בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

Summary

פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.

Abstract

אימונותרפיה עם נוגדנים ספציפיים לאנטיגן או מעכבי בקרה חיסונית חוללה מהפכה בטיפול בסרטן השד. תאי סרטן השד המבטאים את קולטן גורם הגדילה האפידרמיס HER2 יכולים להיות ממוקדים על ידי נוגדן נגד HER-2 trastuzumab. ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) היא מנגנון חשוב המעורב בפעילות האנטי-סרטנית של HER-2. Trastuzumab הקשורים לתאים סרטניים יכול להיות מזוהה על ידי קולטני Fc של תאים משפיעים ADCC (למשל, תאי הרג טבעי (NK), מקרופאגים, גרנולוציטים), הפעלת הפעילות ציטוטוקסית של תאים חיסוניים אלה המוביל למוות תאים סרטניים. יצאנו לפתח בדיקה מבוססת תמונה לכימות ADCC כדי לזהות תרכובות אפנן ADCC חדשות על ידי סינון תוכן גבוה. בניסוי, תאי סרטן השד JIMT-1 בעלי ביטוי יתר של HER2 מתורבתים יחד עם תאי NK-92 בנוכחות טרסטוזומאב, ומוות תאי המטרה מכומת על ידי מיקרוסקופ אוטומטי וניתוח תמונה כמותי. תאי המטרה נבדלים מתאי אפקט בהתבסס על פלואורסצנטיות ה-EGFP שלהם. אנו מראים כיצד ניתן לבדוק ספריות מורכבות בבדיקה כדי לזהות תרופות אפנן ADCC. לשם כך הוצבה פלטת בדיקה של ספריית תרכובת באמצעות כימיקלים עדינים שנבחרו באופן אקראי ממדף המעבדה. שלוש תרכובות מערערות יציבות מיקרוטובולים (קולכיצין, וינקריסטין, פודופילוטוקסין) הצפויות להפריע לנדידת תאי NK ולפירוק תאי NK נכללו גם הן בספריית הבדיקה. מסך הבדיקה זיהה את כל שלוש תרכובות הבקרה החיוביות כפגיעות המוכיחות את התאמת השיטה לזיהוי תרופות משנות ADCC בספרייה כימית. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבצע מסכי ספרייה מורכבים כדי לזהות תרכובות משפרות ADCC שיכולות לשמש כסוכני טיפול אדג'ובנטיים לטיפול בחולים המקבלים אימונותרפיה אנטי-סרטנית. בנוסף, השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי תופעות לוואי בלתי רצויות מעכבות ADCC של תרופות טיפוליות הנלקחות על ידי חולי סרטן עבור אינדיקציות שונות.

Introduction

אימונותרפיה עם נוגדנים אנטי-סרטניים, מעכבי בקרה חיסונית, או תאי T (CAR-T) המבטאים קולטן אנטיגן כימרי מייצגת גישה רבת עוצמה לטיפול בסרטן ^1,2,3. Trastuzumab הוא נוגדן חד שבטי אנושי anti-HER-2 (קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2) המשמש לטיפול בסרטן שד חיובי HER-2 בשלב מוקדם או גרורתי, כמו גם סרטן קיבה גרורתי חיובי HER-2 ^4,5,6. זה פועל בעיקר על ידי עיכוב ההשפעה מגרה התפשטות של גורם גדילה אפידרמיס⁴. עם זאת, דווח כי trastuzumab גורם ביעילות למוות של תאים סרטניים גם אם התאים הסרטניים איבדו את תגובתם לגירוי HER-2⁷. השפעה פרדוקסלית זו של הנוגדן נובעת מציטוטוקסיות תלויית תאים (ADCC)⁷. ADCC יכול להיות מתווך על ידי תאי הרג טבעי (NK), גרנולוציטים ומקרופאגים הידועים ביחד כתאי ההשפעה של ADCC ^8,9. אם נוגדן, כגון trastuzumab, נקשר לתאי הגידול, אז תאים משפיעים אלה משתמשים בקולטני Fc שלהם כדי לקשור את האזור הקבוע (Fc) של הנוגדן. הנוגדן מגשר בין תאי הגידול לבין תאי ההשפעה נושאי קולטן Fc, וגורם לשחרור המתווכים ציטוטוקסיים שלהם¹⁰. תאי הרג טבעיים משחררים את המטען ציטוטוקסי של הגרגירים שלהם המכילים פרפורין כדי ליצור נקבוביות בקרום תא המטרה וגראנזים (המפעיל מסלולי איתות מוות תאי) לתוך סינפסת החיסון, מה שמוביל לאפופטוזיס של התאים הסרטניים (ראו איור 1).

איור 1: אינטראקציות של אפקטור ותא יעד ב-ADCC. קולטן Fcγ משטח התא של תא ה- NK המשפיע מזהה את אזור Fc של נוגדן ה- trastuzumab נגד HER2 הספציפי למולקולת HER2 המבוטאת על פני השטח של התא הסרטני. לפיכך, מה שנקרא סינפסה אימונולוגית הוקמה בין שני התאים, גרימת exocytosis מכוונת של גרגירים ציטוטוקסיים של התא המשפיע. מולקולות הפרפורין והגרנזים המשתחררות גורמות בסופו של דבר לאפופטוזיס של תא המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מספר בדיקות פותחו בעבר כדי לכמת ציטוטוקסיות, כולל ADCC. תקן הזהב הוא שיטת שחרור כרום רדיואקטיבי, שבה תאי המטרה מסומנים באיזוטופ רדיואקטיבי ⁵¹Cr, ו-ADCC מכומת על ידי מדידת רדיואקטיביות מהסופרנאטנט של תאי המטרה¹¹. בגלל הבעיות הברורות עקב טיפול, אחסון וסילוק מוסדרים בקפידה של תרופות רדיואקטיביות ופסולת, שיטה זו הפכה יותר ויותר לא פופולרית בקרב מדעני החיים. בנוסף, זה לא מקובל על יישומים תפוקה גבוהה גם. מדידת הפעילות של אנזימים (למשל, לקטט-דהידרוגנאז) המשתחררים מתאי המטרה המומתים יכולה לספק חלופה לא רדיואקטיבית לבדיקת ⁵¹Cr¹². עם זאת, בדיקות אלה אינן מצליחות להבחין בין מוות של תאי מטרה למוות של תאי השפעה. חישת עכבה של מצע תא חשמלי (ECIS) הוכחה כמתאימה לכימות ADCC¹³, אך ציוד ECIS אינו זמין ברוב המעבדות, והטכניקה אינה תואמת ליישומים/סינון בעלי תפוקה גבוהה. תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי מייצגים חלופה פופולרית בבדיקות ביולוגיה רבות של התא ומשמשים לעתים קרובות ביישומים מבוססי ציטומטריית זרימה או קורא לוחות^14,15,16. עם זאת, בדיקות אלה מכילות לעתים קרובות שלבי שטיפה או שאינן תואמות בדרך אחרת ליישומים בעלי תפוקה גבוהה (למשל, טכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה). כמה מבחני ציטוטוקסיות פופולריים, אשר בתיאוריה אמורים להתאים לכימות ADCC, אינם מצליחים לקבוע באופן מהימן יעילות ADCC¹³. לאחרונה, עם התפשטות המיקרוסקופ הקונפוקלי הפלואורסצנטי, מבדקים מבוססי תמונה, בעלי תוכן גבוה הופכים פופולריים יותר ויותר בתחומים שונים של מדעי החיים¹⁷. מצד אחד, ציוד הדמיה של תאים נמצא כיום בכל מקום, ומצד שני, ניתן לאסוף פרמטרים מורפולוגיים כמעט אינסופיים מהתמונות שנרכשו. לכן, יצאנו לפתח בדיקת ADCC תואמת סינון בתוכן גבוה ולהדגים את התאמתו לסינון ספריות מורכבות.

כאן, אנו מציגים בדיקת ADCC מבוססת תמונה ומדגימים כיצד ניתן להשתמש בבדיקה זו עבור סינון תוכן גבוה (HCS) לזיהוי תרכובות אפנון ADCC. המודל מבוסס על תאי מטרה של קרצינומה של השד JIMT-1, תאי השפעה CD16.176V.NK-92 ונוגדן חד שבטי אנושי נגד HER2 trastuzumab. בשיטה זו, ניתן לזהות תרופות שיכולות לשפר את פעולת הרג הגידול של תאי NK או לקבל תובנה לגבי המנגנון של ADCC בתיווך תאי NK על ידי זיהוי מולקולות קטנות המפריעות ל- ADCC. אנו מציעים כי מדעני חיים השואפים לכמת ציטוטוקסיות בתיווך תאים תוך התייחסות מיוחדת ל- ADCC עשויים להפיק תועלת משימוש בבדיקה זו למדע התגלית או לפיתוח תרופות. בדיקה זו עשויה להיות חלופה אם למעבדה יש גישה וניסיון כלשהו בהדמיה פלואורסצנטית וניתוח תמונה כמותי.

Protocol

הערה: השלבים העיקריים של זרימת העבודה של הבדיקה מוצגים באיור 2.

איור 2: זרימת עבודה של מסך ADCC. תאי מטרה JIMT-1-EGFP שנזרעו לתוך 96 צלחות HCS באר מטופלים בתרופות של ספריית התרכובת. בתורו, תאי NK (אפקטור) לא מוכתמים ו trastuzumab מתווספים, ואת הצלחת הוא imaged ב 0 נקודת זמן ולאחר 3 שעות של הדגירה. הערכת ADCC מבוססת על השינוי במספר תאי היעד בני קיימא (פני השטח הנצמדים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. ציפוי צלחת HCS

1. יש לצפות את 96 לוחות ההקרנה בעלי התוכן הגבוה (HSC) במדיום JIMT-1 של 50 μL/באר (DMEM/F-12 בינוני בתוספת 20% נסיוב בקר עוברי (FBS), אינסולין 0.3 U/mL (100 IU/mL, Humulin R ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
2. הכניסו את הצלחת לאינקובטור CO₂ למשך שעה אחת.
   הערה: ציפוי חיוני לחיבור תאי JIMT-1 למשטח הזכוכית של הצלחת.

2. זריעה של תאי חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר JIMT-1 (EGFP)

הערה: תאי JIMT-1 המבטאים EGFP נוצרו בעבודתנו הקודמת¹⁸, והתאים גודלו בתרבית צלוחיות תרבית רקמה T25 במדיה JIMT-1 (ראו הרכב בשלב 1.1).

1. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS סטרילי.
2. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוק והחזיר את הבקבוק לאינקובטור CO₂ למשך 10 דקות.
3. לאחר הדגירה, הקש על הבקבוק כדי לבדוק אם תאי JIMT-1 מנותקים.
4. עצור את העיכול עם 2 מ"ל של מדיה JIMT-1 ולאסוף את תרחיף התא לתוך צינור 15 מ"ל.
5. ספור את התאים עם 0.4% טריפאן כחול (80 μL של צבע + 20 μL של תרחיף התא) בתא Bürker ולהתאים את מספר התא ל 133, 000 תאים / מ"ל.
6. שאפו את מצע הציפוי מצלחת הבאר 96 (שלב 1.2).
7. פיפטה 75 μL של תרחיף התא לכל באר של לוחות HCS (ראה טבלת חומרים).
8. אפשר לתאים להיצמד במהלך דגירה של לילה ב 37 ° C באינקובטור CO₂ .

3. טיפול מקדים בתאי JIMT-1 EGFP עם ספריית התרכובות

1. שאפו את התווך מתאי JIMT-1 והוסיפו 50 μL/באר תווך JIMT-1 טרי לבארות. מעבירים את הצלחת למעבדת סינון בתפוקה גבוהה.
   הערה: שימוש ברובוט לטיפול בנוזלים הופך את התוספת של ספריות מורכבות ליעילה יותר וניתנת לשחזור.
2. העבר את תרכובות הבדיקה מלוח ספריית התרכובות ללוח הבדיקה באמצעות כלי סיכה המכויל לנפח של 25 nL. בצע זאת ארבע פעמים. ארבעה סבבי העברה נותנים נפח סופי של 100 nL (וריכוז סופי של 20 מיקרומטר).
3. בין כל שלב, שטפו את כלי הסיכה, תחילה עם 50% DMSO ולאחר מכן עם 70% אתנול.
4. לדגור את הצלחות במשך 1 שעה באינקובטור CO₂ ב 37 ° C.

4. התחלת בדיקת ADCC על ידי הוספת תאי האפקט

הערה: תאי CD16.176V.NK92 (להלן תאי NK92) גודלו בתרבית ב-α-MEM בתוספת 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-פירובט, 1% גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-100 IU/mL IL-2.

1. ספירת תאי NK92 עם כחול טריפאן (80 μL של הצבע + 20 μL של השעיית התא). התאם את מספר התא ל- 400,000 תאים/מ"ל.
2. צנטריפוגה 4 מ"ל של תרחיף התא ב 150 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הכינו את מדיום ADCC על ידי הוספת נוגדן אנטי-HER2 (trastuzumab) של 20 מיקרוגרם/מ"ל למדיום JIMT-1.
4. להשעות מחדש את גלולת תא NK בתווך ADCC 5 מ"ל.
5. פיפטה 20,000 תאי NK ב-50 מיקרוליטר של תווך ADCC לתאי היעד JIMT-1. הנפח הסופי הוא 100 μL, וריכוז trastuzumab הסופי הוא 10 מיקרוגרם / מ"ל.
6. מקם את צלחת הבדיקה לתוך ציוד ניתוח תוכן גבוה עם אינקובטור מובנה להגדיר ב 37 ° C.

5. הדמיה

הערה: יש לצלם את הלוחות בשתי נקודות זמן, הראשונה, מיד לאחר הוספת תאי האפקט לתאי היעד והשנייה, 3 שעות לאחר הוספת תאי NK. להדמיה, ניתן להשתמש במנתח התוכן הגבוה ובתוכנה שלו או בחלופות מתאימות (ראה טבלת חומרים).

1. בחר סוג צלחת (96-well cell carrier ultra) מרשימת הלוחות.
2. בחר את שני המיקוד האוטומטי של שני שיאים אם הבדיקה מתבצעת בלוחות.
3. השתמש במטרה 10x במצב לא קונפוקלי.
4. בחר Binning 2 כדי להכפיל את יחס האות לרעש.
5. צלם תמונות שדה בהיר ב- 650-760 ננומטר ותמונות פלואורסצנטיות של תאי JIMT-1 המומרים על ידי EGFP באורכי גל של 488 ננומטר (עירור) ו- 500-550 ננומטר (פליטה).
6. בחר את מספר השדות ואת מספר נקודות הזמן עבור ההדמיה.

6. ניתוח תמונות

הערה: כדי לנתח את יעילות ADCC, תאי JIMT-1 בני קיימא נספרים. תאי מטרה שנהרגים על ידי ADCC מתנתקים מפני השטח ומתרחקים ממישור המוקד של המיקרוסקופ. לכן, ההבדל בין מספר התאים בני קיימא בתחילת ובסוף תגובת ADCC מתאים לתאי מטרה שסולקו על ידי ADCC. כדי להראות כיצד לבנות את רצף ההערכה, באר ADCC בקרה מוצגת בסרטון.

1. השתמש במודול חיפוש תאים כדי לזהות אזורים בתמונה המתאימים לתאים.
   הערה: כל תא מזוהה כאזור בתמונה בעל עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר מסביבתו.
2. בחר תאים באמצעות אלגוריתם M המובנה בקוטר מינימלי של 80 מיקרומטר.
3. הגדר רגישות פיצול, המחלקת אובייקט גדול לאובייקטים קטנים יותר, ל- 0.5.
4. קבעו את הסף 'משותף ' (הרמה הנמוכה ביותר של עוצמת פיקסלים) על 0.
5. אל תכלול זיהוי של אזור רקע עם עוצמה פלואורסצנטית גבוהה של EGFP בשני שלבים.
   1. תחילה, השתמש בפונקציה Calculate Intensity Properties כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות של EGFP באזור התאים שנבחר קודם לכן.
   2. הגדר את סף העוצמה המינימלי והמרבי באמצעות האפשרות בחר אוכלוסייה .

תוצאות

כדי להדגים כיצד הבדיקה פועלת בחיים האמיתיים, יצרנו ספריית בדיקות של 16 תרכובות שנבחרו באופן אקראי ממדפי המעבדה (איור 3). בנוסף, DMSO נכלל גם כבקרה שלילית, ושלוש תרכובות מעכבות פילמור מיקרוטובול (קולכיצין, וינכריסטין ופודופילוטוקסין) כבקרות חיוביות. אלה האחרונים היו צפויים לעכ?...

Discussion

תגובת ADCC תוארה לפני זמן רב יחסית. אירועים מולקולריים מרכזיים של התהליך תוארו גם הם¹⁹. השיטות למדידת ADCC נעות בין בדיקת שחרור כרום רדיואקטיבי בתקן הזהב, מבחני שחרור אנזימים ציטופלזמיים למספר ציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנטיות או מבחני מיקרו-לוחות²⁰. עם זאת, מגבלה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Applichem	A7686	in compound library
96-well Cell Carrier Ultra plate	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	in compound library
CD16.176V.NK92 cells	Nankwest Inc.
Cerulenin	ChemCruz	sc-396822	in compound library
Cisplatin	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	in compound library
Colchicine	Sigma	C9754	in compound library
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	in compound library
Dexamethasone	Sigma	D4902	in compound library
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	in compound library
Etoposide	Sigma	E1383	E1383
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP and NK medium
Fisetin	Sigma	F4043	in compound library
Freedom EVO liquid handling robot	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	16201	in compound library
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
Harmony software	PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary	N/A
Humulin R (insulin)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP medium
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	in NK medium
Isatin	Sigma	114618	in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Naringenin	Sigma	N5893	in compound library
NQDI-1	Sigma	SML0185	in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer
Penicillin–streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP and NK medium
Pentoxyfilline	Sigma	P1784	in compound library
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-517Q	to wash the cells
Podophyllotoxin	Sigma	P4405	in compound library
Quercetin	Sigma	Q4951	in compound library
Tannic acid	Sigma	T8406	in compound library
Temozolomide	Sigma	T2577	in compound library
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Vincristine sulfate	Sigma	V0400000	in compound library
α-MEM	Sigma	M8042	in NK medium