Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Resumo

Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.

Resumo

As gotículas lipídicas de platoglobulos são um subcompartimento dinâmico de cloroplastos vegetais e cianobactérias. Encontrados de forma onipresente entre as espécies fotossintéticas, acredita-se que eles sirvam a um papel central na adaptação e remodelação da membrana tilacóide sob condições ambientais em rápida mudança. A capacidade de isolar plastoglóbulos de alta pureza facilitou muito seu estudo através de metodologias proteômicas, lipidômicas e outras. Com plastoglóbulos de alta pureza e rendimento, é possível investigar sua composição lipídica e proteica, atividade enzimática e topologia proteica, entre outras possíveis características moleculares. Este artigo apresenta um protocolo rápido e eficaz para o isolamento de plastoglóbulos de cloroplastos de tecido foliar vegetal e apresenta variações metodológicas para o isolamento de plastoglóbulos e estruturas de gotículas lipídicas relacionadas de folhas de milho, do tecido foliar desidratado da planta da ressurreição, Eragrostis nindensis, e da cianobactéria, Synechocystis PCC 6803. O isolamento depende da baixa densidade dessas partículas ricas em lipídios, o que facilita sua purificação pela flotação da densidade de sacarose. Esta metodologia será valiosa no estudo de plastoglobules de diversas espécies.

Introdução

A compreensão atual da composição e função dos plastoglóbulos emergiu por meio de estudos proteômicos e lipidômicos detalhados 1,2,3,4,5. Tais estudos têm sido grandemente auxiliados por um método rápido e eficaz de isolamento que se baseia em sua densidade muito baixa para uma separação eficiente usando gradientes de sacarose. Os métodos iniciais de isolamento de plastoglobulos foram obtidos a partir de espécies como faia (Fagus sylvatica), vassoura-escocesa (Sarothamnus scoparius), cebola (Allium cepa), espinafre (Spinacia oleracea), pansy (Viola tricolor), pimenta (Capsicum annuum) e ervilha (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,^12,13. Um método atualizado para isolar plastoglóbulos de cloroplasto de forma mais eficiente e melhor produtiva foi posteriormente apresentado por Ytterberg et ^al.3,14. Embora inicialmente empregado para o estudo dos plastoglóbulos dos cloroplastos foliares de Arabidopsis thaliana, empregamos com sucesso este método atualizado para o tecido foliar saudável de outras espécies vegetais, tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, incluindo milho (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), capim-do-amor (Eragrostis nindensis), bromo falso roxo (Brachypodium distachyon) e tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana) ; resultados não publicados). Além disso, o método de isolamento foi adaptado com sucesso aos plastoglóbulos de cianobactérias, incluindo Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 7120¹⁵, e o tecido foliar dessecado da planta da ressurreição, E. nindensis.

Os plastoglóbulos de cloroplasto do tecido foliar saudável estão fisicamente conectados às membranas tilacóides¹⁶. Apesar dessa continuidade física, os dois subcompartimentos do cloroplasto mantêm composições lipídicas e proteicas distintas, embora a troca regulada de lipídios e proteínas entre os dois compartimentos tenha sido proposta ^2,4,17,18,19. De fato, um interessante modelo de hemifusão foi recentemente proposto para o tráfico de lipídios neutros entre cloroplastos e citosol¹⁹. Devido à continuidade física de plastoglobules e tilacóides, o método de isolamento com tecido foliar saudável inicia-se com a coleta de uma preparação tilacóide bruta peletizada, que é posteriormente sonicada para separar os plastoglóbulos dos tilacóides, o que contrasta com os métodos utilizados para isolar gotículas lipídicas citosólicas²⁰ . A ultracentrifugação em uma almofada de sacarose então flutua os plastoglóbulos de baixa densidade através da sacarose, separando-os efetivamente dos tilacóides, núcleos e outros materiais de alta densidade. Em contraste, plastoglóbulos em cianobactérias, bem como os de tecido foliar dessecado, evidentemente existem in vivo em uma forma flutuante. Assim, seu isolamento envolve flutuar diretamente em um gradiente de sacarose. Este artigo demonstra o método de isolamento do tecido foliar saudável e demonstra ainda duas variações que podem ser usadas para isolar plastoglóbulos de tecidos foliares desidratados ou culturas de cianobactérias, expandindo grandemente a amplitude fisiológica e o contexto evolutivo em que os plastoglóbulos podem ser estudados.

Plastoglobules isolados podem posteriormente ser usados para qualquer número de análises a jusante para investigar características moleculares. Utilizamos os plastoglóbulos isolados do tecido foliar de A. thaliana para extensa análise proteômica e lipidômica sob diferentes condições ambientais ou genótipos, demonstrando a modificação seletiva da composição proteica e lipídica em adaptação ao estresse 2,4,21,22. Além disso, ensaios de quinase in vitro que demonstram atividade de transfosforilação associada a plastoglóbulos isolados foram realizados²², os estados oligoméricos de componentes proteicos foram investigados usando eletroforese em gel nativa 21 e ensaios de barbear de protease foram realizados²³.

O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento. Em nossa experiência, os protocolos descritos abaixo podem ser totalmente concluídos em aproximadamente 4 h. Um método alternativo para isolar plastoglóbulos do tecido foliar tem sido descrito, o que permite o isolamento simultâneo de outros subcompartimentos de cloroplasto²⁴. Este método alternativo oferece algumas vantagens claras quando a comparação quantitativa com os outros subcompartimentos de cloroplasto é necessária ou desejada. No entanto, este método alternativo também é mais tedioso e proporcionará um rendimento significativamente menor de plastoglóbulos isolados de quantidades comparáveis de tecido foliar. Quando um estudo focado de plastoglobules é o objetivo, a metodologia descrita aqui é a escolha ideal. No entanto, as alíquotas totais foliares e tilacóides brutas podem ser coletadas durante a preparação da amostra, e é altamente recomendável fazê-lo, para ter amostras de referência para posterior comparação.

Protocolo

1. Isolamento bruto de plastoglobule

1. Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar de milho não estressado
   1. Adquira seis mudas de milho saudáveis com aproximadamente 3 semanas de idade e quase no estágio de crescimento V5, pesando aproximadamente 120 g.
   2. Corte todas as folhas na base do caule, mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo e transporte para a câmara fria.
   3. Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de gelo e corte-as em pedaços menores (cerca de 5 cm x 5 cm) usando uma tesoura.
   4. Moer suavemente, mas completamente, metade do tecido foliar cortado em liquidificador comercial em 350 mL de tampão de moagem (Tabela 1). Start-stop do liquidificador 5x-6x para garantir que todas as folhas sejam cortadas. Não use mais do que o nível 7 no liquidificador.
   5. Filtrar o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 μm num funil grande em quatro frascos de centrífuga de 250 ml. Em seguida, repita o passo 1.1.4 com a segunda metade do tecido foliar cortado.
   6. Dividir uniformemente o filtrado entre os quatro frascos e centrifugar durante 6 minutos a 1.840 x g a 4 °C. Retirar uma alíquota do filtrado foliar e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra foliar total representativa.
   7. Despeje o sobrenadante resultante e ressuscite suavemente o pellet em 12 mL de meio R 0,2 contendo 0,2 M de sacarose (Tabela 1), girando e ressuspendendo com movimentos suaves da escova. Depois de ressuspender cada pellet, carregue a suspensão para o frasco seguinte e repita a ressuspensão. Junte as suspensões em uma garrafa.
   8. Distribuir a suspensão agrupada entre seis tubos ultracentrífugos de 3 mL, atingindo um volume máximo de 2,5 mL em cada tubo.
   9. Sonicate cada tubo 4x, por 10 s de cada vez, usando um sonicator de ponta a uma amplitude de 100%. Tenha cuidado para manter o chifre do sonicator submerso e longe da superfície líquida para evitar a formação de espuma.
   10. Mova lentamente a buzina do sonicator para cima e para baixo dentro da suspensão durante cada rodada. Alterne entre os quatro tubos, devolvendo cada tubo a um balde de gelo após cada sonicação para permitir que a amostra esfrie.
   11. Centrifugar a suspensão tilacóide bruta sonicated a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos da superfície da almofada de sacarose (prontamente vista como uma almofada amarela e oleosa) usando uma seringa e uma agulha 22 G, roçando a superfície da almofada com a abertura da agulha, recuperando aproximadamente 500 μL de cada tubo. Deposite em um tubo de 2,0 mL.
   12. Coletar alíquotas do tilacoide bruto antes e após a sonicação e liberação de plastoglobules. Continue para a etapa 2.1. Alternativamente, armazene os plastoglóbulos brutos a -80 °C e purifique mais tarde.
2. Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar desidratado de E. nindensis
   1. Adquira um vaso (composto por três plantas individuais por vaso) de E. nindensis totalmente desidratada, de 8 a 9 semanas de idade (quase 40 g de tecido).
   2. Retire todo o tecido foliar da base da planta, logo acima do solo, usando uma tesoura e mergulhe imediatamente o tecido em um banho de gelo. Transporte o tecido para a câmara fria.
   3. Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, corte o E. nindensis sai em pedaços menores (em torno de 5 cm x 5 cm) usando tesoura.
   4. Moer suavemente, mas bem, as folhas com 100 mL de tampão de moagem (Tabela 1) em um liquidificador comercial. Ligue o liquidificador várias vezes para garantir que todas as folhas estão sendo cortadas. Não use mais do que o nível 7 no liquidificador.
   5. Filtrar o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 μm num funil grande para um balão cónico de 250 ml. Retirar uma alíquota do filtrado foliar e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra foliar total representativa.
   6. Adicionar a quantidade adequada de sacarose para levar a uma concentração final de 0,5 M e distribuir a solução em tubos de centrífuga de 250 ml.
      NOTA: Uma maior concentração de sacarose em comparação com a preparação de Z. mays é usada para garantir a flutuação das gotículas lipídicas citosólicas antes da subsequente sonicação/liberação dos plastoglóbulos ligados ao tilacóide.
   7. Centrifugar os tubos a 45.000 x g durante 30 min a 4 °C. Uma mistura de plastoglóbulos e gotículas lipídicas citosólicas será prontamente vista como uma almofada amarela e oleosa sobre ou perto da superfície da almofada de sacarose (Figura 1B). Recolha o material flutuante utilizando uma seringa com uma agulha de 22 G, roçando a superfície da almofada com a abertura da agulha e deposite num tubo.
   8. Rejeitar o sobrenadante restante após a recolha da mistura de plastoglobule/gotículas lipídicas flutuantes.
   9. Para isolar os plastoglóbulos conectados ao tilacóide residual, ressussuscite o pellet em 12 mL de R 0,2 médio rodopiando e ressuspendendo com movimentos suaves da escova. Junte as suspensões em uma garrafa. Continue para a etapa 1.1.8.
3. Extração bruta de plastoglobulos a partir de cianobactérias
   1. Cultivar uma cultura de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 para a fase estacionária (cerca de 7-10 dias) e ajustar a densidade celular para uma OD₇₅₀ de 2,0 usando um espectrofotômetro. Para condições de cultura, use meios BG-11 e cresça em uma incubadora a uma intensidade de luz de 150 μmol de fótons/m 2/s, 2% de CO², 32 °C e com agitação contínua a 150 rpm.
   2. Para remover os polissacarídeos, lavar as células centrifugando a cultura de 50 mL a 6.000 x g por 45 min a 4 °C e, posteriormente, removendo o sobrenadante. Continue lavando as células duas vezes em 50 mL de tampão A (Tabela 1). Remover uma alíquota do homogeneizado celular e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra de célula total representativa
   3. Ressuspeite o pellet lavado em 25 mL de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 psi, repetindo o processo 3x (coloque a amostra no gelo entre cada ciclo para evitar a desnaturação da proteína) até que a cor lisada mude de verde para vermelho-azul-verde sob luz branca. Use uma célula pré-resfriada e execute esta etapa na câmara fria.
   4. Distribuir o homogeneizado resultante entre oito tubos ultracentrífugos de 3 mL preenchidos até um máximo de 2,5 mL em cada tubo e, em seguida, sobrepor cuidadosamente com 400 μL de R médio, produzindo um gradiente de degraus.
      NOTA: Consulte Yang, et al. e Kelekar, et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose^25,26.
   5. Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o meio R adicional, conforme necessário, e centrifugar durante 30 minutos a 150.000 x g a 4 °C. O tilacóide e outras organelas mais pesadas (incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato) serão pellets, enquanto os plastoglóbulos serão prontamente vistos como uma almofada amarela e oleosa sobre ou perto do topo do gradiente de sacarose (Figura 1C).
   6. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa e agulha 22G e deposite em um tubo de 2 mL. Raspe os plastoglóbulos do lado da parede do tubo de ultracentrífuga com a ponta da agulha, se necessário.
   7. Continue para a etapa 2.2. Em alternativa, conservar os plastoglóbulos brutos a -80 °C e purificar mais tarde.

2. Colheita de plastoglóbulos puros

1. Processamento de tecidos vegetais
   1. Produzir gradientes de sacarose em tubos ultracentrífugos de 2,5 mL por primeira camada com 500 μL de plastoglóbulos brutos da etapa 1.1 ou etapa 1.2 misturada com 500 μL do meio R 0.7, para levar a um volume total de 1 mL, em seguida, sobrepor com 400 μL de R médio 0.2, seguido de sobreposição com 400 μL de R médio.
      NOTA: Consulte Yang et al. e Kelekar et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose^25,26.
   2. Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o excesso de R médio à camada superior, conforme necessário. Em seguida, centrifugar a 150.000 x g por 1,5 h a 4 °C.
   3. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos puros (Figura 1A) com seringa e agulha 22G e deposite em um tubo de 2 mL. Raspe os plastoglóbulos da parte superior da parede do tubo de centrífuga com a ponta da agulha, se necessário.
   4. Aliquot os plastoglóbulos puros e congelamento flash em nitrogênio líquido. Conservar directamente a -80 °C ou liofilizar até ao pó seco.
2. Processamento de cianobactérias
   1. Produzir um gradiente de sacarose em quatro tubos ultracentrífugos de 2,5 mL em camadas primeiro com 500 μL dos plastoglóbulos brutos da etapa 1.3 misturados com 750 μL do meio R 0,7, depois sobrepor com 750 μL do meio R 0,2.
      NOTA: Consulte Yang et al. e Kelekar et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose^25,26.
   2. Centrifugar o gradiente de sacarose a 150.000 x g durante 90 min a 4 °C. Coletar os plastoglóbulos puros (Figura 1C) com seringa e agulha 22 G da fase superior do gradiente de sacarose e transferir para um tubo de 1,5 mL.
   3. Aliquot os plastoglóbulos puros e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. Conservar diretamente a -80 °C ou liofilizar para um pó seco.

Resultados

Após a conclusão da etapa 1 do protocolo, deve-se ser capaz de ver prontamente uma quantidade considerável de material de plastoglobule/gotícula lipídica flutuando sobre (ou perto) da camada superior da almofada de sacarose (Figura 1B-C). Outras frações também poderiam ser coletadas nesta fase. Por exemplo, os tilacóides serão peletizados e podem ser ressuspensos com o meio R 0,2 para análises subsequentes. Após a centrifugação subsequente, os ...

Discussão

Para minimizar as alterações fisiológicas/bioquímicas do material e proteger certos pigmentos pré-lábeis foto-lábeis e termolábeis que são um componente rico dos plastoglobules, é fundamental realizar o isolamento a 4 °C e protegido da luz. Como indicado acima, as etapas iniciais são realizadas na câmara fria sob uma lâmpada de segurança usando uma lâmpada emissora de verde. As etapas subsequentes realizadas no laboratório são sob luzes esmaecidas e usam gelo ou centrifugação refrigerada. Por razões ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A