Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

Resumo

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Resumo

A imunoterapia com anticorpos antígeno-específicos ou inibidores de checkpoints imunológicos revolucionou a terapia do câncer de mama. Células de câncer de mama que expressam o receptor HER2 do fator de crescimento epidérmico podem ser alvo do anticorpo anti-HER-2 trastuzumabe. A citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) é um importante mecanismo implicado na ação antitumoral do HER-2. O trastuzumabe ligado às células cancerosas pode ser reconhecido pelos receptores Fc das células efetoras do ADCC (por exemplo, células natural killer (NK), macrófagos e granulócitos), desencadeando a atividade citotóxica dessas células imunes levando à morte das células cancerígenas. Nós nos propusemos a desenvolver um ensaio baseado em imagem para a quantificação de ADCC para identificar novos compostos moduladores do ADCC por triagem de alto conteúdo. No ensaio, células de câncer de mama JIMT-1 superexpressando HER2 são co-cultivadas com células NK-92 na presença de trastuzumabe, e a morte da célula-alvo é quantificada por microscopia automatizada e análise quantitativa de imagens. As células-alvo distinguem-se das células efetoras com base em sua fluorescência EGFP. Mostramos como bibliotecas de compostos podem ser testadas no ensaio para identificar drogas moduladoras do ADCC. Para este propósito, uma placa de teste de biblioteca de compostos foi montada usando produtos químicos finos selecionados aleatoriamente fora da prateleira do laboratório. Três compostos desestabilizadores de microtúbulos (colchicina, vincristina, podofilotoxina) que devem interferir na migração e degranulação das células NK também foram incluídos na biblioteca de testes. A tela de teste identificou todos os três compostos de controle positivo como acertos que comprovam a adequação do método para identificar drogas modificadoras do ADCC em uma biblioteca química. Com este ensaio, telas de bibliotecas de compostos podem ser realizadas para identificar compostos que aumentam o ADCC que poderiam ser usados como agentes terapêuticos adjuvantes para o tratamento de pacientes recebendo imunoterapias anticâncer. Além disso, o método também pode ser usado para identificar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis inibidores do ADCC de drogas terapêuticas tomadas por pacientes com câncer para diferentes indicações.

Introdução

A imunoterapia com anticorpos anticâncer, inibidores de checkpoints imunes ou células T (CAR-T) que expressam receptores de antígenos quiméricos representa uma abordagem poderosa para o tratamento do câncer ^1,2,3. O trastuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado anti-HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2) utilizado no tratamento do câncer de mama em estádio inicial ou metastático positivo para HER-2, bem como do câncer gástrico metastático positivo para HER-2 ^4,5,6. Atua principalmente inibindo o efeito estimulador da proliferação do fator de crescimento epidérmico⁴. Tem sido relatado, no entanto, que o trastuzumabe desencadeia eficientemente a morte de células cancerígenas, mesmo que as células cancerosas tenham perdido sua responsividade à estimulação de HER-2⁷. Esse efeito paradoxal do anticorpo é devido à citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC)⁷. O ADCC pode ser mediado por células natural killer (NK), granulócitos e macrófagos conhecidos coletivamente como células efetoras do ADCC ^8,9. Se um anticorpo, como o trastuzumabe, se liga às células tumorais, então essas células efetoras usam seus receptores Fc para se ligar à região constante (Fc) do anticorpo. O anticorpo faz a ponte entre as células tumorais e as células efetoras do receptor Fc, desencadeando a liberação de seus mediadores citotóxicos¹⁰. As células natural killer liberam a carga citotóxica de seus grânulos contendo perforina para gerar poros na membrana da célula-alvo e granzima (desencadeando vias de sinalização de morte celular) na sinapse imune levando à apoptose das células cancerosas (ver Figura 1).

Figura 1: Interações entre efetor e célula-alvo no ADCC. O receptor Fcγ de superfície celular da célula NK efetora reconhece a região Fc do anticorpo anti-HER2 trastuzumabe específico para a molécula HER2 expressa na superfície da célula tumoral. Assim, a chamada sinapse imunológica se estabelece entre as duas células, induzindo a exocitose dirigida dos grânulos citotóxicos da célula efetora. As moléculas de perforina e granzima liberadas acabam resultando em apoptose da célula-alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vários ensaios foram previamente desenvolvidos para quantificar a citotoxicidade, incluindo o ADCC. O padrão-ouro é o método de liberação radioativa de cromo, onde as células-alvo são marcadas com o isótopo radioativo ⁵¹Cr, e o ADCC é quantificado pela medida da radioatividade do sobrenadante das células-alvo lisadas¹¹. Devido aos problemas óbvios devido ao manuseio, armazenamento e descarte estritamente regulamentados de fármacos e resíduos radioativos, esse método tem se tornado cada vez mais popular entre os cientistas da vida. Além disso, também não é passível de aplicativos de alto rendimento. A medição da atividade de enzimas (por exemplo, lactato-desidrogenase) liberadas das células-alvo mortas pode fornecer uma alternativa não radioativa ao ensaio de ⁵¹Cr¹². Esses ensaios, no entanto, não conseguem distinguir entre mortes celulares alvo e efetora. O Sensor de Impedância Célula-Substrato Elétrico (ECIS) mostrou-se adequado para a quantificação do ADCC¹³, mas o equipamento ECIS não está disponível na maioria dos laboratórios, e a técnica não é compatível com aplicações/triagem de alto rendimento. Células marcadas fluorescentemente representam uma alternativa popular em muitos ensaios de biologia celular e são frequentemente usadas em citometria de fluxo ou aplicações baseadas em leitores de placas^14,15,16. No entanto, esses ensaios geralmente contêm etapas de lavagem ou são incompatíveis com aplicações de alto rendimento (por exemplo, técnicas baseadas em citometria de fluxo). Alguns ensaios populares de citotoxicidade, que teoricamente deveriam ser adequados para a quantificação do ADCC, falham em determinar de forma confiável a eficiência do ADCC¹³. Recentemente, com a disseminação da microscopia confocal fluorescente, ensaios baseados em imagens e de alto conteúdo estão se tornando cada vez mais populares em várias áreas das ciências da vida¹⁷. Por um lado, os equipamentos de imagem celular são agora bastante ubíquos, enquanto, por outro lado, parâmetros morfológicos virtualmente infinitos podem ser coletados a partir das imagens adquiridas. Portanto, nos propusemos a desenvolver um ensaio ADCC compatível com triagem de alto conteúdo e demonstrar sua adequação para triagem de bibliotecas compostas.

Aqui, apresentamos um ensaio ADCC baseado em imagem e demonstramos como este ensaio pode ser usado para triagem de alto conteúdo (HCS) para identificar compostos moduladores do ADCC. O modelo é baseado em células-alvo do carcinoma de mama JIMT-1, células efetoras CD16.176V.NK-92 e trastuzumabe monoclonal anticorpo anti-HER2 humanizado. Com esse método, é possível identificar drogas que possam aumentar a ação tumoral das células NK ou obter informações sobre o mecanismo do ADCC mediado por células NK através da identificação de pequenas moléculas que interferem com o ADCC. Sugerimos que cientistas da vida com o objetivo de quantificar a citotoxicidade mediada por células, com especial atenção ao ADCC, podem se beneficiar do uso deste ensaio tanto para a ciência da descoberta quanto para o desenvolvimento de fármacos. Este ensaio pode ser uma alternativa se um laboratório tiver acesso e alguma experiência em imagem fluorescente e análise quantitativa de imagens.

Protocolo

NOTA: As principais etapas do fluxo de trabalho de ensaio são apresentadas na Figura 2.

Figura 2: Fluxo de trabalho da tela do ADCC. As células-alvo do JIMT-1-EGFP semeadas em placas HCS de 96 poços são tratadas com drogas da biblioteca de compostos. Por sua vez, células NK (efetoras) não coradas e trastuzumabe são adicionados, e a placa é imageada em 0 momento e após 3 h de incubação. A avaliação do ADCC baseia-se na mudança no número de células-alvo viáveis (aderentes à superfície). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Revestimento da placa HCS

1. Revestir as placas de triagem de alto conteúdo (HSC) de 96 poços com meio JIMT-1 de 50 μL/poço (meio DMEM/F-12 suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS), 0,3 U/mL de insulina (100 UI/mL, Humulin R e 1% de penicilina-estreptomicina).
2. Coloque a placa em uma incubadora de CO₂ por 1 h.
   NOTA: O revestimento é crucial para fixar as células JIMT-1 à superfície de vidro da placa.

2. Semeadura de células JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)

NOTA: Células JIMT-1 expressando EGFP foram geradas em nosso trabalho anterior¹⁸, e as células foram cultivadas em frascos de cultura de tecido T25 em meio JIMT-1 (ver composição na etapa 1.1).

1. Lavar as células com 2 mL de PBS estéril.
2. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA ao balão e voltar a colocá-lo numa incubadora de CO₂ durante 10 minutos.
3. Após a incubação, toque no balão para verificar se as células JIMT-1 estão destacadas.
4. Interromper a digestão com 2 ml de meio JIMT-1 e recolher a suspensão celular num tubo de 15 ml.
5. Contar as células com azul de tripano a 0,4% (80 μL do corante + 20 μL da suspensão celular) em uma câmara de Bürker e ajustar o número de células para 133.000 células/mL.
6. Aspirar o meio de revestimento da placa de 96 poços (passo 1.2).
7. Pipetar 75 μL da suspensão celular para cada poço das placas HCS (ver Tabela de Materiais).
8. Permitir que as células se liguem durante uma incubação noturna a 37 °C em uma incubadora de CO₂ .

3. Pré-tratamento de células JIMT-1 EGFP com a biblioteca de compostos

1. Aspirar o meio das células JIMT-1 e adicionar 50 μL/bem fresco meio JIMT-1 aos poços. Transfira a placa para o laboratório de triagem de alto rendimento.
   NOTA: O uso de um robô de manuseio de líquidos torna a adição de bibliotecas de compostos mais eficiente e reproduzível.
2. Transfira os compostos de teste da placa de biblioteca de compostos para a placa de ensaio com uma ferramenta de pino calibrada para um volume de 25 nL. Execute isso quatro vezes. Quatro rodadas de transferência dão um volume final de 100 nL (e uma concentração final de 20 μM).
3. Entre cada etapa, lave a ferramenta do pino, primeiro com DMSO 50% e depois com etanol 70%.
4. Incubar as placas durante 1 h numa incubadora de CO₂ a 37 °C.

4. Iniciar o ensaio ADCC adicionando as células efetoras

NOTA: Células CD16.176V.NK92 (doravante denominadas células NK92) foram cultivadas em α-MEM suplementado com 20% de SFB, 1% de MEM-NEAA, 1% de Na-piruvato, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina e 100 UI/mL de IL-2.

1. Contar células NK92 com azul de tripano (80 μL do corante + 20 μL da suspensão celular). Ajuste o número de células para 400.000 células/mL.
2. Centrifugar 4 mL da suspensão celular a 150 x g por 3 min à temperatura ambiente.
3. Preparar o meio ADCC adicionando 20 μg/mL de anticorpo anti-HER2 (trastuzumabe) ao meio JIMT-1.
4. Ressuspender o pellet de células NK em meio ADCC de 5 mL.
5. Pipetar 20.000 células NK em 50 μL de meio ADCC para as células alvo JIMT-1. O volume final é de 100 μL e a concentração final de trastuzumabe é de 10 μg/mL.
6. Coloque a placa de ensaio no equipamento de análise de alto teor com uma incubadora integrada regulada a 37 °C.

5. Exames por imagem

NOTA: As placas devem ser fotografadas em dois momentos, primeiro, imediatamente após a adição das células efetoras às células-alvo e segundo, em 3 h após a adição das células NK. Para geração de imagens, o analisador de alto conteúdo e seu software ou alternativas adequadas podem ser usados (consulte Tabela de materiais).

1. Selecione Tipo de placa (ultra portador de célula de 96 poços) na lista de placas.
2. Selecione o foco automático de dois picos se o ensaio for realizado em placas.
3. Use a objetiva de 10x no modo não confocal.
4. Selecione Binning 2 para dobrar a relação sinal/ruído.
5. Tire imagens de campo brilhante a 650-760 nm e imagens fluorescentes das células JIMT-1 transduzidas por EGFP a comprimentos de onda de 488 nm (excitação) e 500-550 nm (emissão).
6. Selecione o número de campos e o número de pontos de tempo para a geração de imagens.

6. Análise das imagens

NOTA: Para analisar a eficiência do ADCC, as células JIMT-1 viáveis são contadas. As células-alvo mortas pelo ADCC se desprendem da superfície e se afastam do plano focal do microscópio. Portanto, a diferença entre o número de células viáveis no início e no final da reação do ADCC corresponde às células-alvo eliminadas pelo ADCC. Para mostrar como construir a sequência de avaliação, um poço de controle ADCC é mostrado no vídeo.

1. Use o módulo Localizar células para detectar regiões na imagem que correspondem às células .
   NOTA: Cada célula é detectada como uma região na imagem com uma intensidade de fluorescência mais alta do que seu entorno.
2. Selecione células usando o algoritmo M embutido com um mínimo de 80 μm de diâmetro.
3. Defina a sensibilidade de divisão, que divide um objeto grande em objetos menores, como 0,5.
4. Defina o limite Comum (o nível mais baixo de intensidade de pixel) como 0.
5. Exclua a detecção de área de fundo com alta intensidade de fluorescência EGFP em duas etapas.
   1. Primeiro, use a função Calcular propriedades de intensidade para determinar a intensidade de fluorescência EGFP na região Células selecionada anteriormente.
   2. Defina o limite de intensidade mínima e máxima usando a opção Selecionar população .

Resultados

Para demonstrar como o ensaio funciona na vida real, criamos uma biblioteca de testes de 16 compostos selecionados aleatoriamente das prateleiras do laboratório (Figura 3). Além disso, o DMSO também foi incluído como controle negativo e três compostos inibidores da polimerização de microtúbulos (colchicina, vincristina e podofilotoxina) como controles positivos. Esperava-se que estes últimos inibissem o ADCC, interferindo com a migração de células NK para as células cancerosas e...

Discussão

A reação do ADCC tem sido descrita há relativamente muito tempo. Eventos moleculares importantes do processo também foram descritos¹⁹. Os métodos de medição do ADCC vão desde o ensaio de liberação radioativa de cromo padrão-ouro, ensaios de liberação enzimática citoplasmática até vários ensaios de citometria de fluxo ou microplacas baseados em fluorescência²⁰. No entanto, uma limitação comum desses ensaios é que eles não são passíveis de aplicativos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Applichem	A7686	in compound library
96-well Cell Carrier Ultra plate	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	in compound library
CD16.176V.NK92 cells	Nankwest Inc.
Cerulenin	ChemCruz	sc-396822	in compound library
Cisplatin	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	in compound library
Colchicine	Sigma	C9754	in compound library
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	in compound library
Dexamethasone	Sigma	D4902	in compound library
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	in compound library
Etoposide	Sigma	E1383	E1383
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP and NK medium
Fisetin	Sigma	F4043	in compound library
Freedom EVO liquid handling robot	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	16201	in compound library
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
Harmony software	PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary	N/A
Humulin R (insulin)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP medium
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	in NK medium
Isatin	Sigma	114618	in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Naringenin	Sigma	N5893	in compound library
NQDI-1	Sigma	SML0185	in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer
Penicillin–streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP and NK medium
Pentoxyfilline	Sigma	P1784	in compound library
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-517Q	to wash the cells
Podophyllotoxin	Sigma	P4405	in compound library
Quercetin	Sigma	Q4951	in compound library
Tannic acid	Sigma	T8406	in compound library
Temozolomide	Sigma	T2577	in compound library
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Vincristine sulfate	Sigma	V0400000	in compound library
α-MEM	Sigma	M8042	in NK medium