Phospholipid-Mediator-induzierte Transformation in dreidimensionalen Kulturen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt den Aufbau von 3D-On-Top-Kulturen einer nicht transformierten Brustepithelzelllinie, MCF10A, die modifiziert wurde, um die durch den Thrombozytenaktivierungsfaktor (PAF) induzierte Transformation zu untersuchen. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die Transformation zu bewerten und wird ausführlich diskutiert.

Zusammenfassung

Mehrere Modelle wurden entwickelt, um Krebs zu untersuchen, wie Nagetiermodelle und etablierte Zelllinien. Studien mit diesen Modellen lieferten wertvolle Einblicke in die Karzinogenese. Zelllinien haben ein Verständnis für die Deregulation der molekularen Signalübertragung im Zusammenhang mit der Brusttumorgenese geliefert, während Nagetiermodelle häufig verwendet werden, um zelluläre und molekulare Eigenschaften von Brustkrebs in vivo zu untersuchen. Die Etablierung von 3D-Kulturen von Brustepithel- und Krebszellen hilft, die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Modellen zu schließen, indem die In-vivo-Bedingungen in vitro nachgeahmt werden. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Deregulation komplexer molekularer Signalereignisse und die zellulären Eigenschaften während der Brustkarzinogenese zu verstehen. Hier wird ein 3D-Kultursystem modifiziert, um eine Phospholipid-Mediator-induzierte (Platelet Activating Factor, PAF) Transformation zu untersuchen. Immunmodulatoren und andere sezernierte Moleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorinitiierung und -progression in der Brust. In der vorliegenden Studie werden 3D-Azinuskulturen von Brustepithelzellen PAF-Transformationsmerkmalen wie Polaritätsverlust und veränderten zellulären Eigenschaften ausgesetzt. Dieses 3D-Kultursystem wird dazu beitragen, genetische und / oder epigenetische Störungen zu beleuchten, die durch verschiedene niedermolekulare Einheiten in der Tumormikroumgebung induziert werden. Darüber hinaus wird dieses System auch eine Plattform für die Identifizierung neuer sowie bekannter Gene bieten, die am Transformationsprozess beteiligt sein könnten.

Einleitung

Eine Vielzahl von Modellen steht zur Verfügung, um das Fortschreiten von Krebs zu untersuchen, von denen jedes einzigartig ist und einen Subtyp dieser komplexen Krankheit darstellt. Jedes Modell bietet einzigartige und wertvolle Einblicke in die Krebsbiologie und hat die Mittel verbessert, um den tatsächlichen Krankheitszustand nachzuahmen. Etablierte Zelllinien, die als Monoschicht gezüchtet wurden, haben wertvolle Einblicke in lebenswichtige Prozesse in vitro wie Proliferation, Invasivität, Migration und Apoptose^{geliefert 1}. Obwohl die zweidimensionale (2D) Zellkultur das traditionelle Werkzeug war, um die Reaktion von Säugetierzellen auf mehrere Umweltstörungen zu untersuchen, scheint die Extrapolation dieser Ergebnisse zur Vorhersage von Reaktionen auf Gewebeebene nicht überzeugend genug zu sein. Die Haupteinschränkung der 2D-Kulturen besteht darin, dass sich die erzeugte Mikroumgebung stark von der des Brustgewebes selbst unterscheidet². Der 2D-Kultur fehlt die Interaktion der Zellen mit der extrazellulären Matrix, die für das Wachstum jedes Gewebes unerlässlich ist. Auch Zugkräfte, denen die Zelle in Monoschichtkulturen ausgesetzt ist, behindern die Polarität dieser Zellen und verändern so die Zellsignalisierung und^{das Verhalten 3,4,5}. Dreidimensionale (3D) Kultursysteme haben mit ihrer Fähigkeit, die in vivo Bedingungen in vitro nachzuahmen, einen neuen Weg im Bereich der Krebsforschung eröffnet. Viele wichtige Hinweise auf die Mikroumgebung, die in der 2D-Zellkultur verloren gehen, könnten mithilfe von 3D-Kulturen der lamininreichen extrazellulären Matrix (lrECM⁾ wiederhergestellt werden6.

Verschiedene Studien haben die Bedeutung der Tumormikroumgebung bei der Karzinogenese identifiziert ^7,8. Entzündungsassoziierte Faktoren sind ein wichtiger Teil der Mikroumgebung. Der Thrombozytenaktivierungsfaktor (PAF) ist ein von verschiedenen Immunzellen sezernierter Phospholipidmediator, der mehrere Immunantworten vermittelt ^9,10. Hohe PAF-Spiegel werden von verschiedenen Brustkrebszelllinien sezerniert und sind mit einer erhöhten Proliferation assoziiert¹¹. Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass die längere Anwesenheit von PAF in Azinuskulturen zur Transformation von Brustepithelzellen führt¹². PAF aktiviert den PAF-Rezeptor (PAFR) und aktiviert die PI3K/Akt-Signalachse¹³. Es wird auch berichtet, dass PAFR mit EMT, Invasion und Metastasierung assoziiert ist¹⁴.

Das vorliegende Protokoll zeigt ein Modellsystem zur Untersuchung der PAF-induzierten Transformation unter Verwendung von 3D-Kulturen von Brustepithelzellen, wie sie zuvor von Chakravarty et ^al.12 beschrieben wurde. Die Brustepithelzellen, die auf der extrazellulären Matrix (3D-Kulturen) wachsen, neigen dazu, polarisierte wachstumshemmende Sphäroide zu bilden. Diese werden Acini genannt und ähneln stark den Acini des Brustgewebes, der kleinsten funktionellen Einheit der Brustdrüse, in vivo¹⁵. Diese Sphäroide (Abbildung 1A,B) bestehen aus einer Monoschicht dicht gepackter polarisierter Epithelzellen, die ein hohles Lumen umgeben und an der Basalmembran befestigt sind (Abbildung 1C). Dieser Prozess der Morphogenese wurde in Literatur¹⁶ gut beschrieben. Wenn sie auf lrECM ausgesät werden, durchlaufen die Zellen eine Teilung und Differenzierung, um einen Zellhaufen zu bilden, der dann ab Tag 4 polarisiert. Am Tag 8 bestehen die Acini aus einer Gruppe polarisierter Zellen, die in direktem Kontakt mit der extrazellulären Matrix stehen, und einem Cluster von unpolarisierten Zellen, die in den äußeren polarisierten Zellen eingeschlossen sind, ohne Kontakt zur Matrix. Es ist bekannt, dass diese unpolarisierten Zellen am 12. Tag der Kultur Apoptose durchlaufen und ein hohles Lumen bilden. Am Tag 16 bilden sich wachstumshemmende Strukturen¹⁶.

Abbildung 1: Zellkerne in Acini, die mit einer Kernfärbung gefärbt sind . (A) 3D-Konstruktion der Acini. (B) Phasenkontrastbild von MCF10A acini, das 20 Tage lang auf Matrigel gezüchtet wurde. (C) Der mittlere Abschnitt zeigt das Vorhandensein eines hohlen Lumens. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Im Gegensatz zu 2D-Kulturen helfen Azinuskulturen bei der Unterscheidung normaler und transformierter Zellen durch offensichtliche Morphologieänderungen. Nicht transformierte Brustepithelzellen bilden Acini mit einem hohlen Lumen, das die normalen menschlichen Brustacini nachahmt. Diese Sphäroide zeigen bei der Transformation eine gestörte Morphologie, die durch einen starken Polaritätsverlust (eines der Kennzeichen von Krebs), das Fehlen eines Lumens oder eine Störung des Hohllumens (aufgrund der Umgehung der Apoptose) gekennzeichnet ist, die aufgrund einer Deregulation verschiedener Gene induziert werden kann^17,18,19,20 . Diese Transformationen können mit häufig verwendeten Techniken wie Immunfluoreszenz untersucht werden. Somit kann das 3D-Zellkulturmodell als einfache Methode dienen, um den Prozess der Brust-Azinus-Morphogenese und Brustkarzinogenese zu untersuchen. Die Einrichtung eines 3D-Kultursystems, um die Wirkung eines Phospholipidmediators, PAF, zu verstehen, wird das präklinische Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz unterstützen.

Diese Arbeit hat das 3D-On-Top-Kulturprotokoll^16,21 für die Untersuchung der durch PAF ²² induzierten Transformation angepasst. Die phänotypischen Veränderungen, die durch die Exposition der Acini gegenüber dem Phospholipidmediator induziert wurden, wurden mittels Immunfluoreszenz untersucht. In der Studie wurden verschiedene Polaritäts- und epitheliale zu mesenchymale Übergangsmarker (EMT)^12,16 verwendet. Tabelle 1 erwähnt ihre normale Lokalisation und ihren erwarteten Phänotyp bei der Transformation.

Antikörper	Zeichen	Normale Lokalisierung	Transformierter Phänotyp
α6-Integrin	Basolateral	Basal mit schwacher lateraler Färbung	Starker lateraler / apikaler Fleck
β-Catenin	Zell-Zell-Übergang	Basolateral	Abnorme / nukleäre oder zytoplasmatische Lokalisation
Vimentin	Emt	Fehlende / schwache Präsenz	Hochregulierung

Tabelle 1: In der Studie verwendete Marker. Verschiedene Marker, die mit ihrer Lokalisation in Gegenwart und Abwesenheit einer PAF-Behandlung verwendet werden.

Diese Methode kann am besten verwendet werden, um plausible Medikamente und Zielgene für verschiedene Brustkrebs-Subtypen zu untersuchen / zu screenen. Dies kann Daten zur Arzneimittelreaktion liefern, die näher am In-vivo-Szenario liegen, was zu einer schnelleren und zuverlässigeren Arzneimittelentwicklung beiträgt. Dieses System kann auch verwendet werden, um die molekulare Signalübertragung zu untersuchen, die mit Arzneimittelreaktion und Arzneimittelresistenz verbunden ist.

Protokoll

1. Aussaat von MCF10A-Zellen in lrECM

1. Halten Sie MCF10A-Zellen (adhärente Brustepithelzellen) im Wachstumsmedium. Durchgang der Zellen alle 4 Tage.
   HINWEIS: Zusammensetzung des Wachstumsmediums: DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Natriumpyruvat mit Pferdeserum (5%), Insulin (10 μg/ml), Hydrocortison (0,5 μg/ml), epidermaler Wachstumsfaktor, EGF (20 ng/ml), Choleratoxin (100 ng/ml) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten/ml) (siehe Materialtabelle).
2. Auftauen von lrECM (siehe Materialtabelle) auf Eis 20 min vor Beginn des Experiments. Der Tag der Aussaat der Zellen wird im Allgemeinen als Tag 0 betrachtet.
3. Um die Zellen zu trypsinisieren, saugen Sie das Medium ab und waschen Sie es mit 2 ml PBS. Fügen Sie 900 μL 0,05% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für ~15 min oder bis die Zellen vollständig trypsinisiert sind.
4. Bereiten Sie ein Bett aus lrECM in acht Vertiefungen eines Kammerdeckglasobjektträgers vor (siehe Materialtabelle).
   1. Wenn die Zellen trypsinisieren, beschichten Sie jede Vertiefung mit 60 μL lrECM und legen Sie sie für maximal 15 min in einen 37 °C CO2-Inkubator.
5. Bereiten Sie die Zellsuspension gemäß den folgenden Schritten vor.
   1. Nach der vollständigen Entfernung der Zellen werden 5 ml Resuspensionsmedium hinzugefügt, um die Trypsinaktivität zu löschen, und die Zellen bei 112 x g für 10 min bei 25 °C drehen.
      HINWEIS: Zusammensetzung des Resuspensionsmediums: DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit Pferdeserum (20%) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml).
   2. Saugen Sie das verbrauchte Medium ab und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml Assay-Medium. Mischen Sie die Suspension gut, um die Bildung einer einzelligen Suspension sicherzustellen.
      HINWEIS: Zusammensetzung des Assaymediums: DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit Pferdeserum (2%), Hydrocortison (0,5 μg / ml), Choleratoxin (100 ng / ml), Insulin (10 μg / ml) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml).
   3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, die benötigt wird, um 6 x 10³ Zellen in jeder Vertiefung zu säen.
      HINWEIS: Es wird im Allgemeinen bevorzugt, eine zusätzliche Vertiefung in die Berechnung einzubeziehen, um etwaige Pipettierfehler zu berücksichtigen.
   4. Je nach Anzahl der erforderlichen Vertiefungen die Zellsuspension in Overlay-Medium verdünnen.
      HINWEIS: Die Zusammensetzung des Overlay-Mediums für eine einzelne Vertiefung ist wie folgt: 400 μL Assaymedium, 8 μL lrECM (2% endgültig) und 0,02 μL 100 μg/ml EGF (5 ng/ml endgültig).
6. Führen Sie das Seeding der Zellen durch.
   1. 400 μL der verdünnten Zellsuspension in die vorbereiteten lrECM-Betten geben (Schritt 1.4), wobei darauf zu achten ist, dass das lrECM-Bett nicht gestört wird. Inkubieren bei 37 °C in einem befeuchteten 5%_{CO2-Inkubator} .

2. PAF-Behandlung

1. Fügen Sie PAF 3 h nach der Aussaat der Zellen hinzu. Bereiten Sie einen PAF-Vorrat von 100 μM in PBS vor und fügen Sie das erforderliche Volumen von 0,2 μL in jede Vertiefung hinzu (was 200 nM entspricht).
2. Fügen Sie bei jedem Medienwechsel die gleiche PAF-Konzentration hinzu.

3. Nachfütterung mit frischen Medien

1. Füllen Sie die Zellen alle 4 Tage mit frischem Medium auf (dh Tag 4, Tag 8, Tag 12 und Tag 16).

4. Immunfluoreszenzstudie zum Nachweis phänotypischer Veränderungen, die durch längere PAF-Exposition induziert werden

1. Nach 20 Tagen Kultivierung pipetten Sie das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung heraus und waschen Sie die Vertiefungen mit 400 μL vorgewärmtem PBS.
2. Fixieren Sie die acinarus Strukturen durch Zugabe von 400 μL 4% Paraformaldehyd (frisch zubereitet durch Verdünnen von 16% Paraformaldehyd in 1x PBS) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur.
3. Die Vertiefungen einmal mit eiskaltem PBS abspülen und mit PBS mit 0,5% Triton X-100 für 10 min bei 4 °C permeabilisieren.
4. Nach 10 min sofort aber vorsichtig die Triton-X 100 Lösung pipetten und mit 400 μL PBS-Glycin abspülen (frisch zubereitet durch Zugabe einer Prise Glycin in 1x PBS). Dies wird dreimal für jeweils 15 Minuten wiederholt.
5. 400 μL der primären Blockierungslösung, bestehend aus 10% Ziegenserum (siehe Materialtabelle), in Immunfluoreszenzpuffer (IF) zugeben und bei Raumtemperatur 60 min inkubieren.
   HINWEIS: Zusammensetzung des IF-Puffers: 0,05% Natriumazid, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 und 0,05% Tween (20 in 1 PBS).
6. Entfernen Sie die primäre Blockierungslösung, fügen Sie 200 μL 2% sekundär blockierenden Antikörper (F(ab')2 Fragment des in Ziege gegen Mausantigen erhöhten Antikörpers, siehe Tabelle der Materialien) in primärer Blockierungslösung hinzu und lassen Sie es 45-60 min bei Raumtemperatur.
7. Bereiten Sie den primären Antikörper (siehe Materialtabelle) in 2%iger sekundär blockierender Antikörperlösung in einer Verdünnung von 1:100 vor. Nach dem Entfernen der sekundären Blockierungslösung den frisch zubereiteten Antikörper zugeben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
8. Der vorherige Schritt kann eine Verflüssigung der Basalmembran hervorrufen. Bevor Sie mit dem Experiment fortfahren, warten Sie, bis der Objektträger Raumtemperatur erreicht hat. Die primäre Antikörperlösung vorsichtig pipetten und dreimal mit 400 μL ZF-Puffer waschen.
9. Während der letzten Wäsche mit IF-Puffer wird eine 1:200-Verdünnung des fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpers (siehe Materialtabelle) in der primären Blockierungslösung hergestellt. Inkubieren Sie die Objektträger in der sekundären Antikörperlösung für 40-60 min bei Raumtemperatur.
10. Spülen Sie die Objektträger mit 400 μL ZF-Puffer für 20 min, gefolgt von zwei Waschgängen mit PBS für jeweils 10 min.
11. Die Kerne mit PBS, das 0,5 ng/ml Kernfärbung enthält (siehe Materialtabelle), 5-6 min bei Raumtemperatur gegenfärben. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 400 μL PBS, um überschüssigen Fleck zu entfernen.
12. Pipette vorsichtig das gesamte PBS heraus und stelle sicher, dass die Restlösung entfernt wird. Fügen Sie einen Tropfen Montagereagenz (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen.
13. Lagern Sie die Dias bei Raumtemperatur und machen Sie so schnell wie möglich ein Bild von den Dias.
14. Aufnahme unter 40- oder 63-facher Vergrößerung auf einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit optischen Z-Schnitten von 0,6 mm Schrittweite (NA = 1,4).
15. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle). Demonstrieren Sie die morphologischen Unterschiede anhand von 3D-Projektionen.
    HINWEIS: Der mittlere optische Z-Schnitt kann am besten verwendet werden, um Unterschiede in der Lokalisierung von Polaritätsmarkern zu zeigen. Diese können manuell quantifiziert werden, um den Prozentsatz der Sphäroide darzustellen, die dieses spezifische Färbemuster aufweisen.
16. Um Unterschiede in der Expression von Proteinen zu veranschaulichen, führen Sie eine semiquantitative Analyse durch, die den mittleren Grauwert misst oder die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) ^berechnet23. Stellen Sie die Daten als Violin- oder Punktdiagramme dar.

Ergebnisse

MCF10A-Zellen bilden nach Exposition gegenüber PAF-Behandlung Azinusstrukturen mit sehr unterschiedlichen Phänotypen. Es wurde festgestellt, dass α6-Integrin mit apikaler Färbung fehllokalisiert war. Einige Acini zeigten auch diskontinuierliche Färbungen (Abbildung 2A). Beide Phänotypen weisen auf den Verlust der basalen Polarität hin, wie aus der Literatur^24,25 hervorgeht. Frühere Berichte weisen auf die umstrittene Rolle vo...

Diskussion

Etablierte Zelllinien-basierte Modelle werden häufig verwendet, um den Prozess der Karzinogenese zu untersuchen. Monoschichtkulturen von Zellen liefern weiterhin Einblicke in die verschiedenen molekularen Signalwege, die charakteristische Veränderungen in Krebszellen vermitteln³². Studien zur Rolle bekannter Onkogene wie Ras, Myc und mutiertem p53 wurden erstmals unter Verwendung von Monoschichtkulturen als Modellsystem^33,34,35,36

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25300062
16% paraformaldehyde	Alfa Aesar	AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
Chamber Coverglass	Nunc	155409
Cholera Toxin	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 antibody	Abcam	ab52649
Goat Serum	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
Horse Serum	Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software	ImageJ
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)	Invitrogen	S36937
Nuclear Stain  (Hoechst)	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E
Sodium Azide	Sigma	S2002
Tris Base	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
α6-integrin antibody	Millipore	MAB1378