用于鉴定抗体依赖性细胞毒性修饰化合物的高内涵筛选检测

摘要

该协议提供了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2 抗体的情况下鉴定调节自然杀伤细胞介导的乳腺癌细胞杀伤的化合物。

摘要

使用抗原特异性抗体或免疫检查点抑制剂的免疫疗法彻底改变了乳腺癌的治疗。表达表皮生长因子受体HER2的乳腺癌细胞可以被抗HER-2抗体曲妥珠单抗靶向。抗体依赖性细胞毒性（ADCC）是HER-2抗肿瘤作用的重要机制。与癌细胞结合的曲妥珠单抗可以被ADCC效应细胞（例如自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和粒细胞）的Fc受体识别，触发这些免疫细胞的细胞毒性活性，导致癌细胞死亡。我们着手开发一种用于定量ADCC的基于图像的检测方法，以通过高内涵筛选鉴定新型ADCC调节剂化合物。在该测定中，HER2过表达JIMT-1乳腺癌细胞在曲妥珠单抗存在下与NK-92细胞共培养，并通过自动显微镜和定量图像分析量化靶细胞死亡。根据其EGFP荧光将靶细胞与效应细胞区分开来。我们展示了如何在测定中测试化合物库以鉴定ADCC调节剂药物。为此，使用实验室货架上随机选择的精细化学品建立了一个化合物库测试板。测试库中还包括三种有望干扰NK细胞迁移和脱颗粒的微管不稳定化合物（秋水仙碱，长春新碱，鬼臼毒素）。测试筛选将所有三种阳性对照化合物鉴定为命中，证明该方法适用于鉴定化学库中的ADCC修饰药物。通过该测定，可以进行化合物库筛选以鉴定ADCC增强化合物，这些化合物可用作治疗接受抗癌免疫治疗的患者的辅助治疗剂。此外，该方法还可用于鉴定癌症患者针对不同适应症服用的治疗药物的任何不良ADCC抑制副作用。

引言

使用抗癌抗体、免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体表达 T （CAR-T） 细胞进行免疫治疗是癌症治疗的有力方法¹，^2，3。曲妥珠单抗是一种人源化单克隆抗HER-2（人表皮生长因子受体2）抗体，用于治疗HER-2阳性早期或转移性乳腺癌，以及HER-2阳性转移性胃癌⁴，^5，6。它主要通过抑制表皮生长因子⁴的增殖刺激作用起作用。然而，据报道，曲妥珠单抗有效地触发癌细胞死亡，即使癌细胞已经失去了对 HER-2 刺激的反应性⁷。抗体的这种矛盾效应是由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）⁷。ADCC 可由自然杀伤 （NK） 细胞、粒细胞和巨噬细胞介导，统称为 ADCC^8，9 的效应细胞。如果抗体（如曲妥珠单抗）与肿瘤细胞结合，则这些效应细胞使用其Fc受体结合抗体的恒定（Fc）区域。抗体桥接肿瘤细胞和携带Fc受体的效应细胞，触发其细胞毒性介质的释放¹⁰。自然杀伤细胞释放其含有穿孔素的颗粒的细胞毒性货物，以在靶细胞膜和颗粒酶（触发细胞死亡信号通路）中产生孔隙进入免疫突触，导致癌细胞凋亡（见图1）。

图 1:ADCC 中的效应子和靶细胞相互作用。 效应NK细胞的细胞表面Fcγ受体识别抗HER2曲妥珠单抗抗体的Fc区域，特异性于肿瘤细胞表面表达的HER2分子。因此，在两个细胞之间建立所谓的免疫突触，诱导效应细胞的细胞毒性颗粒的定向胞吐作用。释放的穿孔素和颗粒酶分子最终导致靶细胞凋亡。 请点击此处查看此图的大图。

以前已经开发了几种用于量化细胞毒性的测定方法，包括ADCC。金标准是放射性铬释放法，其中靶细胞用放射性⁵¹Cr同位素标记，并通过测量裂解靶细胞上清液的放射性来量化ADCC¹¹。由于放射性药物和废物的处理、储存和处置受到严格管制，存在明显问题，这种方法在生命科学家中越来越不受欢迎。此外，它也不适合高吞吐量应用程序。测量从杀死的靶细胞释放的酶（例如乳酸脱氢酶）的活性可以提供⁵¹Cr测定的非放射性替代方案¹²。然而，这些测定无法区分靶细胞和效应细胞死亡。电电池-衬底阻抗检测（ECIS）被证明适用于ADCC¹³的定量，但大多数实验室都没有ECIS设备，并且该技术与高通量应用/筛选不兼容。荧光标记的细胞是许多细胞生物学测定中流行的替代方案，通常用于流式细胞术或基于酶标仪的应用¹⁴，^15，16。然而，这些测定通常包含洗涤步骤或与高通量应用（例如，基于流式细胞术的技术）不兼容。一些流行的细胞毒性测定，理论上应该适用于ADCC定量，但无法可靠地确定ADCC效率¹³。最近，随着荧光共聚焦显微镜的普及，基于图像的高内涵检测在生命科学的各个领域越来越受欢迎¹⁷。一方面，细胞成像设备现在相当普遍，而另一方面，可以从采集的图像中收集几乎无穷无尽的形态参数。因此，我们着手开发一种高内涵筛选兼容的ADCC检测方法，并证明其适用于化合物文库筛选。

在这里，我们提出了一种基于图像的ADCC测定，并演示了该测定如何用于高内涵筛选（HCS）以鉴定ADCC调节化合物。该模型基于JIMT-1乳腺癌靶细胞、CD16.176V.NK-92效应细胞和人源化单克隆抗HER2抗体曲妥珠单抗。使用这种方法，可以通过识别干扰ADCC的小分子来鉴定可以增强NK细胞肿瘤杀伤作用的药物或深入了解NK细胞介导的ADCC的机制。我们建议，旨在量化细胞介导的细胞毒性的生命科学家，特别是ADCC，可能会从将该测定用于发现科学或药物开发中受益。如果实验室能够获得荧光成像和定量图像分析方面的一些经验，则该测定可能是一种替代方法。

研究方案

注意:检测工作流程的关键步骤如图 2所示。

图 2:ADCC 屏幕的工作流程。 接种到96孔HCS板中的JIMT-1-EGFP靶细胞用化合物库的药物处理。反过来，加入未染色的NK（效应）细胞和曲妥珠单抗，并在0时间点和孵育3小时后对板进行成像。ADCC评估基于活（表面贴壁）靶细胞数量的变化。 请点击此处查看此图的大图。

1. HCS板的涂层

1. 用 50 μL/孔 JIMT-1 培养基（补充有 20% 胎牛血清 （FBS）、0.3 U/mL 胰岛素（100 IU/mL、Humulin R 和 1% 青霉素-链霉素）的 DMEM/F-12 培养基）涂覆 96 孔高内涵筛选 （HSC） 板。
2. 将板放入CO₂ 培养箱中1小时。
   注意:涂层对于将JIMT-1电池附着到板的玻璃表面上至关重要。

2. 接种JIMT-1增强型绿色荧光蛋白（EGFP）细胞

注意:表达EGFP的JIMT-1细胞在我们之前的工作¹⁸中产生，并将细胞培养在JIMT-1培养基中的T25组织培养瓶中培养（参见步骤1.1中的组合物）。

1. 用 2 mL 无菌 PBS 洗涤细胞。
2. 向烧瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA，并将烧瓶放回 CO₂ 培养箱中 10 分钟。
3. 孵育后，点击烧瓶以检查JIMT-1细胞是否分离。
4. 用 2 mL JIMT-1 培养基停止消化，并将细胞悬液收集到 15 mL 管中。
5. 在 Bürker 腔室中用 0.4% 台盼蓝（80 μL 染料 + 20 μL 细胞悬液）计数细胞，并将细胞数调整为 133， 000 个细胞/mL。
6. 从96孔板中吸出包衣介质（步骤1.2）。
7. 将75μL细胞悬液移液到HCS板的每个孔中（参见 材料表）。
8. 允许细胞在CO₂ 培养箱中于37°C孵育过夜期间附着。

3. 用化合物文库预处理JIMT-1 EGFP细胞

1. 从 JIMT-1 细胞中吸出培养基，并向孔中加入 50 μL/孔新鲜的 JIMT-1 培养基。将板转移到高通量筛选实验室。
   注意:使用液体处理机器人可以更高效、更可重复地添加化合物库。
2. 使用校准为25 nL体积的销工具将测试化合物从化合物库板转移到测定板。执行此操作四次。四轮转印的最终体积为100 nL（最终浓度为20 μM）。
3. 在每个步骤之间，首先用50%DMSO清洗销钉工具，然后用70%乙醇清洗。
4. 将板在37°C的CO₂ 培养箱中孵育1小时。

4.通过添加效应细胞开始ADCC测定

注意:CD16.176V.NK92细胞（以下简称NK92细胞）在补充有20%FBS，1%MEM-NEAA，1%丙酮酸钠，1%谷氨酰胺，1%青霉素链霉素和100 IU / mL IL-2的α-MEM中培养。

1. 用台盼蓝（80 μL 染料 + 20 μL 细胞悬液）计数 NK92 细胞。将细胞数调整为 400，000 个细胞/mL。
2. 在室温下以150 x g 离心4mL细胞悬液3分钟。
3. 通过在 JIMT-1 培养基中加入 20 μg/mL 抗 HER2 抗体（曲妥珠单抗）来制备 ADCC 培养基。
4. 将NK细胞沉淀重悬于5 mL ADCC培养基中。
5. 将 20，000 个 NK 细胞在 50 μL ADCC 培养基中移液至目标 JIMT-1 细胞中。最终体积为 100 μL，最终曲妥珠单抗浓度为 10 μg/mL。
6. 将测定板放入具有设置为37°C的内置培养箱的高内涵分析设备中。

5. 成像

注意:板应在两个时间点成像，首先，在将效应细胞添加到目标细胞后立即成像，其次，在添加NK细胞后3小时。对于成像，可以使用高内涵分析仪及其软件或合适的替代品（见 材料表）。

1. 从板列表中选择板类型（96孔细胞载体超）。
2. 如果测定是在平板中进行的，请选择 双峰自动聚焦 。
3. 在非共聚焦模式下使用10倍物镜。
4. 选择合并 2 可将信噪比加倍。
5. 在 650-760 nm 处拍摄明场图像，并在 488 nm（激发）和 500-550 nm（发射）波长下拍摄 EGFP 转导的 JIMT-1 细胞的荧光图像。
6. 选择映像的字段数和时间点数。

6. 图像分析

注意:为了分析ADCC效率，对活的JIMT-1细胞进行计数。被ADCC杀死的靶细胞从表面分离并远离显微镜的焦平面。因此，ADCC反应开始和结束时活细胞数之间的差异对应于ADCC消除的靶细胞。为了展示如何建立评估序列，视频中展示了一个对照ADCC孔。

1. 使用 "查找 单元格"模块检测图像上与单元格对应的区域。
   注意:每个细胞被检测为图像上荧光强度高于其周围环境的区域。
2. 使用内置 M 算法选择直径最小为80μm的细胞。
3. 将 拆分敏感度（将大型对象划分为较小对象）设置为 0.5。
4. 将 "公共阈值 "（像素强度的最低级别）设置为 0。
5. 分两步排除具有高EGFP荧光强度的背景区域的检测。
   1. 首先，使用" 计算强度属性 "功能确定先前选择的 "细胞 "区域中的EGFP荧光强度。
   2. 使用 选择总体 选项设置最小和最大强度阈值。

结果

为了演示该测定在现实生活中的工作原理，我们创建了一个测试库，其中包含从实验室货架中随机选择的16种化合物（图3）。此外，DMSO也作为阴性对照，三种微管聚合抑制剂化合物（秋水仙碱，长春新碱和鬼臼毒素）作为阳性对照。后者有望通过干扰NK细胞向癌细胞的迁移和NK细胞脱颗粒来抑制ADCC。将所有测试化合物和DMSO一式四份放置在测试文库板上，并将DMSO也添加到板?...

讨论

ADCC反应在很久以前就已经描述过了。该过程的关键分子事件也已描述¹⁹。测量ADCC的方法范围从金标准放射性铬释放测定，细胞质酶释放测定到几种基于荧光的流式细胞术或微孔板测定²⁰。然而，这些测定的一个常见局限性是它们不适合高通量应用。此前，我们开发了一种基于图像的HCS测定法，适用于筛选ADCC修饰药物的化合物库¹⁸。然而，先前?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Applichem	A7686	in compound library
96-well Cell Carrier Ultra plate	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	in compound library
CD16.176V.NK92 cells	Nankwest Inc.
Cerulenin	ChemCruz	sc-396822	in compound library
Cisplatin	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	in compound library
Colchicine	Sigma	C9754	in compound library
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	in compound library
Dexamethasone	Sigma	D4902	in compound library
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	in compound library
Etoposide	Sigma	E1383	E1383
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP and NK medium
Fisetin	Sigma	F4043	in compound library
Freedom EVO liquid handling robot	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	16201	in compound library
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
Harmony software	PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary	N/A
Humulin R (insulin)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP medium
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	in NK medium
Isatin	Sigma	114618	in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Naringenin	Sigma	N5893	in compound library
NQDI-1	Sigma	SML0185	in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer
Penicillin–streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP and NK medium
Pentoxyfilline	Sigma	P1784	in compound library
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-517Q	to wash the cells
Podophyllotoxin	Sigma	P4405	in compound library
Quercetin	Sigma	Q4951	in compound library
Tannic acid	Sigma	T8406	in compound library
Temozolomide	Sigma	T2577	in compound library
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Vincristine sulfate	Sigma	V0400000	in compound library
α-MEM	Sigma	M8042	in NK medium