Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

Zusammenfassung

Es wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen vorgestellt, die mit verschiedenen photosynthetischen Organismen assoziiert sind. Die erfolgreiche Herstellung isolierter Plastoglobuli ist ein entscheidender erster Schritt, der detaillierten molekularen Untersuchungen wie proteomischen und lipidomischen Analysen vorausgeht.

Zusammenfassung

Plastoglobuläre Lipidtröpfchen sind ein dynamisches Unterkompartiment von pflanzlichen Chloroplasten und Cyanobakterien. Es wird angenommen, dass sie ubiquitär unter photosynthetischen Arten vorkommen und eine zentrale Rolle bei der Anpassung und dem Umbau der Thylakoidmembran unter sich schnell ändernden Umweltbedingungen spielen. Die Fähigkeit, Plastoglobulen von hoher Reinheit zu isolieren, hat ihre Untersuchung durch proteomische, lipidomische und andere Methoden erheblich erleichtert. Mit Plastoglobuli von hoher Reinheit und Ausbeute ist es möglich, ihre Lipid- und Proteinzusammensetzung, enzymatische Aktivität und Proteintopologie sowie andere mögliche molekulare Eigenschaften zu untersuchen. Dieser Artikel stellt ein schnelles und effektives Protokoll für die Isolierung von Plastoglobuli aus Chloroplasten von pflanzlichem Blattgewebe vor und stellt methodische Variationen für die Isolierung von Plastoglobulen und verwandten Lipidtröpfchenstrukturen aus Maisblättern, dem ausgetrockneten Blattgewebe der Auferstehungspflanze, Eragrostis nindensis, und dem Cyanobakterium, Synechocystis , vor PCC 6803. Die Isolierung beruht auf der geringen Dichte dieser lipidreichen Partikel, was ihre Reinigung durch Saccharosedichteflotation erleichtert. Diese Methodik wird sich bei der Untersuchung von Plastoglobuli verschiedener Arten als wertvoll erweisen.

Einleitung

Das aktuelle Verständnis der Zusammensetzung und Funktion von Plastoglobulen ist durch detaillierte proteomische und lipidomische Studien entstanden 1,2,3,4,5. Solche Studien wurden durch eine schnelle und effektive Isolierungsmethode erheblich unterstützt, die auf ihrer sehr geringen Dichte für eine effiziente Trennung unter Verwendung von Saccharosegradienten beruht. Erste Methoden zur Isolierung von Plastoglobulen wurden von Arten wie Buche (Fagus sylvatica), Ginster (Sarothamnus scoparius), Zwiebel (Allium cepa), Spinat (Spinacia oleracea), Stiefmütterchen (Viola tricolor), Pfeffer (Capsicum annuum) und Erbsen (Pisum sativum) erreicht6,7,8,9,10,11 ,^12,13. Eine aktualisierte Methode, um Chloroplasten-Plastoglobuli effizienter und ertragreicher zu isolieren, wurde später von Ytterberg et ^al.3,14 vorgestellt. Während wir ursprünglich für die Untersuchung der Plastoglobulen von Arabidopsis thaliana Blattchloroplasten eingesetzt wurden, haben wir diese aktualisierte Methode erfolgreich für das gesunde Blattgewebe anderer Pflanzenarten eingesetzt, sowohl für Monokotylen als auch für Dikotylen, einschließlich Mais (Zea mays), Tomate (Solanum lycopersicum), Liebesgras (Eragrostis nindensis), Purpur-Falschbrome (Brachypodium distachyon) und Wildtabak (Nicotiana benthamiana ; unveröffentlichte Ergebnisse). Darüber hinaus wurde die Isolierungsmethode erfolgreich an die Plastoglobulen von Cyanobakterien, einschließlich Synechocystis sp. PCC 6803 und Anabaena sp. PCC 7120¹⁵, und das ausgetrocknete Blattgewebe der Auferstehungspflanze, E. nindensis, angepasst.

Chloroplasten-Plastoglobuli von gesundem Blattgewebe sind physikalisch mit den Thylakoidmembranen^{verbunden 16}. Trotz dieser physikalischen Kontinuität behalten die beiden Chloroplasten-Unterkompartimente unterschiedliche Lipid- und Proteinzusammensetzungen bei, obwohl der regulierte Austausch von Lipid und Protein zwischen den beiden Kompartimenten vorgeschlagen wurde 2,4,17,18,19. Tatsächlich wurde kürzlich ein interessantes Hemifusionsmodell für den Transport neutraler Lipide zwischen Chloroplasten und Zytosol¹⁹ vorgeschlagen. Aufgrund der physikalischen Kontinuität von Plastoglobuli und Thylakoiden beginnt die Isolationsmethode mit gesundem Blattgewebe mit der Entnahme eines pelletierten rohen Thylakoidpräparats, das anschließend beschallt wird, um die Plastoglobulen von den Thylakoiden zu trennen, was im Gegensatz zu Verfahren zur Isolierung zytosolischer Lipidtröpfchen^{steht 20} . Die Ultrazentrifugation auf einem Saccharosekissen führt dann die Plastoglobuli niedriger Dichte durch die Saccharose nach oben und trennt sie effektiv von den Thylakoiden, Kernen und anderem Material mit hoher Dichte. Im Gegensatz dazu existieren Plastoglobuli in Cyanobakterien, wie auch solche von ausgetrocknetem Blattgewebe, in vivo offenbar in frei schwebender Form. Daher beinhaltet ihre Isolierung ein direktes Schweben auf einem Saccharosegradienten. Dieser Artikel demonstriert die Isolationsmethode aus gesundem Blattgewebe und demonstriert zwei Variationen, die verwendet werden können, um Plastoglobulen aus ausgetrocknetem Blattgewebe oder Cyanobakterienkulturen zu isolieren, was die physiologische Breite und den evolutionären Kontext, in dem Plastoglobulen untersucht werden können, erheblich erweitert.

Isolierte Plastoglobuli können anschließend für beliebig viele nachgeschaltete Analysen zur Untersuchung molekularer Eigenschaften verwendet werden. Wir haben die isolierten Plastoglobuli aus A. thaliana Blattgewebe für umfangreiche proteomische und lipidomische Analysen unter unterschiedlichen Umweltbedingungen oder Genotypen verwendet, um die selektive Modifikation der Protein- und Lipidzusammensetzung bei der Anpassung an Stress^{zu demonstrieren 2,4,21,22}. Darüber hinaus wurden In-vitro-Kinase-Assays durchgeführt, die eine Transphosphorylierungsaktivität im Zusammenhang mit isolierten Plastoglobulen zeigen 22, die oligomeren Zustände von Proteinkomponenten wurden unter Verwendung der nativen Gelelektrophorese ^{untersucht 21} und Protease-Rasier-Assays durchgeführt ²³.

Der Hauptvorteil dieser Methode ist die relative Geschwindigkeit des Verfahrens. Unserer Erfahrung nach können die unten beschriebenen Protokolle innerhalb von ca. 4 Stunden vollständig abgeschlossen werden. Es wurde eine alternative Methode zur Isolierung von Plastoglobulen aus Blattgewebe beschrieben, die die gleichzeitige Isolierung anderer Chloroplasten-Unterkompartimente^{ermöglicht 24}. Diese alternative Methode bietet einige klare Vorteile, wenn ein quantitativer Vergleich mit den anderen Chloroplasten-Unterkompartimenten notwendig oder erwünscht ist. Diese alternative Methode ist jedoch auch langwieriger und liefert eine deutlich geringere Ausbeute an isolierten Plastoglobulen aus vergleichbaren Mengen an Blattgewebe. Wenn eine fokussierte Untersuchung von Plastoglobuli das Ziel ist, ist die hier skizzierte Methodik die optimale Wahl. Nichtsdestotrotz können während der Probenvorbereitung Gesamtblatt- und rohe Thylakoid-Aliquots gesammelt werden, und es wird dringend empfohlen, dies zu tun, um Referenzproben für den anschließenden Vergleich zu haben.

Protokoll

1. Isolierung von groben Plastoglobulen

1. Rohe Plastoglobulenextraktion aus unbelastetem Maisblattgewebe
   1. Erwerben Sie sechs gesunde Maissämlinge, die etwa 3 Wochen alt sind und sich fast im V5-Wachstumsstadium befinden und etwa 120 g wiegen.
   2. Schneiden Sie alle Blätter an der Basis des Stiels ab, tauchen Sie sie schnell in ein Eisbad und transportieren Sie sie in den Kühlraum.
   3. Unter einer grünen Sicherheitslampe die Maisblätter aus dem Eisbad nehmen und mit einer Schere in kleinere Stücke schneiden (ca. 5 cm x 5 cm).
   4. Die Hälfte des abgeschnittenen Blattgewebes wird in einem handelsüblichen Mixer in 350 ml Mahlpuffer vorsichtig, aber gründlich gemahlen (Tabelle 1). Starten und stoppen Sie den Mixer 5x-6x, um sicherzustellen, dass alle Blätter geschnitten sind. Verwenden Sie nicht höher als Stufe 7 auf dem Mixer.
   5. Das Homogenat wird durch eine Schicht 25 μm Nylongewebe auf einem großen Trichter in vier 250 ml Zentrifugenflaschen filtriert. Wiederholen Sie dann Schritt 1.1.4 mit der zweiten Hälfte des abgeschnittenen Blattgewebes.
   6. Das Filtrat gleichmäßig auf die vier Flaschen verteilen und 6 min bei 1.840 x g bei 4 °C zentrifugieren. Ein aliquoter Teil des Blattfiltrats wird entfernt und vor dem Zentrifugieren beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtblattprobe gelagert zu werden.
   7. Der resultierende Überstand wird abgegossen und das Pellet in 12 ml Medium R 0,2, das 0,2 M Saccharose enthält (Tabelle 1), vorsichtig resuspendiert, indem es mit sanften Bewegungen der Bürste geschwenkt und resuspendiert wird. Nachdem Sie jedes Pellet resuspendiert haben, tragen Sie die Suspension in die nächste Flasche und wiederholen Sie die Resuspension. Fassen Sie die Suspensionen in einer Flasche zusammen.
   8. Die gepoolte Suspension wird auf sechs 3-ml-Ultrazentrifugenröhrchen verteilt, wobei in jedem Röhrchen ein maximales Volumen von 2,5 ml erreicht wird.
   9. Beschallen Sie jede Röhre 4x für jeweils 10 s mit einem Spitzenbeschaller mit einer Amplitude von 100%. Achten Sie darauf, das Ultraschallhorn unter Wasser und von der Flüssigkeitsoberfläche fernzuhalten, um ein Aufschäumen zu vermeiden.
   10. Bewegen Sie das Ultraschallhorn während jeder Runde langsam innerhalb der Aufhängung auf und ab. Wechseln Sie zwischen den vier Röhrchen und geben Sie jedes Röhrchen nach jeder Beschallung in einen Eiskübel zurück, damit die Probe abkühlen kann.
   11. Die beschallte rohe Thylakoidsuspension wird bei 150.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobulen wird mit einer Spritze und einer 22-G-Nadel von der Oberfläche des Saccharosekissens (leicht als gelbes, öliges Pad erkannt) geerntet, indem die Oberfläche des Kissens mit der Öffnung der Nadel abgeschöpft wird, wobei ca. 500 μl aus jedem Röhrchen gewonnen werden. In ein 2,0 ml Röhrchen geben.
   12. Sammeln Sie Aliquots des rohen Thylakoids vor und nach der Beschallung und Freisetzung von Plastoglobuli. Fahren Sie mit Schritt 2.1 fort. Alternativ können die rohen Plastoglobuli bei −80 °C gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt gereinigt werden.
2. Rohe Plastoglobulenextraktion aus ausgetrocknetem E. nindensis-Blattgewebe
   1. Erwerben Sie einen Topf (bestehend aus drei einzelnen Pflanzen pro Topf) mit vollständig ausgetrocknetem, 8-9 Wochen alter E. nindensis (fast 40 g Gewebe).
   2. Schneiden Sie das gesamte Blattgewebe von der Basis der Pflanze, direkt über dem Boden, mit einer Schere ab und tauchen Sie das Gewebe sofort in ein Eisbad. Transportieren Sie das Gewebe in den Kühlraum.
   3. Arbeiten Sie unter einer grünen Sicherheitslampe, schneiden Sie das E. Nindensis-Blätter mit einer Schere in kleinere Stücke (ca. 5 cm x 5 cm) zerlegen.
   4. Mahlen Sie die Blätter vorsichtig, aber gründlich mit 100 ml Mahlpuffer (Tabelle 1) in einem handelsüblichen Mixer. Starten Sie den Mixer mehrmals, um sicherzustellen, dass alle Blätter geschnitten werden. Verwenden Sie nicht höher als Stufe 7 auf dem Mixer.
   5. Das Homogenat wird durch eine Schicht 25-μm-Nylongewebe auf einem großen Trichter in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben filtriert. Ein aliquoter Teil des Blattfiltrats wird entfernt und vor dem Zentrifugieren beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtblattprobe gelagert zu werden.
   6. Geben Sie die entsprechende Menge Saccharose hinzu, um eine Endkonzentration von 0,5 M zu erreichen, und verteilen Sie die Lösung in 250 ml Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Eine höhere Konzentration von Saccharose im Vergleich zum Z. mays-Präparat wird verwendet, um die Flotation der zytosolischen Lipidtröpfchen vor der anschließenden Beschallung/Freisetzung der Thylakoid-gebundenen Plastoglobulen zu gewährleisten.
   7. Die Röhrchen werden bei 45.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Eine Mischung aus Plastoglobuli und zytosolischen Lipidtröpfchen ist leicht als gelbes, öliges Pad auf oder nahe der Oberfläche des Saccharosekissens zu sehen (Abbildung 1B). Sammeln Sie das schwimmende Material mit einer Spritze mit einer 22-G-Nadel, indem Sie die Oberfläche des Kissens mit der Öffnung der Nadel abschöpfen und in ein Röhrchen geben.
   8. Entsorgen Sie den verbleibenden Überstand nach dem Sammeln des frei schwebenden Plastoglobulen-Lipid-Tröpfchen-Gemischs.
   9. Um die Plastoglobuli zu isolieren, die mit dem restlichen Thylakoid verbunden sind, resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml Medium R 0,2 durch Schwenken und Resuspendieren mit sanften Bewegungen der Bürste. Fassen Sie die Suspensionen in einer Flasche zusammen. Fahren Sie mit Schritt 1.1.8 fort.
3. Rohe Plastoglobulenextraktion aus Cyanobakterien
   1. Man züchtet eine 50 ml Kultur von Synechocystis sp. PCC 6803 bis zur stationären Phase (ca. 7-10 Tage) und stellt die Zelldichte mit einem Spektralphotometer auf einen OD₇₅₀ von 2,0 ein. Für Kulturbedingungen verwenden Sie BG-11-Medien und züchten Sie in einem Inkubator bei einer Lichtintensität von 150 μmol Photonen/m2/s, 2% CO2,³² °C und mit kontinuierlichem Schütteln bei 150 U/min.
   2. Um die Polysaccharide zu entfernen, waschen Sie die Zellen, indem Sie die 50 ml Kultur bei 6.000 x g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren und anschließend den Überstand entfernen. Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal in 50 ml Puffer A (Tabelle 1). Ein aliquoter Teil des Zellhomogenats wird entfernt und vor dem Zentrifugieren beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtzellprobe aufbewahrt zu werden
   3. Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 25 ml Puffer A und brechen Sie die Zellen mit einer französischen Druckzelle bei 1.100 psi auf, wiederholen Sie den Vorgang 3x (legen Sie die Probe zwischen jedem Zyklus auf Eis, um eine Proteindenaturierung zu vermeiden), bis sich die lysierte Farbe unter weißem Licht von grün zu rot-blau-grün ändert. Verwenden Sie eine vorgekühlte Zelle und führen Sie diesen Schritt im Kühlraum durch.
   4. Das resultierende Homogenat wird auf acht 3-ml-Ultrazentrifugenröhrchen verteilt, die mit maximal 2,5 mL gefüllt sind, und dann vorsichtig mit 400 μL Medium R überlagert, wodurch ein Stufengradient erzeugt wird.
      ANMERKUNG: Siehe Yang et al. und Kelekar et al. für detaillierte Beschreibungen der Saccharosegradientenpräparation^25,26.
   5. Die Röhrchen werden bei Bedarf durch Zugabe von zusätzlichem Medium R vorsichtig ausbalanciert und 30 min bei 150.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das Thylakoid und andere schwerere Organellen (einschließlich aller Polyhydroxyalkanoatkörper) pelletieren, während Plastoglobulen leicht als gelbes, öliges Pad auf oder nahe der Oberseite des Saccharosegradienten zu sehen sind (Abbildung 1C).
   6. Ernten Sie das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobuli mit einer Spritze und einer 22G-Nadel und geben Sie es in ein 2-ml-Röhrchen. Kratzen Sie die Plastoglobuli bei Bedarf mit der Nadelspitze seitlich von der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens ab.
   7. Fahren Sie mit Schritt 2.2 fort. Alternativ lagern Sie rohe Plastoglobuli bei -80 °C und reinigen Sie sie später.

2. Gewinnung von reinen Plastoglobuli

1. Verarbeitung von pflanzlichem Gewebe
   1. Herstellung von Saccharosegradienten in 2,5 mL Ultrazentrifugenröhrchen durch Schichten mit 500 μL rohen Plastoglobulen aus Schritt 1.1 oder Schritt 1.2, gemischt mit 500 μL Medium R 0,7, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalten, dann mit 400 μL Medium R 0,2 zu überlagern, gefolgt von einer Überlagerung mit 400 μL Medium R.
      ANMERKUNG: Siehe Yang et al. und Kelekar et al. für detaillierte Beschreibungen der Saccharosegradientenpräparation^25,26.
   2. Wägen Sie die Röhrchen vorsichtig aus, indem Sie bei Bedarf überschüssiges Medium R in die oberste Schicht geben. Anschließend bei 150.000 x g für 1,5 h bei 4 °C zentrifugieren.
   3. Das resultierende schwimmende Pad aus reinen Plastoglobulen (Abbildung 1A) wird mit einer Spritze und einer 22G-Nadel entnommen und in ein 2-ml-Röhrchen gegeben. Kratzen Sie die Plastoglobuli bei Bedarf mit der Nadelspitze von der Oberseite der Zentrifugenröhrchenwand ab.
   4. Die reinen Plastoglobuli aliquotieren und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren. Direkt bei -80 °C lagern oder zu einem trockenen Pulver gefrieren.
2. Cyanobakterien-Verarbeitung
   1. Es wird ein Saccharosegradient in vier 2,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen hergestellt, die zuerst mit 500 μL der rohen Plastoglobuli aus Schritt 1.3 geschichtet sind, die mit 750 μL des Mediums R 0,7 gemischt sind, und dann mit 750 μL des Mediums R 0,2 überlagert werden.
      ANMERKUNG: Siehe Yang et al. und Kelekar et al. für detaillierte Beschreibungen der Saccharosegradientenpräparation^25,26.
   2. Zentrifugieren Sie den Saccharosegradienten bei 150.000 x g für 90 min bei 4 °C. Die reinen Plastoglobuli (Abbildung 1C) werden mit einer Spritze und einer 22-g-Nadel aus der oberen Phase des Saccharosegradienten entnommen und in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt.
   3. Die reinen Plastoglobuli aliquotieren und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren. Direkt bei −80 °C lagern oder zu einem trockenen Pulver gefrieren.

Ergebnisse

Nach Abschluss von Schritt 1 des Protokolls sollte man in der Lage sein, eine beträchtliche Menge an Plastoglobulen-/Lipidtröpfchenmaterial auf (oder in der Nähe) der obersten Schicht des Saccharosekissens zu sehen (Abbildung 1B-C). In dieser Phase könnten auch andere Fraktionen gesammelt werden. Zum Beispiel werden die Thylakoide pelletiert und können für nachfolgende Analysen mit dem Medium R 0,2 resuspendiert werden. Nach anschließender Zentrifugat...

Diskussion

Um physiologische/biochemische Veränderungen des Materials zu minimieren und bestimmte photo- und thermolabile Prenyl-Lipid-Pigmente zu schützen, die ein reicher Bestandteil von Plastoglobuli sind, ist es wichtig, die Isolierung bei 4 °C und vor Licht geschützt durchzuführen. Wie oben angedeutet, werden die ersten Schritte im Kühlraum unter einer Sicherheitslampe mit einer grün emittierenden Glühbirne durchgeführt. Die weiteren Schritte im Labor erfolgen unter gedimmtem Licht und verwenden Eis oder gekühlte Zen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A