Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi

Özet

Bu protokol, terapötik bir anti-HER-2 antikoru varlığında doğal öldürücü hücre aracılı meme kanseri hücresi öldürmeyi modüle eden bileşikleri tanımlamak için otomatik, görüntü tabanlı yüksek verimli bir teknik sunar.

Özet

Antijene özgü antikorlar veya immün kontrol noktası inhibitörleri ile immünoterapi, meme kanseri tedavisinde devrim yaratmıştır. Epidermal büyüme faktörü reseptörü HER2'yi eksprese eden meme kanseri hücreleri, anti-HER-2 antikoru trastuzumab tarafından hedeflenebilir. Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC), HER-2'nin antitümör etkisinde rol oynayan önemli bir mekanizmadır. Kanser hücrelerine bağlı trastuzumab, ADCC efektör hücrelerinin (örneğin, doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar ve granülositler) Fc reseptörleri tarafından tanınabilir ve bu bağışıklık hücrelerinin sitotoksik aktivitesini tetikleyerek kanser hücresi ölümüne yol açar. Yüksek içerikli tarama ile yeni ADCC modülatör bileşiklerini tanımlamak için ADCC'nin nicelleştirilmesi için görüntü tabanlı bir tahlil geliştirmek üzere yola çıktık. Tahlilde, JIMT-1 meme kanseri hücrelerini aşırı eksprese eden HER2, trastuzumab varlığında NK-92 hücreleri ile birlikte kültürlenir ve hedef hücre ölümü otomatik mikroskopi ve kantitatif görüntü analizi ile ölçülür. Hedef hücreler, EGFP floresanlarına göre efektör hücrelerden ayırt edilir. ADCC modülatör ilaçlarını tanımlamak için bileşik kütüphanelerin tahlilde nasıl test edilebileceğini gösteriyoruz. Bu amaçla, laboratuvar rafından rastgele seçilmiş ince kimyasallar kullanılarak bir bileşik kütüphane test plakası kuruldu. NK hücre göçü ve degranülasyonuna müdahale etmesi beklenen üç mikrotübül destabilize edici bileşik (kolşisin, vinkristin, podofillotoksin) de test kütüphanesine dahil edildi. Test ekranı, üç pozitif kontrol bileşiğinin hepsini, kimyasal bir kütüphanede ADCC modifiye edici ilaçları tanımlamak için yöntemin uygunluğunu kanıtlayan isabetler olarak tanımladı. Bu tahlil ile, antikanser immünoterapileri alan hastaların tedavisinde adjuvan terapötik ajanlar olarak kullanılabilecek ADCC arttırıcı bileşikleri tanımlamak için bileşik kütüphane ekranları yapılabilir. Ek olarak, yöntem, kanser hastaları tarafından farklı endikasyonlar için alınan terapötik ilaçların istenmeyen ADCC inhibe edici yan etkilerini tanımlamak için de kullanılabilir.

Giriş

Antikanser antikorları, immün kontrol noktası inhibitörleri veya kimerik antijen reseptörü eksprese eden T (CAR-T) hücreleri ile immünoterapi, kanser tedavisine güçlü bir yaklaşımı temsil eder ^1,2,3. Trastuzumab, HER-2 pozitif erken evre veya metastatik meme kanserinin yanı sıra HER-2 pozitif metastatik mide kanseri ^4,5,6 tedavisinde kullanılan insanlaştırılmış bir monoklonal anti-HER-2 (insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2) antikorudur. Öncelikle epidermal büyüme faktörü

Protokol

NOT: Tahlil iş akışının temel adımları Şekil 2'de sunulmuştur.

Şekil 2: ADCC ekranının iş akışı. 96 kuyucuklu HCS plakasına tohumlanan JIMT-1-EGFP hedef hücreleri, bileşik kütüphanesinin ilaçlarıyla muamele edilir. Buna karşılık, lekesiz NK (efektör) hücreleri ve trastuzumab eklenir ve plaka 0 zaman noktasında ve 3 saatlik inkübasyondan sonra görüntülenir. ADCC değerlendirmesi, canlı (yüzeye yapışkan)....

Sonuçlar

Tahlilin gerçek hayatta nasıl çalıştığını göstermek için, laboratuvar raflarından rastgele seçilen 16 bileşikten oluşan bir test kütüphanesi oluşturduk (Şekil 3). Ek olarak, DMSO ayrıca negatif kontrol olarak ve pozitif kontroller olarak üç mikrotübül polimerizasyon inhibitörü bileşiği (kolşisin, vinkristin ve podofillotoksin) dahil edildi. İkincisinin, kanser hücrelerine NK hücre göçüne ve NK hücre degranülasyonuna müdahale ederek ADCC'yi inhibe etmesi .......

Tartışmalar

ADCC reaksiyonu nispeten uzun zaman önce tanımlanmıştır. Sürecin anahtar moleküler olayları da tanımlanmıştır¹⁹. ADCC'yi ölçme yöntemleri, altın standart radyoaktif krom salınım testinden, sitoplazmik enzim salınım testlerinden birkaç floresan bazlı akış sitometrisine veya mikroplaka tahlillerine^{kadar uzanır 20}. Bununla birlikte, bu testlerin ortak bir sınırlaması, yüksek verimli uygulamalara uygun olmamalarıdır. Daha önce, ADCC modifiye edic.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Applichem	A7686	in compound library
96-well Cell Carrier Ultra plate	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	in compound library
CD16.176V.NK92 cells	Nankwest Inc.
Cerulenin	ChemCruz	sc-396822	in compound library
Cisplatin	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	in compound library
Colchicine	Sigma	C9754	in compound library
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	in compound library
Dexamethasone	Sigma	D4902	in compound library
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	in compound library
Etoposide	Sigma	E1383	E1383
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP and NK medium
Fisetin	Sigma	F4043	in compound library
Freedom EVO liquid handling robot	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	16201	in compound library
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
Harmony software	PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary	N/A
Humulin R (insulin)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP medium
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	in NK medium
Isatin	Sigma	114618	in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Naringenin	Sigma	N5893	in compound library
NQDI-1	Sigma	SML0185	in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer
Penicillin–streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP and NK medium
Pentoxyfilline	Sigma	P1784	in compound library
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-517Q	to wash the cells
Podophyllotoxin	Sigma	P4405	in compound library
Quercetin	Sigma	Q4951	in compound library
Tannic acid	Sigma	T8406	in compound library
Temozolomide	Sigma	T2577	in compound library
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Vincristine sulfate	Sigma	V0400000	in compound library
α-MEM	Sigma	M8042	in NK medium