High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

Zusammenfassung

Die Immuntherapie mit antigenspezifischen Antikörpern oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren hat die Therapie von Brustkrebs revolutioniert. Brustkrebszellen, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor HER2 exprimieren, können mit dem Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab angegriffen werden. Die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ist ein wichtiger Mechanismus, der an der Antitumorwirkung von HER2 beteiligt ist. Trastuzumab, das an Krebszellen gebunden ist, kann von den Fc-Rezeptoren von ADCC-Effektorzellen (z. B. natürlichen Killerzellen, Makrophagen und Granulozyten) erkannt werden, wodurch die zytotoxische Aktivität dieser Immunzellen ausgelöst wird, die zum Tod von Krebszellen führt. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, einen bildbasierten Assay für die Quantifizierung von ADCC zu entwickeln, um neuartige ADCC-Modulatorverbindungen durch High-Content-Screening zu identifizieren. In dem Assay werden HER2-überexprimierende JIMT-1-Brustkrebszellen mit NK-92-Zellen in Gegenwart von Trastuzumab kokultiviert, und der Zielzelltod wird durch automatisierte Mikroskopie und quantitative Bildanalyse quantifiziert. Zielzellen werden anhand ihrer EGFP-Fluoreszenz von Effektorzellen unterschieden. Wir zeigen, wie Substanzbibliotheken im Assay getestet werden können, um ADCC-Modulatoren zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Compound-Library-Testplatte mit zufällig ausgewählten Feinchemikalien aus dem Laborregal aufgebaut. Drei Mikrotubuli-destabilisierende Verbindungen (Colchicin, Vincristin, Podophyllotoxin), von denen angenommen wird, dass sie die Migration und Degranulation von NK-Zellen stören, wurden ebenfalls in die Testbibliothek aufgenommen. Das Testscreening identifizierte alle drei Positivkontrollverbindungen als Treffer, was die Eignung der Methode zur Identifizierung von ADCC-modifizierenden Medikamenten in einer chemischen Bibliothek belegt. Mit diesem Assay können Substanzbibliotheks-Screenings durchgeführt werden, um ADCC-verstärkende Verbindungen zu identifizieren, die als adjuvante Therapeutika für die Behandlung von Patienten verwendet werden könnten, die Krebsimmuntherapien erhalten. Darüber hinaus können mit der Methode auch unerwünschte ADCC-hemmende Nebenwirkungen von Therapeutika identifiziert werden, die von Krebspatienten für verschiedene Indikationen eingenommen werden.

Einleitung

Die Immuntherapie mit Antikrebsantikörpern, Immun-Checkpoint-Inhibitoren oder chimären Antigenrezeptor-exprimierenden T (CAR-T)-Zellen stellt einen wirksamen Ansatz zur Krebsbehandlung dar ^1,2,3. Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Anti-HER2-Antikörper (humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2), der zur Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs im Frühstadium oder metastasierendem Brustkrebs sowie HER2-positivem metastasierendem Magenkrebs eingesetzt wird ^4,5,6. Es wirkt in erster Linie, indem es die proliferationsstimulierende Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors⁴ hemmt. Es wurde jedoch berichtet, dass Trastuzumab den Tod von Krebszellen effizient auslöst, selbst wenn die Krebszellen nicht mehr auf die HER2-Stimulation ansprechen^7. Diese paradoxe Wirkung des Antikörpers ist auf die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC⁾ zurückzuführen7. ADCC kann durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Granulozyten und Makrophagen vermittelt werden, die zusammen als Effektorzellen von ADCC ^8,9 bekannt sind. Bindet ein Antikörper wie Trastuzumab an Tumorzellen, dann binden diese Effektorzellen über ihre Fc-Rezeptoren an die konstante (Fc) Region des Antikörpers. Der Antikörper überbrückt die Tumorzellen und die Fc-Rezeptor-tragenden Effektorzellen und löst die Freisetzung ihrer zytotoxischen Mediatoren^{aus 10}. Natürliche Killerzellen setzen die zytotoxische Fracht ihrer perforinhaltigen Granula frei, um Poren in der Zielzellmembran und Granzym (das Signalwege für den Zelltod auslöst) in die Immunsynapse zu erzeugen, was zur Apoptose der Krebszellen führt (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1: Effektor- und Zielzellinteraktionen im ADCC. Der Fcγ-Rezeptor der Effektor-NK-Zelle auf der Zelloberfläche erkennt die Fc-Region des Anti-HER2-Trastuzumab-Antikörpers, der spezifisch für das auf der Oberfläche der Tumorzelle exprimierte HER2-Molekül ist. So entsteht zwischen den beiden Zellen die sogenannte immunologische Synapse, die die gerichtete Exozytose zytotoxischer Granula der Effektorzelle induziert. Die freigesetzten Perforin- und Granzym-Moleküle führen schließlich zur Apoptose der Zielzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zur Quantifizierung der Zytotoxizität wurden bereits mehrere Assays entwickelt, darunter ADCC. Der Goldstandard ist die Methode zur Freisetzung von radioaktivem Chrom, bei der die Zielzellen mit radioaktivem ⁵¹Cr-Isotop markiert werden und ADCC durch Messung der Radioaktivität aus dem Überstand lysierter Zielzellen^{quantifiziert wird 11}. Aufgrund der offensichtlichen Probleme, die sich aus der streng reglementierten Handhabung, Lagerung und Entsorgung von radioaktiven Pharmakonen und Abfällen ergeben, ist diese Methode unter Biowissenschaftlern zunehmend unbeliebt geworden. Darüber hinaus ist es auch nicht für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet. Die Messung der Aktivität von Enzymen (z. B. Laktat-Dehydrogenase), die aus den abgetöteten Zielzellen freigesetzt werden, kann eine nicht-radioaktive Alternative zum 51-Cr-Assay^{darstellen 12}. Diese Assays unterscheiden jedoch nicht zwischen Ziel- und Effektorzelltod. Die elektrische Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS) erwies sich als geeignet für die Quantifizierung von ADCC¹³, aber die ECIS-Geräte sind in den meisten Labors nicht verfügbar, und die Technik ist nicht mit Hochdurchsatzanwendungen/Screening kompatibel. Fluoreszenzmarkierte Zellen stellen eine beliebte Alternative in vielen zellbiologischen Assays dar und werden häufig in der Durchflusszytometrie oder in Plate-Reader-basierten Anwendungen verwendet^14,15,16. Diese Assays enthalten jedoch häufig Waschschritte oder sind anderweitig nicht mit Hochdurchsatzanwendungen (z. B. Durchflusszytometrie-basierte Techniken) kompatibel. Einige gängige Zytotoxizitätsassays, die theoretisch für die ADCC-Quantifizierung geeignet sein sollten, sind nicht in der Lage, die ADCC-Effizienz zuverlässig zu bestimmen¹³. In jüngster Zeit werden mit der Verbreitung der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bildbasierte High-Content-Assays in verschiedenen Bereichen der Biowissenschaften immer beliebter¹⁷. Auf der einen Seite sind Zellbildgebungsgeräte mittlerweile ziemlich allgegenwärtig, auf der anderen Seite lassen sich aus den aufgenommenen Bildern praktisch unendlich viele morphologische Parameter ableiten. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, einen High-Content-Screening-kompatiblen ADCC-Assay zu entwickeln und seine Eignung für das Screening von Substanzbibliotheken zu demonstrieren.

Hier stellen wir einen bildbasierten ADCC-Assay vor und zeigen, wie dieser Assay für das High-Content-Screening (HCS) verwendet werden kann, um ADCC-modulierende Verbindungen zu identifizieren. Das Modell basiert auf JIMT-1 Mammakarzinom-Zielzellen, CD16.176V.NK-92 Effektorzellen und dem humanisierten monoklonalen Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab. Mit dieser Methode ist es möglich, Medikamente zu identifizieren, die die tumorabtötende Wirkung von NK-Zellen verstärken können, oder Einblicke in den Mechanismus der NZ-Zell-vermittelten ADCC zu gewinnen, indem kleine Moleküle identifiziert werden, die die ADCC stören. Wir schlagen vor, dass Biowissenschaftler, die die zellvermittelte Zytotoxizität unter besonderer Berücksichtigung von ADCC quantifizieren wollen, von der Verwendung dieses Assays entweder für die Entdeckungswissenschaft oder die Arzneimittelentwicklung profitieren könnten. Dieser Assay kann eine Alternative sein, wenn ein Labor Zugang zu und Erfahrung in der Fluoreszenzbildgebung und quantitativen Bildanalyse hat.

Protokoll

HINWEIS: Die wichtigsten Schritte des Assay-Workflows sind in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: Workflow des ADCC-Bildschirms. JIMT-1-EGFP-Zielzellen, die in 96 Well-HCS-Platten ausgesät wurden, werden mit Medikamenten aus der Substanzbibliothek behandelt. Im Gegenzug werden ungefärbte NK-Zellen (Effektorzellen) und Trastuzumab hinzugefügt, und die Platte wird zum Zeitpunkt 0 und nach 3 Stunden Inkubation abgebildet. Die ADCC-Bewertung basiert auf der Veränderung der Anzahl der lebensfähigen (oberflächenadhärenten) Zielzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Beschichtung der HCS-Platte

1. Beschichten Sie die 96-Well-High-Content-Screening-Platten (HSC) mit 50 μl/well JIMT-1-Medium (DMEM/F-12-Medium, ergänzt mit 20 % fetalem Kälberserum (FBS), 0,3 U/ml Insulin (100 I.E./ml, Humulin R und 1 % Penicillin-Streptomycin).
2. Stellen Sie die Platte für 1 h in einen CO_{2 -} Inkubator.
   Anmerkungen: Die Beschichtung ist entscheidend für die Befestigung von JIMT-1-Zellen an der Glasoberfläche der Platte.

2. Aussaat von JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) Zellen

ANMERKUNG: EGFP-exprimierende JIMT-1-Zellen wurden in unserer früheren Arbeit¹⁸ erzeugt, und die Zellen wurden in T25-Gewebekulturflaschen in JIMT-1-Medien kultiviert (siehe Zusammensetzung in Schritt 1.1).

1. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml sterilem PBS.
2. Geben Sie 1 ml Trypsin-EDTA in den Kolben und stellen Sie den Kolben wieder für 10 Minuten in einen CO₂ -Inkubator.
3. Klopfen Sie nach der Inkubation auf den Kolben, um zu prüfen, ob sich JIMT-1-Zellen abgelöst haben.
4. Stoppen Sie den Aufschluss mit 2 ml JIMT-1-Medien und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen.
5. Zählen Sie die Zellen mit 0,4% Trypanblau (80 μL des Farbstoffs + 20 μL der Zellsuspension) in einer Bürker-Kammer und stellen Sie die Zellzahl auf 133.000 Zellen/ml ein.
6. Saugen Sie das Beschichtungsmedium von der 96-Well-Platte ab (Schritt 1.2).
7. Pipettieren Sie 75 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung der HCS-Platten (siehe Materialtabelle).
8. Lassen Sie die Zellen während einer nächtlichen Inkubation bei 37 °C in einem CO_{2 -} Inkubator anhaften.

3. Vorbehandlung von JIMT-1 EGFP-Zellen mit der Substanzbibliothek

1. Aspirieren Sie das Medium aus den JIMT-1-Zellen und geben Sie 50 μl frisches JIMT-1-Medium in die Wells. Übergeben Sie die Platte an das Hochdurchsatz-Screening-Labor.
   HINWEIS: Die Verwendung eines Liquid-Handling-Roboters macht das Hinzufügen von Compound-Bibliotheken effizienter und reproduzierbarer.
2. Übertragen Sie die Testverbindungen mit einem auf ein Volumen von 25 nL kalibrierten Stiftwerkzeug von der Platte der Substanzbibliothek auf die Assay-Platte. Führen Sie dies viermal durch. Vier Transferrunden ergeben ein Endvolumen von 100 nL (und eine Endkonzentration von 20 μM).
3. Waschen Sie das Stiftwerkzeug zwischen jedem Schritt zuerst mit 50 % DMSO und dann mit 70 % Ethanol.
4. Inkubieren Sie die Platten für 1 h in einem CO_{2 -} Inkubator bei 37 °C.

4. Starten des ADCC-Assays durch Hinzufügen der Effektorzellen

ANMERKUNG: CD16.176V.NK92-Zellen (im Folgenden als NK92-Zellen bezeichnet) wurden in α-MEM kultiviert, das mit 20 % FBS, 1 % MEM-NEAA, 1 % Na-Pyruvat, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 100 IU/ml IL-2 ergänzt wurde.

1. Zählen Sie NK92-Zellen mit Trypanblau (80 μl des Farbstoffs + 20 μl der Zellsuspension). Stellen Sie die Zellzahl auf 400.000 Zellen/ml ein.
2. Zentrifugieren Sie 4 ml der Zellsuspension bei 150 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie das ADCC-Medium vor, indem Sie dem JIMT-1-Medium 20 μg/ml Anti-HER2-Antikörper (Trastuzumab) hinzufügen.
4. Resuspendieren Sie das NK-Zellpellet in 5 ml ADCC-Medium.
5. Pipettieren Sie 20.000 NK-Zellen in 50 μl ADCC-Medium auf die JIMT-1-Zielzellen. Das Endvolumen beträgt 100 μl und die endgültige Trastuzumab-Konzentration 10 μg/ml.
6. Setzen Sie die Testplatte in das High-Content-Analysegerät mit integriertem Inkubator ein, das auf 37 °C eingestellt ist.

5. Bildgebung

HINWEIS: Die Platten sollten zu zwei Zeitpunkten abgebildet werden, erstens unmittelbar nach der Zugabe der Effektorzellen zu den Zielzellen und zweitens 3 h nach der Zugabe von NK-Zellen. Für die Bildgebung können der High-Content-Analyzer und seine Software oder geeignete Alternativen verwendet werden (siehe Materialtabelle).

1. Wählen Sie Plattentyp (96-Well-Zellträger ultra) aus der Liste der Platten aus.
2. Wählen Sie den Zwei-Peak-Autofokus , wenn der Assay in Platten durchgeführt wird.
3. Verwenden Sie ein 10-fach-Objektiv im nicht-konfokalen Modus.
4. Wählen Sie Binning 2 , um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verdoppeln.
5. Nehmen Sie Hellfeldbilder bei 650-760 nm und Fluoreszenzbilder der EGFP-transduzierten JIMT-1-Zellen bei 488 nm (Anregung) und 500-550 nm (Emission) Wellenlängen auf.
6. Wählen Sie die Anzahl der Felder und die Anzahl der Zeitpunkte für das Imaging aus.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Um die ADCC-Effizienz zu analysieren, werden die lebensfähigen JIMT-1-Zellen gezählt. Zielzellen, die durch ADCC abgetötet werden, lösen sich von der Oberfläche und bewegen sich von der Fokusebene des Mikroskops weg. Daher entspricht die Differenz zwischen der Anzahl der lebensfähigen Zellen zu Beginn und am Ende der ADCC-Reaktion den Zielzellen, die durch ADCC eliminiert werden. Um zu zeigen, wie die Auswertesequenz aufgebaut wird, wird im Video ein Kontroll-ADCC-Bohrloch gezeigt.

1. Verwenden Sie das Modul Zellen suchen , um Bereiche im Bild zu erkennen, die Zellen entsprechen.
   HINWEIS: Jede Zelle wird als ein Bereich auf dem Bild mit einer höheren Fluoreszenzintensität als ihre Umgebung erkannt.
2. Wählen Sie Zellen mit dem integrierten M-Algorithmus mit einem Durchmesser von mindestens 80 μm aus.
3. Legen Sie die Aufteilungsempfindlichkeit, mit der ein großes Objekt in kleinere Objekte aufgeteilt wird, auf 0,5 fest.
4. Legen Sie den allgemeinen Schwellenwert (die niedrigste Stufe der Pixelintensität) auf 0 fest.
5. Schließen Sie die Detektion von Hintergrundflächen mit hoher EGFP-Fluoreszenzintensität in zwei Schritten aus.
   1. Verwenden Sie zunächst die Funktion Intensitätseigenschaften berechnen , um die EGFP-Fluoreszenzintensität im zuvor ausgewählten Zellbereich zu bestimmen.
   2. Legen Sie den minimalen und maximalen Intensitätsschwellenwert mit der Option Population auswählen fest.

Ergebnisse

Um zu demonstrieren, wie der Assay in der Praxis funktioniert, haben wir eine Testbibliothek mit 16 Verbindungen erstellt, die nach dem Zufallsprinzip aus den Laborregalen ausgewählt wurden (Abbildung 3). Darüber hinaus wurde DMSO als Negativkontrolle und drei Mikrotubuli-Polymerisationshemmerverbindungen (Colchicin, Vincristin und Podophyllotoxin) als Positivkontrollen eingeschlossen. Letztere sollten ADCC hemmen, indem sie die Migration von NK-Zellen zu den Krebszellen und die Degranulat...

Diskussion

Die ADCC-Reaktion wurde schon vor relativ langer Zeit beschrieben. Wichtige molekulare Ereignisse des Prozesses wurden ebenfalls beschrieben¹⁹. Die Methoden zur Messung der ADCC reichen vom Goldstandard für den Assay zur Freisetzung von radioaktivem Chrom über zytoplasmatische Enzymfreisetzungsassays bis hin zu verschiedenen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie- oder Mikrotiterplatten-Assays²⁰. Eine häufige Einschränkung dieser Assays besteht jedoch darin, dass sie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Applichem	A7686	in compound library
96-well Cell Carrier Ultra plate	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	in compound library
CD16.176V.NK92 cells	Nankwest Inc.
Cerulenin	ChemCruz	sc-396822	in compound library
Cisplatin	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	in compound library
Colchicine	Sigma	C9754	in compound library
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	in compound library
Dexamethasone	Sigma	D4902	in compound library
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	in compound library
Etoposide	Sigma	E1383	E1383
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP and NK medium
Fisetin	Sigma	F4043	in compound library
Freedom EVO liquid handling robot	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	16201	in compound library
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
Harmony software	PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary	N/A
Humulin R (insulin)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP medium
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	in NK medium
Isatin	Sigma	114618	in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Naringenin	Sigma	N5893	in compound library
NQDI-1	Sigma	SML0185	in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer
Penicillin–streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP and NK medium
Pentoxyfilline	Sigma	P1784	in compound library
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-517Q	to wash the cells
Podophyllotoxin	Sigma	P4405	in compound library
Quercetin	Sigma	Q4951	in compound library
Tannic acid	Sigma	T8406	in compound library
Temozolomide	Sigma	T2577	in compound library
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Vincristine sulfate	Sigma	V0400000	in compound library
α-MEM	Sigma	M8042	in NK medium