Isolamento di goccioline lipidiche plastoglobule dal tessuto fogliare vegetale e cianobatteri

Riepilogo

Viene presentato un protocollo rapido ed efficiente per l'isolamento delle goccioline lipidiche di plastoglobulo associate a vari organismi fotosintetici. Il successo della preparazione di plastoglobuli isolati è un primo passo cruciale che precede indagini molecolari dettagliate come analisi proteomiche e lipidomiche.

Abstract

Le goccioline lipidiche dei plastoglobuli sono un sottocompartimento dinamico dei cloroplasti vegetali e dei cianobatteri. Trovati ovunque tra le specie fotosintetiche, si ritiene che svolgano un ruolo centrale nell'adattamento e nel rimodellamento della membrana tilacoide in condizioni ambientali in rapida evoluzione. La capacità di isolare plastoglobuli di elevata purezza ha notevolmente facilitato il loro studio attraverso metodologie proteomiche, lipidomiche e di altro tipo. Con plastoglobuli di elevata purezza e resa, è possibile studiare la loro composizione lipidica e proteica, l'attività enzimatica e la topologia proteica, tra le altre possibili caratteristiche molecolari. Questo articolo presenta un protocollo rapido ed efficace per l'isolamento dei plastoglobuli dai cloroplasti del tessuto fogliare delle piante e presenta variazioni metodologiche per l'isolamento dei plastoglobuli e delle relative strutture di goccioline lipidiche dalle foglie di mais, dal tessuto fogliare essiccato della pianta della resurrezione, Eragrostis nindensis, e dal cianobatterio, Synechocystis PCC 6803. L'isolamento si basa sulla bassa densità di queste particelle ricche di lipidi, che facilita la loro purificazione mediante flottazione della densità del saccarosio. Questa metodologia si rivelerà preziosa nello studio dei plastoglobuli di diverse specie.

Introduzione

L'attuale comprensione della composizione e della funzione dei plastoglobuli è emersa attraverso studi proteomici e lipidomici dettagliati 1,2,3,4,5. Tali studi sono stati notevolmente aiutati da un metodo rapido ed efficace di isolamento che si basa sulla loro bassissima densità per una separazione efficiente utilizzando gradienti di saccarosio. I metodi iniziali di isolamento dei plastoglobuli sono stati ottenuti da specie come il faggio (Fagus sylvatica), la ginestra scozzese (Sarothamnus sc....

Protocollo

1. Isolamento dei plastoglobuli grezzi

1. Estrazione di plastoglobuli grezzi da tessuto fogliare di mais non stressato
   1. Acquisire sei piantine di mais sane di circa 3 settimane e quasi nella fase di crescita V5, del peso di circa 120 g.
   2. Ritagliare tutte le foglie alla base del gambo, immergerle rapidamente in un bagno di ghiaccio e trasportarle nella cella frigorifera.
   3. Lavorando sotto una lampada di sicurezza verde, rimuovere le foglie di mais dal bagno di ghiaccio e tagliarle in pezzi più piccoli (circa 5 cm x 5 cm) usando le forbici.
   4. Macinare delicatamente ma accuratamente metà del tessuto fogliare tagli....

Risultati

Al completamento della fase 1 del protocollo, si dovrebbe essere in grado di vedere facilmente una notevole quantità di materiale di goccioline plastoglobulare / lipidiche galleggiare sopra (o vicino) allo strato superiore del cuscino di saccarosio (Figura 1B-C). Altre frazioni potrebbero anche essere raccolte in questa fase. Ad esempio, i tilacoidi saranno pellettati e potranno essere risospesi con R 0,2 medio per analisi successive. Dopo successiva centri.......

Discussione

Per ridurre al minimo le alterazioni fisiologiche/biochimiche del materiale e proteggere alcuni pigmenti foto- e termo-labili-lipidici che sono un ricco componente dei plastoglobuli, è fondamentale eseguire l'isolamento a 4 °C e al riparo dalla luce. Come indicato sopra, i passaggi iniziali vengono eseguiti nella cella frigorifera sotto una lampada di sicurezza utilizzando una lampadina a emissione verde. Le fasi successive eseguite in laboratorio sono sotto luci soffuse e utilizzano ghiaccio o centrifugazione refriger.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A