Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

요약

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

초록

Plastoglobule 지질 방울은 식물 엽록체와 시아 노 박테리아의 동적 하위 구획입니다. 광합성 종들 사이에서 유비쿼터스로 발견되는 그들은 빠르게 변화하는 환경 조건에서 틸라코이드 막의 적응 및 리모델링에 중심적인 역할을 하는 것으로 믿어집니다. 고순도의 플라스토글로블을 분리할 수 있는 능력은 단백질체, 지질 및 기타 방법론을 통해 연구를 크게 촉진했습니다. 고순도 및 수율의 플라스토글로블을 사용하면 다른 가능한 분자 특성 중에서 지질 및 단백질 조성, 효소 활성 및 단백질 토폴로지를 조사할 수 있습니다. 이 기사는 식물 잎 조직의 엽록체에서 플라스토글로불을 분리하기 위한 신속하고 효과적인 프로토콜을 제시하고 옥수수 잎, 부활 식물의 건조된 잎 조직, Eragrostis nindensis 및 시아노박테리움, Synechocystis 에서 플라스토글로블 및 관련 지질 방울 구조를 분리하기 위한 방법론적 변형을 제시합니다. PCC 6803. 분리는 이러한 지질이 풍부한 입자의 낮은 밀도에 의존하며, 이는 자당 밀도 부유선광에 의한 정제를 용이하게 합니다. 이 방법론은 다양한 종의 플라스토글로블 연구에 가치가 있음이 입증될 것입니다.

서문

플라스토글로불 구성 및 기능에 대한 현재의 이해는 상세한 단백질체학 및 지질체 연구 ^1,2,3,4,5를 통해 나타났습니다. 이러한 연구는 자당 구배를 사용하여 효율적인 분리를 위해 매우 낮은 밀도에 의존하는 신속하고 효과적인 분리 방법에 의해 크게 도움이되었습니다. 너도밤 나무 (Fagus sylvatica), 스카치 빗자루 (Sarothamnus scoparius), 양파 (부추 속 세파), 시금치 (Spinacia oleracea), 팬지 (비올라 삼색), 후추 (고추 일년) 및 완두콩 (Pisum sativum⁾6,7,8,9,10,11

프로토콜

1. 원유 플라스토글로블 분리

1. 스트레스를받지 않은 옥수수 잎 조직에서 추출한 원유 플라스토글로블 추출
   1. 약 3 주 된 6 개의 건강한 옥수수 묘목을 획득하고 거의 V5 성장 단계에 있으며 무게는 약 120g입니다.
   2. 줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 얼음 욕조에 빠르게 담그고 차가운 방으로 옮깁니다.
   3. 녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥수수 잎을 제거하고 가위를 사용하여 더 작은 조각 (약 5cm x 5cm)으로 자릅니다.
   4. 350mL의 분쇄 완충액에 상업용 블렌더에서 잘린 잎 조직의 절반을 부드럽지만 철저히 분쇄합니다(표 1). 블렌더 5x-6x를 시작하여 모든 잎이 잘리는지 확인하십시오. 블렌더에서 레벨 7 이상을 사용하지 마십시오.
   5. 큰 깔때기에 있는 25μm 나일론 천의 한 층을 통해 균질액을 4개의 250mL 원심분리기 병으로 여과합니다. 그런 다음 잘린 잎 조직의 후반부에 대해 1.1.4단계를 반복합니다.
   6. 여과액을 4개의 병 사이에 고르게 나누고 4°C에서 1,840 x g 에서 6분 동안 원심분리합니다. 잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 전체 잎 샘플로서 저....

결과

프로토콜의 단계 1이 완료되면, 상당한 양의 플라스토글로불/지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층 상(또는 그 근처)에 떠 있는 것을 쉽게 볼 수 있어야 한다(도 1B-C). 이 단계에서 다른 분획도 수집 할 수 있습니다. 예를 들어, 틸라코이드는 펠릿화되고 후속 분석을 위해 중간 R 0.2로 재현탁될 수 있습니다. 후속 원심분리 후, 정제 된 플라스토 글?.......

토론

재료의 생리적/생화학적 변화를 최소화하고 플라스토글로불의 풍부한 성분인 특정 광학적 및 열에 불안정한 프레닐 지질 안료를 보호하려면 4°C에서 분리를 수행하고 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 위에서 지적한 바와 같이, 초기 단계는 녹색 발광 전구를 사용하여 안전 램프 아래의 냉장실에서 수행됩니다. 실험실에서 수행되는 후속 단계는 희미한 조명 아래에서 얼음 또는 냉장 원심 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A