation

Tabella 1: Marcatori utilizzati nello studio. Diversi marcatori utilizzati con la loro localizzazione in presenza e assenza di trattamento PAF.

Questo metodo può essere utilizzato al meglio per studiare / selezionare farmaci plausibili e geni bersaglio per vari sottotipi di cancro al seno. Ciò può fornire dati di risposta ai farmaci più vicini allo scenario in vivo , contribuendo a uno sviluppo più rapido e affidabile del farmaco. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per studiare la segnalazione molecolare associata alla risposta ai farmaci e alla resistenza ai farmaci.

Protocollo

1. Semina di celle MCF10A in lrECM

1. Mantenere le cellule MCF10A (cellule epiteliali mammarie aderenti) nel mezzo di crescita. Passare le celle ogni 4 giorni.
   NOTA: Composizione del terreno di crescita: DMEM ad alto contenuto di glucosio senza piruvato di sodio contenente siero di cavallo (5%), insulina (10 μg/mL), idrocortisone (0,5 μg/ml), fattore di crescita epidermico, EGF (20 ng/ml), tossina del colera (100 ng/mL) e penicillina-streptomicina (100 unità/ml) (vedere Tabella dei materiali).
2. Scongelare lrECM (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio 20 minuti prima dell'inizio dell'esperimento. Il giorno della semina delle cellule è generalmente considerato il giorno 0.
3. Per tripsinizzare le cellule, aspirare il mezzo e lavare con 2 ml di PBS. Aggiungere 900 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare a 37 °C per ~15 minuti o fino a quando le cellule sono completamente tripsinzzate.
4. Preparare un letto di lrECM in otto pozzetti di un vetrino di copertura camerato (vedi Tabella dei materiali).
   1. Quando le cellule sono tripsinizzatrici, rivestire ogni pozzetto con 60 μL di lrECM e metterlo in un incubatore di CO₂ a 37 °C per un massimo di 15 minuti.
5. Preparare la sospensione cellulare seguendo i passaggi seguenti.
   1. Dopo il completo spostamento delle cellule, aggiungere 5 ml di terreno di risospensione per estinguere l'attività della tripsina e ruotare le cellule a 112 x g per 10 minuti a 25 °C.
      NOTA: Composizione del mezzo di risospensione: DMEM ad alto contenuto di glucosio senza piruvato di sodio, integrato con siero di cavallo (20%) e penicillina-streptomicina (100 unità/ml).
   2. Aspirare il mezzo esaurito e risospendere le cellule in 2 ml di terreno di analisi. Mescolare bene la sospensione per garantire la formazione di una sospensione a cella singola.
      NOTA: Composizione del terreno di analisi: DMEM ad alto contenuto di glucosio senza piruvato di sodio, integrato con siero di cavallo (2%), idrocortisone (0,5 μg/ml), tossina del colera (100 ng/ml), insulina (10 μg/ml) e penicillina-streptomicina (100 unità/ml).
   3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e calcolare il volume di sospensione cellulare necessaria per seminare 6 x 10³ cellule in ciascun pozzetto.
      NOTA: in genere si preferisce includere un pozzetto aggiuntivo nel calcolo per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio.
   4. In base al numero di pozzetti richiesti, diluire la sospensione cellulare in mezzo di sovrapposizione.
      NOTA: La composizione del mezzo di sovrapposizione per un singolo pozzetto è la seguente: 400 μL di mezzo di analisi, 8 μL di lrECM (2% finale) e 0,02 μL di 100 μg/mL di EGF (5 ng/mL finale).
6. Eseguire la semina delle cellule.
   1. Aggiungere 400 μL della sospensione cellulare diluita ai letti lrECM preparati (fase 1.4), assicurandosi accuratamente di non disturbare il letto lrECM. Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .

2. Trattamento PAF

1. Aggiungere PAF 3 h seguendo la semina delle cellule. Preparare una riserva di 100 μM di PAF in PBS e aggiungere il volume richiesto di 0,2 μL in ciascun pozzetto (che corrisponde a 200 nM).
2. Aggiungi la stessa concentrazione di PAF durante ogni cambio di supporto.

3. Rialimentazione con terreni freschi

1. Ricostituire le cellule con terreno fresco ogni 4 giorni (cioè Giorno 4, Giorno 8, Giorno 12 e Giorno 16).

4. Studio di immunofluorescenza per rilevare i cambiamenti fenotipici indotti dall'esposizione prolungata alla PAF

1. Dopo 20 giorni di coltivazione, estrarre accuratamente il terreno da ciascun pozzetto e lavare i pozzetti con 400 μL di PBS preriscaldato.
2. Fissare le strutture acinose aggiungendo 400 μL di paraformaldeide al 4% (preparata al momento diluendo il 16% di paraformaldeide in 1x PBS) e incubando per 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Risciacquare i pozzetti una volta con PBS ghiacciato e permeabilizzare con PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100 per 10 minuti a 4 °C.
4. Dopo 10 minuti, pipettare immediatamente ma accuratamente la soluzione di Triton-X 100 e risciacquare con 400 μL di PBS-glicina (preparata al momento aggiungendo un pizzico di glicina in 1x PBS). Questo viene ripetuto tre volte per 15 minuti ciascuno.
5. Aggiungere 400 μL della soluzione bloccante primaria contenente il 10% di siero di capra (vedere tabella dei materiali) in tampone di immunofluorescenza (IF) e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti.
   NOTA: Composizione del tampone IF: 0,05% azoturo di sodio, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 e 0,05% Tween (20 in 1 PBS).
6. Rimuovere la soluzione bloccante primaria, aggiungere 200 μL di anticorpo bloccante secondario al 2% (frammento F(ab')2 di anticorpo generato in capra contro l'antigene del topo, vedere Tabella dei materiali) preparato in soluzione bloccante primaria e lasciare agire per 45-60 minuti a temperatura ambiente.
7. Preparare l'anticorpo primario (vedere Tabella dei materiali) in una soluzione di anticorpi bloccanti secondari al 2% in una diluizione 1:100. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante secondaria, aggiungere l'anticorpo appena preparato e incubare per una notte a 4 °C.
8. Il passaggio precedente può provocare la liquefazione della membrana basale. Prima di procedere con l'esperimento, attendere che il vetrino raggiunga la temperatura ambiente. Pipettare accuratamente la soluzione di anticorpi primari e lavarla tre volte con 400 μL di tampone IF.
9. Durante l'ultimo lavaggio con tampone IF, preparare una diluizione 1:200 dell'anticorpo secondario coniugato con fluorofori (vedere Tabella dei materiali) nella soluzione bloccante primaria. Incubare i vetrini nella soluzione anticorpale secondaria per 40-60 minuti a temperatura ambiente.
10. Risciacquare i vetrini con 400 μL di tampone IF per 20 minuti, seguiti da due lavaggi con PBS per 10 minuti ciascuno.
11. Controcolorare i nuclei con PBS contenente 0,5 ng/mL di colorazione nucleare (vedi Tabella dei materiali) per 5-6 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte con 400 μL di PBS per rimuovere le macchie in eccesso.
12. Pipettare accuratamente l'intero PBS e assicurarsi di rimuovere la soluzione residua. Aggiungere una goccia di reagente di montaggio (vedere Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto e lasciarlo riposare a temperatura ambiente durante la notte.
13. Conservare le diapositive a temperatura ambiente e visualizzare le diapositive il prima possibile.
14. Immagine con ingrandimento 40x o 63x su un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali), prendendo sezioni ottiche Z di dimensioni di passo di 0,6 mm (NA = 1,4).
15. Aprire le immagini acquisite con un software di elaborazione delle immagini (vedi Tabella dei materiali). Dimostrare le differenze morfologiche utilizzando proiezioni 3D.
    NOTA: la sezione Z ottica più centrale può essere utilizzata al meglio per mostrare le differenze nella localizzazione dei marcatori di polarità. Questi possono essere quantificati manualmente per rappresentare la percentuale di sferoidi che mostrano quel modello di colorazione specifico.
16. Per illustrare le differenze nell'espressione delle proteine, eseguire un'analisi semi-quantitativa che misura il valore medio di grigio o calcola la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF)²³. Rappresentare i dati come violino o diagramma a punti.

Risultati

Le cellule MCF10A, dopo esposizione al trattamento con PAF, formano strutture acinose con fenotipi molto distinti. L'α6-integrina è risultata essere localizzata in modo errato con una colorazione più apicale. Alcuni acini hanno anche mostrato colorazioni discontinue (Figura 2A). Entrambi questi fenotipi indicano la perdita di polarità basale, come evidenziato dalla letteratura^24,25. Rapporti precedenti indicano il ruolo controver...

Discussione

I modelli basati su linee cellulari consolidate sono ampiamente utilizzati per studiare il processo di cancerogenesi. Le colture monostrato di cellule continuano a fornire informazioni sulle varie vie di segnalazione molecolare che mediano i cambiamenti caratteristici nelle cellule tumorali³². Studi sul ruolo di oncogeni ben noti come Ras, Myc e p53 mutati sono stati riportati per la prima volta utilizzando colture monostrato come sistema modello^33,34,35,36

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25300062
16% paraformaldehyde	Alfa Aesar	AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
Chamber Coverglass	Nunc	155409
Cholera Toxin	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 antibody	Abcam	ab52649
Goat Serum	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
Horse Serum	Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software	ImageJ
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)	Invitrogen	S36937
Nuclear Stain  (Hoechst)	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E
Sodium Azide	Sigma	S2002
Tris Base	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
α6-integrin antibody	Millipore	MAB1378