Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Özet

Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.

Özet

Plastoglobül lipit damlacıkları, bitki kloroplastlarının ve siyanobakterilerin dinamik bir alt bölmesidir. Fotosentetik türler arasında her yerde bulunan, hızla değişen çevresel koşullar altında tilakoid membranın adaptasyonunda ve yeniden şekillenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yüksek saflıktaki plastoglobülleri izole etme kapasitesi, proteomik, lipidomik ve diğer metodolojiler yoluyla çalışmalarını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Yüksek saflık ve verime sahip plastoglobüllerle, diğer olası moleküler özelliklerin yanı sıra lipit ve protein bileşimlerini, enzimatik aktivitelerini ve protein topolojilerini araştırmak mümkündür. Bu makalede, plastoglobüllerin bitki yaprağı dokusunun kloroplastlarından izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmakta ve plastoglobüllerin ve ilgili lipit damlacık yapılarının mısır yapraklarından, diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusundan, Eragrostis nindensis'ten ve siyanobakteri, Synechocystis'ten izolasyonu için metodolojik varyasyonlar sunulmaktadır. sp. PCC 6803. İzolasyon, bu lipit bakımından zengin parçacıkların düşük yoğunluğuna dayanır ve bu da sakkaroz yoğunluğu yüzdürme ile saflaştırmalarını kolaylaştırır. Bu metodoloji, çeşitli türlerden plastoglobüllerin incelenmesinde değerli olduğunu kanıtlayacaktır.

Giriş

Plastoglobül kompozisyonu ve fonksiyonunun güncel anlayışı ayrıntılı proteomik ve lipidomik çalışmalarla ortaya çıkmıştır ^1,2,3,4,5. Bu tür çalışmalar, sakkaroz gradyanları kullanılarak verimli ayırma için çok düşük yoğunluklarına dayanan hızlı ve etkili bir izolasyon yöntemi ile büyük ölçüde desteklenmiştir. Plastoglobul izolasyonunun ilk yöntemleri, kayın ağacı (Fagus sylvatica), viski süpürgesi (Sarothamnus scoparius), soğan (Allium cepa), ıspanak (Spinacia oleracea), hercai menekşe (Viola tricolor), biber (Capsicum annuum) ve bezelye (Pisum sativum) ^{6,7,8,9,10,11} gibi türlerden elde edildi. ,^12,13. Kloroplast plastoglobülleri daha verimli ve daha iyi verimli bir şekilde izole etmek için güncellenmiş bir yöntem daha sonra Ytterberg ve ark.3,14 tarafından sunulmuştur. Başlangıçta Arabidopsis thaliana yaprak kloroplastlarının plastoglobüllerinin incelenmesi için kullanılırken, bu güncellenmiş yöntemi, mısır (Zea mays), domates (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), mor sahte brom (Brachypodium distachyon) ve yabani tütün (Nicotiana benthamiana) dahil olmak üzere hem monokot hem de dikot gibi diğer bitki türlerinin sağlıklı yaprak dokusu için başarıyla kullandık. ; yayınlanmamış sonuçlar). Ayrıca, izolasyon yöntemi, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Anabaena sp. PCC 7120¹⁵ ve diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusu E. nintensis dahil olmak üzere siyanobakterilerin plastoglobüllerine başarıyla uyarlanmıştır.

Sağlıklı yaprak dokusunun kloroplast plastoglobülleri tilakoid membranlara fiziksel olarak bağlıdır¹⁶. Bu fiziksel sürekliliğe rağmen, iki kloroplast alt bölmesi farklı lipit ve protein bileşimlerini korur, ancak iki bölme arasındaki düzenlenmiş lipit ve protein değişimi^{önerilmiştir} 2,4,17,18,19. Aslında, son zamanlarda kloroplastlar ve sitosol¹⁹ arasındaki nötr lipitlerin kaçakçılığı için ilginç bir hemifüzyon modeli önerilmiştir. Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin fiziksel sürekliliği nedeniyle, sağlıklı yaprak dokusu ile izolasyon yöntemi, daha sonra plastoglobülleri tilakoidlerden ayırmak için sonikleştirilen peletlenmiş ham tilakoid preparatının toplanmasıyla başlar, bu da sitozolik lipit damlacıklarını izole etmek için kullanılan yöntemlerin aksinedir²⁰ . Bir sakkaroz yastığı üzerindeki ultrasantrifüjleme daha sonra düşük yoğunluklu plastoglobülleri sakkaroz boyunca yüzdürür ve onları tilakoidlerden, çekirdeklerden ve diğer yüksek yoğunluklu malzemelerden etkili bir şekilde ayırır. Buna karşılık, siyanobakterilerdeki plastoglobüllerin yanı sıra kurutulmuş yaprak dokusundakiler, serbest yüzen bir formda in vivo olarak açıkça bulunur. Bu nedenle, izolasyonları doğrudan bir sakkaroz gradyanı üzerinde yüzmeyi içerir. Bu makale, sağlıklı yaprak dokusundan izolasyon yöntemini göstermektedir ve ayrıca plastoglobülleri kurutulmuş yaprak dokusundan veya siyanobakteriyel kültürlerden izole etmek için kullanılabilecek iki varyasyonu göstererek, plastoglobüllerin çalışılabileceği fizyolojik genişliği ve evrimsel bağlamı büyük ölçüde genişletmektedir.

İzole plastoglobüller daha sonra moleküler özellikleri araştırmak için herhangi bir sayıda aşağı akış analizi için kullanılabilir. A. thaliana yaprak dokusundan izole plastoglobülleri, farklı çevresel koşullar veya genotipler altında kapsamlı proteomik ve lipidomik analiz için kullandık ve stres 2,4,21,22'ye adaptasyonda protein ve lipit bileşiminin seçici modifikasyonunu gösterdik. Ek olarak, izole plastoglobüllerle ilişkili trans-fosforilasyon aktivitesini gösteren in vitro kinaz testleri²², protein bileşenlerinin oligomerik durumları doğal jel elektroforezi 21 kullanılarak araştırıldı ve proteaz tıraş testleri²³ yapıldı.

Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızıdır. Deneyimlerimize göre, aşağıda özetlenen protokoller yaklaşık 4 saat içinde tamamen tamamlanabilir. Plastoglobülleri yaprak dokusundan izole etmek için alternatif bir yöntem tanımlanmıştır, bu da diğer kloroplast alt bölmelerinin eşzamanlı izolasyonuna izin verir²⁴. Bu alternatif yöntem, diğer kloroplast alt bölmeleriyle kantitatif karşılaştırma gerektiğinde veya istendiğinde bazı açık avantajlar sunar. Bununla birlikte, bu alternatif yöntem aynı zamanda daha sıkıcıdır ve karşılaştırılabilir miktarlarda yaprak dokusundan izole plastoglobüllerin önemli ölçüde daha düşük verimini sağlayacaktır. Plastoglobüllerin odaklanmış bir çalışması amaçlandığında, burada özetlenen metodoloji en uygun seçimdir. Bununla birlikte, numune hazırlama sırasında toplam yaprak ve ham tilakoid alikotlar toplanabilir ve daha sonraki karşılaştırmalar için referans numunelere sahip olmak için bunu yapmanız şiddetle tavsiye edilir.

Protokol

1. Ham plastoglobül izolasyonu

1. Stressiz mısır yaprağı dokusundan ham plastoglobül ekstraksiyonu
   1. Yaklaşık 3 haftalık ve yaklaşık V5 büyüme aşamasında, yaklaşık 120 g ağırlığında altı sağlıklı mısır fidanı edinin.
   2. Sapın tabanındaki tüm yaprakları kesin, hızla bir buz banyosuna batırın ve soğuk odaya taşıyın.
   3. Yeşil bir güvenlik lambası altında çalışırken, mısır yapraklarını buz banyosundan çıkarın ve makas kullanarak daha küçük parçalara (yaklaşık 5 cm x 5 cm) ayırın.
   4. Kırpılmış yaprak dokusunun yarısını ticari bir karıştırıcıda 350 mL öğütme tamponunda nazikçe ama iyice öğütün (Tablo 1). Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı 5x-6x'i başlatın-durdurun. Karıştırıcıda seviye 7'den daha yüksek kullanmayın.
   5. Homojenatı büyük bir huni üzerindeki bir kat 25 μm naylon bezden dört adet 250 mL santrifüj şişesine filtreleyin. Ardından, kırpılmış yaprak dokusunun ikinci yarısı ile adım 1.1.4'ü tekrarlayın.
   6. Filtrazı dört şişe arasında eşit olarak bölün ve 4 ° C'de 1.840 x g'de 6 dakika boyunca santrifüj yapın. Yaprak filtrasyonunun bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun.
   7. Elde edilen süpernatantı dökün ve peleti, fırçanın nazik hareketleriyle döndürerek ve sulandırarak 0.2 M sakkaroz içeren 12 mL orta R 0.2'de (Tablo 1) yavaşça yeniden askıya alın. Her peleti yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu bir sonraki şişeye taşıyın ve yeniden süspansiyonu tekrarlayın. Süspansiyonları bir şişede toplayın.
   8. Havuzlanmış süspansiyonu altı adet 3 mL ultrasantrifüj tüp arasında dağıtın ve her tüpte maksimum 2,5 mL hacme ulaşın.
   9. Her tüpü 4x, her seferinde 10 s için,% 100 genlikte bir uç sonikatör kullanarak sonikleştirin. Köpüğü önlemek için sonicator kornasını suya batırılmış ve sıvı yüzeyden uzak tutmaya dikkat edin.
   10. Her tur boyunca sonicator kornasını süspansiyon içinde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dört tüp arasında geçiş yapın, numunenin soğumasına izin vermek için her tüpü her sonikasyondan sonra bir buz kovasına geri döndürün.
   11. Sonik ham thylakoid süspansiyonunu 150.000 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin. Elde edilen ham plastoglobüllerin yüzer pedini, bir şırınga ve 22 G iğne kullanarak, yastığın yüzeyini iğnenin açılmasıyla sıyırarak, her tüpten yaklaşık 500 μL geri kazanarak, sakkaroz yastığının yüzeyinden (kolayca sarı, yağlı bir ped olarak görülür) toplayın. 2,0 mL'lik bir tüpe koyun.
   12. Plastoglobüllerin sonikasyonundan ve salınımından önce ve sonra ham tilakoidin alikotlarını toplayın. Adım 2.1'e geçin. Alternatif olarak, ham plastoglobülleri -80 ° C'de saklayın ve daha sonra saflaştırın.
2. Kurutulmuş E. nindensis yaprak dokusundan ham plastoglobül ekstraksiyonu
   1. Tamamen kurutulmuş, 8-9 haftalık E. nindensis'ten (yaklaşık 40 g doku) oluşan bir saksı (saksı başına üç ayrı bitkiden oluşan) edinin.
   2. Tüm yaprak dokusunu bitkinin tabanından, toprağın hemen üstünden, makas kullanarak kesin ve derhal bir buz banyosuna batırın. Dokuyu soğuk odaya taşıyın.
   3. Yeşil bir emniyet lambası altında çalışırken, E'yi kırpın. nindensis, makas kullanarak daha küçük parçalara (yaklaşık 5 cm x 5 cm) ayrılır.
   4. Yaprakları ticari bir karıştırıcıda 100 mL öğütme tamponu (Tablo 1) ile nazikçe ama iyice öğütün. Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı birkaç kez başlatın-durdurun. Karıştırıcıda seviye 7'den daha yüksek kullanmayın.
   5. Homojenatı büyük bir huni üzerindeki 25 μm naylon bezden bir tabaka boyunca 250 mL konik şişeye süzün. Yaprak filtrasyonunun bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun.
   6. 0,5 M'lik son konsantrasyona getirmek için uygun miktarda sakkaroz ekleyin ve çözeltiyi 250 mL santrifüj tüplerine dağıtın.
      NOT: Z. mays preparatına kıyasla daha yüksek bir sakkaroz konsantrasyonu, tilakoid bağlı plastoglobüllerin sonraki sonikasyonundan / salınımından önce sitozolik lipit damlacıklarının yüzdürülmesini sağlamak için kullanılır.
   7. Tüpleri 4 ° C'de 30 dakika boyunca 45.000 x g'de santrifüj yapın. Plastoglobüllerin ve sitozolik lipit damlacıklarının bir karışımı, sakkaroz yastığının yüzeyinde veya yakınında sarı, yağlı bir ped olarak kolayca görülecektir (Şekil 1B). Yastığın yüzeyini iğnenin açılmasıyla sıyırarak 22 G'lik bir iğne ile bir şırınga kullanarak yüzen malzemeyi toplayın ve bir tüpe koyun.
   8. Serbest yüzen plastoglobül / lipit damlacık karışımını topladıktan sonra kalan süpernatantı atın.
   9. Artık tilakoide bağlı plastoglobülleri izole etmek için, peleti fırçanın nazik hareketleriyle döndürerek ve sulandırarak 12 mL orta R 0.2'de yeniden askıya alın. Süspansiyonları bir şişede toplayın. 1.1.8 adımına geçin.
3. Siyanobakterilerden ham plastoglobül ekstraksiyonu
   1. 50 mL'lik bir Synechocystis sp. PCC 6803 kültürünü sabit faza (yaklaşık 7-10 gün) büyütün ve bir spektrofotometre kullanarak hücre yoğunluğunu OD₇₅₀ / 2.0'a ayarlayın. Kültür koşulları için, BG-11 ortamını kullanın ve bir inkübatörde 150 μmol foton / m 2 / s, %^{2 CO 2},₃₂ ° C ışık yoğunluğunda ve 150 rpm'de sürekli sallanarak büyüyün.
   2. Polisakaritleri çıkarmak için, 50 mL kültürü 6.000 x g'de 4 ° C'de 45 dakika boyunca santrifüj ederek ve daha sonra süpernatanı çıkararak hücreleri yıkayın. Hücreleri 50 mL tampon A'da iki kez yıkayarak devam edin (Tablo 1). Hücre homojenatının bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam hücre örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun
   3. Yıkanmış peleti 25 mL Tampon A'da yeniden askıya alın ve 1.100 psi'de bir Fransız basınç hücresi kullanarak hücreleri kırın, lized rengi beyaz ışık altında yeşilden kırmızı-mavi-yeşile değişene kadar işlemi 3x tekrarlayın (protein denatürasyonunu önlemek için numuneyi her döngü arasında buz üzerine koyun). Önceden soğutulmuş bir hücre kullanın ve bu adımı soğuk odada gerçekleştirin.
   4. Elde edilen homojenatı her tüpte maksimum 2,5 mL'ye kadar doldurulmuş sekiz adet 3 mL ultrasantrifüj tüpü arasında dağıtın ve ardından 400 μL orta R ile dikkatlice kaplayarak bir adım gradyanı üretin.
      NOT: Sakkaroz gradyan preparatı^25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang, et al. ve Kelekar^, et al.
   5. Gerektiğinde ilave orta R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin ve 4 ° C'de 150.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Tilakoid ve diğer ağır organeller (herhangi bir polihidroksiyalkanoat cismi dahil) pelet olurken, plastoglobüller sakkaroz gradyanının üstünde veya yakınında sarı, yağlı bir ped olarak kolayca görülecektir (Şekil 1C).
   6. Elde edilen ham plastoglobüllerin yüzer pedini bir şırınga ve 22G iğne ile hasat edin ve 2 mL'lik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri ultrasantrifüj tüp duvarının yan tarafından gerekirse iğne ucu ile kazıyın.
   7. Adım 2.2'ye geçin. Alternatif olarak, ham plastoglobülleri -80 ° C'de saklayın ve daha sonra saflaştırın.

2. Saf plastoglobüllerin toplanması

1. Bitki dokusu işleme
   1. Toplam 1 mL hacme ulaşmak için adım 1.1 veya adım 1.2'den 500 μL ham plastoglobüllerle 500 μL ham plastoglobüllerle katmanlanarak 2.5 mL ultrasantrifüj tüplerinde sakkaroz gradyanları üretin, toplam 1 mL'lik bir hacme getirin, ardından 400 μL orta R 0.2 ile örtün, ardından 400 μL orta R ile üst üste bindirildi.
      NOT: Sakkaroz gradyan preparatı^25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang ve ark. ve Kelekar ve ark.'ya bakınız.
   2. Gerektiğinde üst katmana fazla orta R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin. Daha sonra 4 ° C'de 1,5 saat boyunca 150.000 x g'de santrifüj yapın.
   3. Elde edilen yüzer saf plastoglobüllerin (Şekil 1A) pedini bir şırınga ve 22G iğne ile toplayın ve 2 mL'lik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri gerekirse iğne ucu ile santrifüj tüpü duvarının üstünden kazıyın.
   4. Aliquot saf plastoglobüller ve flaş sıvı azot içinde donar. Doğrudan -80 ° C'de saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.
2. Siyanobakterilerin işlenmesi
   1. İlk önce 1.3. adımdan itibaren ham plastoglobüllerin 500 μL'si ile katmanlanmış dört adet 2.5 mL ultrasantrifüj tüpünde bir sakkaroz gradyanı üretin, ardından 750 μL orta R 0.2 ile örtün.
      NOT: Sakkaroz gradyan preparatı^25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang ve ark. ve Kelekar ve ark.'ya bakınız.
   2. Sakkaroz gradyanını 4 ° C'de 90 dakika boyunca 150.000 x g'de santrifüj yapın. Saf plastoglobülleri (Şekil 1C) bir şırınga ve 22 G iğne ile sakkaroz gradyanının üst fazından toplayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   3. Saf plastoglobülleri aliquot ve sıvı azotta flaş-dondurun. Doğrudan -80 ° C'de saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.

Sonuçlar

Protokolün 1. adımının tamamlanmasının ardından, sakkaroz yastığının üst tabakası üzerinde (veya yakınında) yüzen önemli miktarda plastoglobül/lipit damlacık materyali kolayca görülebilmelidir (Şekil 1B-C). Bu aşamada diğer fraksiyonlar da toplanabilir. Örneğin, tilakoidler peletlenecek ve sonraki analizler için orta R 0.2 ile yeniden askıya alınabilir. Sonraki santrifüjlemeden sonra, Şekil 1A,

Tartışmalar

Malzemedeki fizyolojik / biyokimyasal değişiklikleri en aza indirmek ve plastoglobüllerin zengin bir bileşeni olan bazı foto-ve termo-kararsız prenil-lipid pigmentlerini korumak için, izolasyonun 4 ° C'de yapılması ve ışıktan korunması kritik öneme sahiptir. Yukarıda belirtildiği gibi, ilk adımlar soğuk odada yeşil yayan bir ampul kullanılarak bir güvenlik lambasının altında gerçekleştirilir. Laboratuvarda gerçekleştirilen sonraki adımlar soluk ışıklar altındadır ve buz veya soğutulmu?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A