Фосфолипидный медиатор индуцированная трансформация в трехмерных культурах

Резюме

Настоящий протокол описывает создание 3D-культур «сверху» нетрансформированной эпителиальной клеточной линии молочной железы MCF10A, которая была модифицирована для изучения трансформации, вызванной активирующим фактором тромбоцитов (PAF). Иммунофлуоресценция была использована для оценки трансформации и подробно обсуждается.

Аннотация

Для изучения рака было разработано несколько моделей, таких как модели грызунов и установленные клеточные линии. Ценная информация о канцерогенезе была получена в результате исследований с использованием этих моделей. Клеточные линии обеспечили понимание дерегуляции молекулярной сигнализации, связанной с опухолевым генезом молочной железы, в то время как модели грызунов широко используются для изучения клеточных и молекулярных характеристик рака молочной железы in vivo. Создание 3D-культур эпителиальных и раковых клеток молочной железы помогает преодолеть разрыв между моделями in vivo и in vitro , имитируя условия in vivo in vitro. Эта модель может быть использована для понимания дерегуляции сложных молекулярных сигнальных событий и клеточных характеристик во время канцерогенеза молочной железы. Здесь система 3D-культур модифицируется для изучения фосфолипидной медиатор-индуцированной (активирующий фактор тромбоцитов, PAF) трансформации. Иммуномодуляторы и другие секретируемые молекулы играют важную роль в инициации и прогрессировании опухоли в молочной железе. В настоящем исследовании 3D-ацинарные культуры эпителиальных клеток молочной железы подвергаются воздействию проявленных характеристик трансформации PAF, таких как потеря полярности и измененные клеточные характеристики. Эта система 3D-культур поможет пролить свет на генетические и / или эпигенетические возмущения, вызванные различными мелкомолекулярными образованиями в микроокружении опухоли. Кроме того, эта система также обеспечит платформу для идентификации новых, а также известных генов, которые могут быть вовлечены в процесс трансформации.

Введение

Для изучения прогрессирования рака доступно множество моделей, каждая из которых уникальна и представляет собой подтип этого сложного заболевания. Каждая модель предоставляет уникальную и ценную информацию о биологии рака и улучшает средства для имитации фактического состояния заболевания. Установленные клеточные линии, выращенные как монослой, предоставили ценную информацию о жизненно важных процессах in vitro, таких как пролиферация, инвазивность, миграция и апоптоз¹. Хотя двумерная (2D) клеточная культура была традиционным инструментом для исследования реакции клеток млекопитающих на несколько возмущений окружающей среды, экстраполя....

протокол

1. Посев клеток MCF10A в lrECM

1. Поддерживать клетки MCF10A (адгезивные эпителиальные клетки молочной железы) в питательной среде. Проходите клетки каждые 4 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав питательной среды: высокая глюкоза DMEM без пирувата натрия, содержащая конскую сыворотку (5%), инсулин (10 мкг/мл), гидрокортизон (0,5 мкг/мл), эпидермальный фактор роста, EGF (20 нг/мл), холерного токсина (100 нг/мл) и пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл) (см. Таблицу материалов).
2. Оттаивание lrECM (см. Таблицу материалов) на льду за 20 мин до начала эксперимента. Днем посева клеток обычно считается День 0.
3. Дл....

Результаты

Клетки MCF10A при воздействии лечения PAF образуют ацинарные структуры с очень отчетливыми фенотипами. Было обнаружено, что α6-интегрин неправильно локализован с более апикальным окрашиванием. Некоторые ацины также показали прерывистое окрашивание (рисунок 2А). Оба этих фе?.......

Обсуждение

Установленные модели на основе клеточных линий широко используются для изучения процесса канцерогенеза. Однослойные культуры клеток продолжают давать представление о различных молекулярных сигнальных путях, которые опосредуют характерные изменения в раковых клетках³²........

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25300062
16% paraformaldehyde	Alfa Aesar	AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
Chamber Coverglass	Nunc	155409
Cholera Toxin	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 antibody	Abcam	ab52649
Goat Serum	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
Horse Serum	Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software	ImageJ
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)	Invitrogen	S36937
Nuclear Stain  (Hoechst)	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E
Sodium Azide	Sigma	S2002
Tris Base	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
α6-integrin antibody	Millipore	MAB1378