בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

Summary

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

Abstract

טיפות שומנים פלסטוגלובול הן תת-תא דינמי של כלורופלסטים צמחיים וציאנובקטריה. הם נמצאים בכל מקום בקרב מינים פוטוסינתטיים, ומאמינים שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהסתגלות ובשיפוץ של קרום התילקואיד בתנאי סביבה המשתנים במהירות. היכולת לבודד פלסטוגלובולים בעלי טוהר גבוה הקלה מאוד על מחקרם באמצעות מתודולוגיות פרוטאומיות, ליפידומיות ואחרות. עם plastoglobules של טוהר גבוה ותשואה, ניתן לחקור את הרכב השומנים והחלבונים שלהם, פעילות אנזימטית, טופולוגיה חלבון, בין מאפיינים מולקולריים אפשריים אחרים. מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר ויעיל לבידוד פלסטוגלובולים מכלורופלסטים של רקמת עלה צמחי ומציג וריאציות מתודולוגיות לבידוד של פלסטוגלובולים ומבני טיפות שומנים קשורים מעלי תירס, רקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, Eragrostis nindensis, והציאנובקטריום, סינכוציסטיס sp. PCC 6803. הבידוד מסתמך על הצפיפות הנמוכה של חלקיקים עשירים בשומנים אלה, מה שמקל על טיהורם על ידי ציפה בצפיפות סוכרוז. מתודולוגיה זו תוכיח את עצמה כבעלת ערך בחקר פלסטוגלובולים ממינים מגוונים.

Introduction

ההבנה הנוכחית של הרכב ותפקוד הפלסטוגלובול התפתחה באמצעות מחקרים פרוטאומיים וליפידומיים מפורטים 1,2,3,4,5. מחקרים כאלה נעזרו רבות בשיטת בידוד מהירה ויעילה המסתמכת על צפיפותם הנמוכה מאוד להפרדה יעילה באמצעות שיפועים של סוכרוז. שיטות ראשוניות לבידוד פלסטוגלובול הושגו ממינים כגון עץ האשור (Fagus sylvatica), מטאטא סקוטי (Sarothamnus scoparius), בצל (Allium cepa), תרד (Spinacia oleracea), פאנסי (ויולה טריקולור), פלפל (Capsicum annuum) ואפונה (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,^12,13. שיטה מעודכנת לבידוד פלסטוגלובולים של כלורופלסט בצורה יעילה יותר ומניבה טוב יותר הוצגה מאוחר יותר על ידי Ytterberg et ^al.3,14. בעוד שבתחילה נעשה שימוש במחקר של פלסטוגלובולים של כלורופלסטים מעלי אראבידופסיס טליאנה, השתמשנו בהצלחה בשיטה מעודכנת זו לרקמת העלים הבריאה של מיני צמחים אחרים, הן מונוקוט והן דיקוט, כולל תירס (Zea mays), עגבנייה (Solanum lycopersicum), עשב אהבה (Eragrostis nindensis)), ברום מזויף סגול (Brachypodium distachyon) וטבק בר (Nicotiana benthamiana) ; תוצאות שלא פורסמו). יתר על כן, שיטת הבידוד הותאמה בהצלחה לפלסטוגלובולים של ציאנובקטריה, כולל Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Anabaena sp. PCC 7120¹⁵, ורקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, E. nindensis.

פלסטוגלובולים של כלורופלסט של רקמת עלים בריאה מחוברים פיזית לקרום התילקואיד¹⁶. למרות ההמשכיות הפיזיקלית הזו, שני תתי-התאים של כלורופלסט שומרים על הרכבי שומנים וחלבונים נפרדים, אם כי חילופי השומנים והחלבון המוסדרים בין שני התאים הוצעו 2,4,17,18,19^. למעשה, מודל hemifusion מעניין הוצע לאחרונה לסחר של שומנים ניטרליים בין chloroplasts ו cytosol¹⁹. בשל ההמשכיות הפיזית של פלסטוגלובולים ותילאקואידים, שיטת הבידוד עם רקמת עלה בריאה מתחילה באיסוף של הכנת thylakoid גולמית כדורית, אשר לאחר מכן sonicated כדי להפריד את plastoglobules מן thylakoids, אשר בניגוד לשיטות המשמשות לבידוד טיפות שומנים ציטוזוליים²⁰ . לאחר מכן, האולטרה-צנטריפוגציה על כרית סוכרוז מרחפת את הפלסטוגלובולים בעלי הצפיפות הנמוכה כלפי מעלה דרך הסורוז, ומפרידה אותם למעשה מהתילקואידים, הגרעינים וחומרים אחרים בעלי צפיפות גבוהה. לעומת זאת, פלסטוגלובולים בציאנובקטריה, כמו גם אלה של רקמת עלים מיובשים, קיימים ככל הנראה in vivo בצורה צפה חופשית. לפיכך, הבידוד שלהם כרוך בציפה ישירה על שיפוע סוכרוז. מאמר זה מדגים את שיטת הבידוד מרקמת עלה בריאה ומדגים עוד יותר שתי וריאציות שניתן להשתמש בהן כדי לבודד פלסטוגלובולים מרקמת עלים מיובשים או מתרביות ציאנובקטריאליות, ומרחיב מאוד את הרוחב הפיזיולוגי ואת ההקשר האבולוציוני שבו ניתן לחקור פלסטוגלובולים.

לאחר מכן ניתן להשתמש בפלסטוגלובולים מבודדים לכל מספר של ניתוחים במורד הזרם כדי לחקור מאפיינים מולקולריים. השתמשנו בפלסטוגלובולים המבודדים מרקמת עלי A. thaliana לניתוח פרוטאומי וליפידומי נרחב בתנאי סביבה או גנוטיפים שונים, המדגימים את השינוי הסלקטיבי של הרכב החלבון והשומנים בהתאמה ללחץ 2,4,21,22. בנוסף, בוצעו מבחני קינאז במבחנה המדגימים פעילות טרנס-זרחון הקשורה לפלסטוגלובולים מבודדים 22, המצבים האוליגומריים של רכיבי חלבון נחקרו באמצעות אלקטרופורזה מקומית בג'ל ²¹, ומבחני גילוח פרוטאז בוצעו²³.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המהירות היחסית של ההליך. מניסיוננו, ניתן להשלים את הפרוטוקולים המפורטים להלן במלואם תוך כ-4 שעות. תוארה שיטה חלופית לבידוד פלסטוגלובולים מרקמת העלה, המאפשרת בידוד סימולטני של תת-תאים אחרים של כלורופלסט²⁴. שיטה חלופית זו מציעה כמה יתרונות ברורים כאשר יש צורך או רצוי בהשוואה כמותית לשאר תתי-תאי הכלורופלסט. עם זאת, שיטה חלופית זו היא גם מייגעת יותר ותספק תשואה נמוכה משמעותית של פלסטוגלובולים מבודדים מכמויות דומות של רקמת עלה. כאשר מחקר ממוקד של פלסטוגלובולים הוא המטרה, המתודולוגיה המתוארת כאן היא הבחירה האופטימלית. עם זאת, ניתן לאסוף את סך כל העלים ואת האליקוטים הגולמיים של thylakoid במהלך הכנת הדגימה, ומומלץ מאוד לעשות זאת, כדי לקבל דגימות ייחוס להשוואה הבאה.

Protocol

1. בידוד פלסטוגלובול גולמי

1. מיצוי פלסטוגלובול גולמי מרקמת עלי תירס לא מתוחים
   1. רכשו שישה שתילי תירס בריאים כבני 3 שבועות וכמעט בשלב הצמיחה של V5, במשקל של כ-120 גרם.
   2. חותכים את כל העלים שבבסיס הגבעול, מטביעים אותם במהירות באמבט קרח, ומעבירים לחדר הקר.
   3. עובדים תחת מנורת בטיחות ירוקה, מוציאים את עלי התירס מאמבט הקרח וחותכים אותם לחתיכות קטנות יותר (כ-5X5 ס"מ) באמצעות מספריים.
   4. טחנו בעדינות אך ביסודיות מחצית מרקמת העלה החתוך בבלנדר מסחרי ב-350 מ"ל של חיץ השחזה (טבלה 1). התחילו לעצור את הבלנדר 5x-6x כדי לוודא שכל העלים נחתכים. אין להשתמש מעל רמה 7 בבלנדר.
   5. סנן את ההומוגנט דרך שכבה אחת של בד ניילון 25 מיקרומטר על משפך גדול לארבעה בקבוקי צנטריפוגות של 250 מ"ל. לאחר מכן, חזור על שלב 1.1.4 עם המחצית השנייה של רקמת העלה החתוך.
   6. מחלקים באופן שווה את התסנין בין ארבעת הבקבוקים והצנטריפוגה למשך 6 דקות ב-1,840 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. מוציאים אליקוט של תסנין העלה ומניחים אותו בצד לפני הצנטריפוגה כדי לאחסן אותו כמדגם עלים כולל מייצג.
   7. יש לשפוך את ה-supernatant שנוצר ולתלות בעדינות את הכדור ב-12 מ"ל של R בינוני 0.2 המכיל סוכרוז של 0.2 M (טבלה 1) על ידי מערבולת והחייאה עם תנועות עדינות של המברשת. לאחר השעיית כל כדור, העבר את המתלה לבקבוק הבא וחזור על ההשעיה. אכל את המתלים לבקבוק אחד.
   8. חלקו את המתלים המאוגדים בין שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של 3 מ"ל, והגיעו לנפח מרבי של 2.5 מ"ל בכל צינור.
   9. סוניקטור כל שפופרת 4x, במשך 10 שניות בכל פעם, באמצעות sonicator קצה באמפליטודה של 100%. הקפידו לשמור על צופר הסוניקטור שקוע והרחק ממשטח הנוזל כדי למנוע קצף.
   10. הזיזו באיטיות את צופר הסוניקטור למעלה ולמטה בתוך המתלים במהלך כל סיבוב. החליפו בין ארבעת הצינורות, החזירו כל צינור לדלי קרח לאחר כל סוניקציה כדי לאפשר לדגימה להתקרר.
   11. צנטריפוגה מתלה thylakoid גולמי sonicated ב 150,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. קצור את הפד הצף שנוצר כתוצאה מכך של פלסטוגלובולים גולמיים מפני השטח של כרית הסוכרוז (הנראית בקלות כרית צהובה ושמנונית) באמצעות מזרק ומחט 22 G על ידי רפרוף על פני השטח של הכרית עם פתח המחט, ושחזר כ-500 μL מכל צינור. הפקדה לתוך צינור 2.0 מ"ל.
   12. לאסוף aliquots של thylakoid גס לפני ואחרי סוניקציה ושחרור של plastoglobules. המשך לשלב 2.1. לחלופין, אחסנו את הפלסטוגלובולים הגולמיים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס וטיהרו במועד מאוחר יותר.
2. מיצוי פלסטוגלובול גולמי מרקמת עלה E. nindensis מיובשת
   1. רכשו עציץ (המורכב משלושה צמחים בודדים לכל עציץ) של E. nindensis בן 8-9 שבועות מיובש לחלוטין (כמעט 40 גרם רקמה).
   2. נתקו את כל רקמת העלה מבסיס הצמח, ממש מעל האדמה, בעזרת מספריים ומיד טבלו את הרקמה באמבט קרח. מעבירים את הרקמה לחדר הקר.
   3. עבודה תחת מנורת בטיחות ירוקה, לחתוך את E. עלי נינדנסיס לחתיכות קטנות יותר (כ-5X5 ס"מ) באמצעות מספריים.
   4. בעדינות אך ביסודיות טוחנים את העלים עם 100 מ"ל של חיץ טחינה (טבלה 1) בבלנדר מסחרי. התחילו לעצור את הבלנדר מספר פעמים כדי לוודא שכל העלים נחתכים. אין להשתמש מעל רמה 7 בבלנדר.
   5. מסננים את ההומוגנט דרך שכבה אחת של בד ניילון 25 מיקרומטר על משפך גדול לתוך בקבוק חרוטי של 250 מ"ל. מוציאים אליקוט של תסנין העלה ומניחים אותו בצד לפני הצנטריפוגה כדי לאחסן אותו כמדגם עלים כולל מייצג.
   6. מוסיפים את הכמות המתאימה של סוכרוז כדי להביא לריכוז סופי של 0.5 M ולהפיץ את התמיסה לתוך צינורות צנטריפוגה 250 מ"ל.
      הערה: ריכוז גבוה יותר של סוכרוז בהשוואה לתכשיר Z. mays משמש להבטחת ציפה של טיפות השומנים הציטוזוליות לפני הסוניקציה/שחרור הבאים של הפלסטוגלובולים הקשורים לתילקואיד.
   7. צנטריפוגה הצינורות ב 45,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תערובת של פלסטוגלובולים וטיפות שומנים ציטוזוליות תיראה בקלות ככרית צהובה ושמנונית על פני השטח של כרית הסוכרוז או בסמוך לה (איור 1B). לאסוף את החומר הצף באמצעות מזרק עם מחט 22 G על ידי רפרוף על פני השטח של הכרית עם פתח המחט, ולהפקיד לתוך צינור.
   8. השליכו את שאריות הסופר-נטנט לאחר איסוף תערובת טיפות הפלסטוגלובול/ליפידים הצפות בחופשיות.
   9. כדי לבודד את הפלסטוגלובולים המחוברים לשאריות thylakoid, יש לתלות את הכדור ב-12 מ"ל של R בינוני 0.2 על ידי מערבולת והחייאה בתנועות עדינות של המברשת. אכל את המתלים לבקבוק אחד. המשך לשלב 1.1.8.
3. מיצוי פלסטוגלובול גולמי מציאנובקטריה
   1. לגדל תרבית 50 מ"ל של Synechocystis sp. PCC 6803 לשלב נייח (כ 7-10 ימים) ולהתאים את צפיפות התא OD₇₅₀ של 2.0 באמצעות ספקטרופוטומטר. לתנאי תרבית, השתמש במדיית BG-11 וגדל באינקובטור בעוצמת אור של 150 פוטונים μmol/m 2/s, 2% CO₂, 32 °C, ועם רעידות מתמשכות ב-150 סל"ד.
   2. כדי להסיר את הפוליסכרידים, לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה תרבית 50 מ"ל ב 6,000 x גרם במשך 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הסרת supernatant. המשך על ידי שטיפת התאים פעמיים ב-50 מ"ל של חיץ A (טבלה 1). הסר אליקוט של ההומוגנט של התא והניח אותו בצד לפני הצנטריפוגה כדי לאחסן אותו כדגימת תא כוללת מייצגת
   3. יש לתלות את הכדור השטוף ב-25 מ"ל של Buffer A ולשבור את התאים באמצעות תא לחץ צרפתי ב-1,100 psi, תוך חזרה על התהליך פי 3 (לשים את הדגימה על הקרח בין כל מחזור כדי למנוע דנטורציה של חלבונים) עד שהצבע השחוק משתנה מירוק לאדום-כחול-ירוק תחת אור לבן. השתמש בתא מקורר מראש ובצע שלב זה בחדר הקר.
   4. להפיץ את ההומוגנט שנוצר בין שמונה צינורות ultracentrifuge 3 מ"ל מלא עד מקסימום של 2.5 מ"ל בכל צינור ולאחר מכן בזהירות כיסוי עם 400 μL של R בינוני, לייצר שיפוע צעד.
      הערה: עיין ב- Yang, et al. ו- Kelekar, et al. לתיאורים מפורטים של הכנת גרדיאנט סוכרוז^25,26.
   5. אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת R בינוני נוסף, לפי הצורך, וצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-150,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס. הת'ילאקואיד ואברונים כבדים אחרים (כולל כל הגופים הפוליהידרוקסיאלקנואטים) ייפלטו, בעוד שפלסטוגלובולים ייראו בקלות כרית צהובה ושמנונית בחלק העליון של שיפוע הסוכרוז או בסמוך לו (איור 1C).
   6. קצור את הפד הצף שנוצר כתוצאה מכך של פלסטוגלובולים גולמיים עם מזרק ומחט 22G והשקע לתוך צינור 2 מ"ל. גרד פלסטוגלובולים מהצד של קיר צינור ultracentrifuge עם קצה המחט במידת הצורך.
   7. המשך לשלב 2.2. לחלופין, אחסנו פלסטוגלובולים גולמיים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס וטיהרו מאוחר יותר.

2. קצירת פלסטוגלובולים טהורים

1. עיבוד רקמות צמחים
   1. הפק גרדיאנטים של סוכרוז בצינורות אולטרה-צנטריפוגה של 2.5 מ"ל על ידי שכבה ראשונה עם 500 μL של פלסטוגלובולים גולמיים משלב 1.1 או שלב 1.2 מעורבב עם 500 μL של R בינוני 0.7, כדי להביא לנפח כולל של 1 מ"ל, ולאחר מכן כיסוי עם 400 μL של R בינוני 0.2, ואחריו כיסוי עם 400 μL של R בינוני.
      הערה: עיין Yang et al. ו- Kelekar et al. לתיאורים מפורטים של הכנת שיפוע סוכרוז^25,26.
   2. אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת R בינוני עודף לשכבה העליונה, לפי הצורך. לאחר מכן צנטריפוגה ב 150,000 x גרם במשך 1.5 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. קצור את הפד הצף שנוצר כתוצאה מכך של פלסטוגלובולים טהורים (איור 1A) עם מזרק ומחט 22G והשקע בצינור של 2 מ"ל. גרד פלסטוגלובולים מהחלק העליון של דופן צינור הצנטריפוגה עם קצה המחט במידת הצורך.
   4. Aliquot את plastoglobules טהור להקפיא הבזק חנקן נוזלי. יש לאחסן ישירות בטמפרטורה של -80°C או לבצע lyophilize לאבקה יבשה.
2. עיבוד ציאנובקטריה
   1. הפק שיפוע סוכרוז בארבעה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של 2.5 מ"ל בשכבות תחילה עם 500 μL של הפלסטוגלובולים הגולמיים משלב 1.3 מעורבב עם 750 μL של R בינוני 0.7, ולאחר מכן כיסוי עם 750 μL של R בינוני 0.2.
      הערה: עיין Yang et al. ו- Kelekar et al. לתיאורים מפורטים של הכנת שיפוע סוכרוז^25,26.
   2. צנטריפוגה שיפוע סוכרוז ב 150,000 x גרם במשך 90 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. אסוף את הפלסטוגלובולים הטהורים (איור 1C) באמצעות מזרק ומחט של 22 G מהשלב העליון של שיפוע הסוכרוז והעבר לצינור של 1.5 מ"ל.
   3. אליקוט את הפלסטוגלובולים הטהורים ואת הקפאת הבזק בחנקן נוזלי. יש לאחסן ישירות בטמפרטורה של −80°C או לבצע lyophilize לאבקה יבשה.

תוצאות

עם השלמת שלב 1 של הפרוטוקול, יש לראות בקלות כמות ניכרת של חומר טיפות פלסטוגלובול/שומנים שצף על השכבה העליונה של כרית הסוכרוז (או בסמוך לה) (איור 1B-C). ניתן לאסוף גם שברים אחרים בשלב זה. לדוגמה, thylakoids יהיה גלולה וניתן להשעות מחדש עם בינוני R 0.2 עבור ניתוחים הבאי?...

Discussion

כדי למזער את השינויים הפיזיולוגיים/ביוכימיים בחומר ולהגן על פיגמנטים מסוימים של פרניל ליפידים פוטו-לביליים ותרמו-לביליים שהם מרכיב עשיר של פלסטוגלובולים, חיוני לבצע את הבידוד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. כפי שצוין לעיל, הצעדים הראשונים מבוצעים בחדר הקירור תחת מנורת בטיחות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A