Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

요약

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

초록

Plastoglobule 지질 방울은 식물 엽록체와 시아 노 박테리아의 동적 하위 구획입니다. 광합성 종들 사이에서 유비쿼터스로 발견되는 그들은 빠르게 변화하는 환경 조건에서 틸라코이드 막의 적응 및 리모델링에 중심적인 역할을 하는 것으로 믿어집니다. 고순도의 플라스토글로블을 분리할 수 있는 능력은 단백질체, 지질 및 기타 방법론을 통해 연구를 크게 촉진했습니다. 고순도 및 수율의 플라스토글로블을 사용하면 다른 가능한 분자 특성 중에서 지질 및 단백질 조성, 효소 활성 및 단백질 토폴로지를 조사할 수 있습니다. 이 기사는 식물 잎 조직의 엽록체에서 플라스토글로불을 분리하기 위한 신속하고 효과적인 프로토콜을 제시하고 옥수수 잎, 부활 식물의 건조된 잎 조직, Eragrostis nindensis 및 시아노박테리움, Synechocystis 에서 플라스토글로블 및 관련 지질 방울 구조를 분리하기 위한 방법론적 변형을 제시합니다. PCC 6803. 분리는 이러한 지질이 풍부한 입자의 낮은 밀도에 의존하며, 이는 자당 밀도 부유선광에 의한 정제를 용이하게 합니다. 이 방법론은 다양한 종의 플라스토글로블 연구에 가치가 있음이 입증될 것입니다.

서문

플라스토글로불 구성 및 기능에 대한 현재의 이해는 상세한 단백질체학 및 지질체 연구 ^1,2,3,4,5를 통해 나타났습니다. 이러한 연구는 자당 구배를 사용하여 효율적인 분리를 위해 매우 낮은 밀도에 의존하는 신속하고 효과적인 분리 방법에 의해 크게 도움이되었습니다. 너도밤 나무 (Fagus sylvatica), 스카치 빗자루 (Sarothamnus scoparius), 양파 (부추 속 세파), 시금치 (Spinacia oleracea), 팬지 (비올라 삼색), 후추 (고추 일년) 및 완두콩 (Pisum sativum⁾6,7,8,9,10,11 ,^12,13. 엽록체 플라스토글로블을 보다 효율적이고 더 나은 수율 방식으로 분리하는 업데이트된 방법이 나중에 Ytterberg et al.3,14에 의해 제시되었습니다. 처음에는 Arabidopsis thaliana 잎 엽록체의 플라스토글로블 연구에 사용되었지만 옥수수(Zea mays), 토마토(Solanum lycopersicum), 러브그래스(Eragrostis nindensis), 보라색 거짓 브롬(Brachypodium distachyon) 및 야생 담배(Nicotiana benthamiana)를 포함한 다른 식물 종의 건강한 잎 조직에 이 업데이트된 방법을 성공적으로 사용했습니다. ; 미공개 결과). 또한, 분리 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Anabaena sp. PCC 7120¹⁵를 포함한 시아 노 박테리아의 플라 스토 글로 블과 부활 식물 인 E. nindensis의 건조 된 잎 조직에 성공적으로 적용되었습니다.

건강한 잎 조직의 엽록체 플라스토글로블은 틸라코이드 막(¹⁶)에 물리적으로 연결되어 있다. 이러한 물리적 연속성에도 불구하고, 2개의 엽록체 서브-구획은 뚜렷한 지질 및 단백질 조성을 유지하지만, 2개의 구획 사이의 지질과 단백질의 조절된 교환이 제안되었다 2,4,17,18,19. 사실, 흥미로운 반 융합 모델이 최근 엽록체와 세포질¹⁹ 사이의 중성 지질 밀매에 대해 제안되었습니다. 플라스토글로블과 틸라코이드의 물리적 연속성으로 인해, 건강한 잎 조직을 이용한 분리 방법은 펠렛화된 조잡한 틸라코이드 제제의 수집으로 시작되며, 이어서 초음파 처리되어 플라스토글로블을 틸라코이드로부터 분리하는데, 이는 세포질 지질 방울을 분리하는 데 사용되는 방법과 대조된다²⁰ . 그런 다음 자당 쿠션에서 초원심분리하면 저밀도 플라스토글로블이 자당을 통해 위로 떠올라 틸라코이드, 핵 및 기타 고밀도 물질에서 효과적으로 분리됩니다. 대조적으로, 시아노박테리아의 플라스토글로구와 건조된 잎 조직의 플라스토글로불은 생체 내에서 자유롭게 떠다니는 형태로 존재하는 것 같습니다. 따라서 이들의 격리에는 자당 구배에 직접 떠 있는 것이 포함됩니다. 이 기사는 건강한 잎 조직에서 분리 방법을 보여주고 건조 된 잎 조직 또는 시아 노 박테리아 배양에서 플라 스토 글로 블을 분리하는 데 사용할 수있는 두 가지 변형을 보여 주어 플라 스토 글로 불을 연구 할 수있는 생리 학적 폭과 진화 적 맥락을 크게 확장합니다.

분리된 플라스토글로불은 분자 특성을 조사하기 위해 여러 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 우리는 다양한 환경 조건 또는 유전자형에서 광범위한 단백질체 및 지질체 분석을 위해 A. thaliana 잎 조직에서 분리된 플라스토글로불을 사용하여 스트레스 2,4,21,22에 적응하여 단백질 및 지질 조성의 선택적 변형을 입증했습니다. 또한, 단리된 플라스토글로불과의 연관된 트랜스-인산화 활성을 입증하는 시험관내 키나아제 분석이 수행되었고(22), 단백질 성분의 올리고머 상태가 천연 겔 전기영동(²¹)을 사용하여 조사되었으며, 프로테아제-면도 분석(²³)이 수행되었다.

이 방법의 주요 이점은 절차의 상대적 속도입니다. 경험상 아래에 설명된 프로토콜은 약 4시간 이내에 완전히 완료될 수 있습니다. 잎 조직으로부터 플라스토글로불을 단리하는 대안적인 방법이 설명되었으며, 이는 다른 엽록체 하위구획(²⁴)의 동시 단리를 허용한다. 이 대안적인 방법은 다른 엽록체 하위 구획과의 정량적 비교가 필요하거나 원할 때 몇 가지 분명한 이점을 제공합니다. 그러나,이 대체 방법은 또한 더 지루하며 비슷한 양의 잎 조직으로부터 분리 된 플라스토 글로 블의 수율을 상당히 낮출 것이다. plastoglobules에 대한 집중적 인 연구가 목표 인 경우 여기에 설명 된 방법론이 최적의 선택입니다. 그럼에도 불구하고 샘플 준비 중에 총 잎 및 미정제 틸라코이드 분취량을 수집할 수 있으며 후속 비교를 위해 참조 샘플을 확보하는 것이 좋습니다.

프로토콜

1. 원유 플라스토글로블 분리

1. 스트레스를받지 않은 옥수수 잎 조직에서 추출한 원유 플라스토글로블 추출
   1. 약 3 주 된 6 개의 건강한 옥수수 묘목을 획득하고 거의 V5 성장 단계에 있으며 무게는 약 120g입니다.
   2. 줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 얼음 욕조에 빠르게 담그고 차가운 방으로 옮깁니다.
   3. 녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥수수 잎을 제거하고 가위를 사용하여 더 작은 조각 (약 5cm x 5cm)으로 자릅니다.
   4. 350mL의 분쇄 완충액에 상업용 블렌더에서 잘린 잎 조직의 절반을 부드럽지만 철저히 분쇄합니다(표 1). 블렌더 5x-6x를 시작하여 모든 잎이 잘리는지 확인하십시오. 블렌더에서 레벨 7 이상을 사용하지 마십시오.
   5. 큰 깔때기에 있는 25μm 나일론 천의 한 층을 통해 균질액을 4개의 250mL 원심분리기 병으로 여과합니다. 그런 다음 잘린 잎 조직의 후반부에 대해 1.1.4단계를 반복합니다.
   6. 여과액을 4개의 병 사이에 고르게 나누고 4°C에서 1,840 x g 에서 6분 동안 원심분리합니다. 잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 전체 잎 샘플로서 저장하기 위해 원심분리 전에 따로 보관한다.
   7. 생성된 상청액을 붓고, 브러시를 부드럽게 움직이면서 소용돌이 치고 재현탁하여 0.2M 슈크로스를 함유하는 배지 R 0.2 12mL에 펠릿을 부드럽게 재현탁시킨다(표 1). 각 펠릿을 재현탁한 후 현탁액을 다음 병으로 옮기고 재현탁을 반복합니다. 서스펜션을 한 병에 모으십시오.
   8. 풀링된 현탁액을 6개의 3mL 초원심분리 튜브 사이에 분배하여 각 튜브에서 최대 부피 2.5mL에 도달합니다.
   9. 각 튜브를 4x, 매번 10 초 동안, 팁 초음파 처리기를 사용하여 100 %. 거품을 방지하기 위해 초음파 처리기 혼을 물에 잠기고 액체 표면에서 멀리 두십시오.
   10. 각 라운드 동안 서스펜션 내에서 초음파 처리기 혼을 위아래로 천천히 움직입니다. 4 개의 튜브를 번갈아 가며 각 초음파 처리 후 각 튜브를 얼음 양동이에 돌려 샘플을 식힐 수 있습니다.
   11. 초음파 처리된 조 틸라코이드 현탁액을 4°C에서 30분 동안 150,000 x g 에서 원심분리한다. 주사기 및 22G 바늘을 사용하여 자당 쿠션의 표면으로부터 원유 플라스토글로불의 생성된 플로팅 패드를 수확하고, 바늘의 개구부로 쿠션의 표면을 스키밍하여 각 튜브로부터 약 500μL를 회수한다. 2.0 mL 튜브에 담습니다.
   12. plastoglobules의 초음파 처리 및 방출 전후에 원유 틸라코이드의 분취량을 수집하십시오. 2.1단계를 계속합니다. 또는 미정제 플라스토글로블을 -80°C에 보관하고 나중에 정제하십시오.
2. 건조된 E. nindensis 잎 조직에서 추출한 원유 플라스토글로불 추출
   1. 완전히 건조 된 8-9 주 된 E. nindensis (거의 40g의 조직)의 화분 (화분 당 3 개의 개별 식물로 구성)을 얻습니다.
   2. 가위를 사용하여 토양 바로 위의 식물 바닥에서 모든 잎 조직을 잘라 내고 즉시 얼음 욕조에 조직을 담그십시오. 조직을 차가운 방으로 운반하십시오.
   3. 녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 E를 자르십시오. 닌덴시스는 가위를 사용하여 더 작은 조각(약 5cm x 5cm)으로 잎을 남깁니다.
   4. 상업용 블렌더에서 100mL의 분쇄 완충액 (표 1)으로 잎을 부드럽지만 철저히 분쇄합니다. 블렌더를 여러 번 시작하여 모든 잎이 잘리는지 확인하십시오. 블렌더에서 레벨 7 이상을 사용하지 마십시오.
   5. 큰 깔때기에 있는 25μm 나일론 천의 한 층을 통해 균질액을 250mL 원뿔형 플라스크로 여과합니다. 잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 전체 잎 샘플로서 저장하기 위해 원심분리 전에 따로 보관한다.
   6. 적절한 양의 자당을 첨가하여 최종 농도 0.5M이 되도록 하고 용액을 250mL 원심분리 튜브에 분배합니다.
      참고: Z. mays 준비에 비해 더 높은 농도의 자당은 틸라코이드 결합 플라스토글로불의 후속 초음파 처리/방출 전에 세포질 지질 방울의 부유선을 보장하는 데 사용됩니다.
   7. 튜브를 45,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 플라스토글로불 및 세포질 지질 방울의 혼합물은 자당 쿠션의 표면 위 또는 그 근처에서 노란색의 기름진 패드로 쉽게 볼 수 있습니다(그림 1B). 바늘의 개구부로 쿠션의 표면을 훑어내어 22G 바늘이 있는 주사기를 사용하여 부유 물질을 수집하고 튜브에 침전합니다.
   8. 자유 부유 플라스토글로불/지질 액적 혼합물을 수집한 후 나머지 상청액을 폐기하십시오.
   9. 잔류 틸라코이드에 연결된 플라스토글로우를 분리하려면 브러시를 부드럽게 움직여 소용돌이 치고 다시 현탁하여 12mL의 배지 R 0.2에 펠릿을 다시 현탁합니다. 서스펜션을 한 병에 모으십시오. 1.1.8단계를 계속합니다.
3. 시아노박테리아에서 추출한 원유 플라스토글로블 추출
   1. Synechocystis sp. PCC 6803의 50mL 배양액을 고정상(약 7-10일)으로 성장시키고 분광 광도계를 사용하여 세포 밀도를 OD₇₅₀ 2.0으로 조정합니다. 배양 조건의 경우 BG-11 배지를 사용하고 150μmol 광자/^m2/s, 2%_CO2, 32°C의 광도로 150rpm에서 연속 진탕으로 인큐베이터에서 성장합니다.
   2. 다당류를 제거하기 위해, 배양된 50 mL를 6,000 x g 에서 4°C에서 45분 동안 원심분리하여 세포를 세척하고, 이어서 상청액을 제거하였다. 세포를 완충액 A 50 mL에서 2회 세척하여 계속한다(표 1). 세포 균질액의 분취량을 제거하고 원심분리 전에 따로 보관하여 대표적인 전체 세포 샘플로 보관합니다.
   3. 세척된 펠릿을 25mL의 완충액 A에 재현탁하고 1,100psi의 프렌치 압력 셀을 사용하여 세포를 분해하고 용해된 색상이 백색광 아래에서 녹색에서 빨간색-파란색-녹색으로 변할 때까지 과정을 3x 반복합니다(단백질 변성을 피하기 위해 각 주기 사이에 샘플을 얼음에 놓음). 사전 냉각 된 셀을 사용하고 냉장실에서이 단계를 수행하십시오.
   4. 생성된 균질액을 각 튜브에 최대 2.5mL까지 채워진 8개의 3mL 초원심분리 튜브 사이에 분배한 다음 400μL의 배지 R로 조심스럽게 오버레이하여 단계 그래디언트를 생성합니다.
      참고: 자당 구배 준비^25,26에 대한 자세한 설명은 Yang, et al. 및 Kelekar^, et al.을 참조하십시오.
   5. 필요에 따라 매체 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 맞추고 4°C에서 150,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다. 틸라코이드 및 기타 더 무거운 세포 기관 (폴리 하이드 록시 알카 노 에이트 체 포함)은 펠릿을 사용하는 반면, 플라스토 글로불은 자당 구배의 상단 또는 그 근처에서 노란색의 기름진 패드로 쉽게 볼 수 있습니다 (그림 1C).
   6. 주사기와 22G 바늘로 원유 플라스토글로불의 플로팅 패드를 수확하고 2mL 튜브에 침전시킵니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 초원심분리기 튜브 벽의 측면에서 플라스토글로블을 긁어냅니다.
   7. 2.2단계를 계속합니다. 또는 조 플라스토글로블을 -80°C에 보관하고 나중에 정제하십시오.

2. 순수한 플라스토글로블 수확

1. 식물 조직 가공
   1. 500μL의 배지 R 0.7과 혼합된 1.1단계 또는 1.2단계의 미정제 플라스토글로불 500μL로 먼저 적층하여 2.5mL 초원심분리 튜브에서 자당 구배를 생성하여 총 부피 1mL가 되도록 한 다음 400μL의 배지 R 0.2로 오버레이한 다음 400μL의 배지 R로 오버레이합니다.
      참고: 자당 구배 준비^25,26에 대한 자세한 설명은 Yang et al. 및 Kelekar et al.을 참조하십시오.
   2. 필요에 따라 상단 레이어에 과도한 매체 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 잡습니다. 그런 다음 4°C에서 1.5시간 동안 150,000 x g 로 원심분리합니다.
   3. 주사기와 22G 바늘로 순수한 플라스토글로불(그림 1A)의 플로팅 패드를 수확하고 2mL 튜브에 침전시킵니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 원심 분리기 튜브 벽 상단에서 플라스토글로블을 긁어냅니다.
   4. 순수한 플라스토글로불을 분취하여 액체 질소에서 급속 동결시킵니다. -80 °C에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결 건조하십시오.
2. 시아노박테리아 가공
   1. 750μL의 배지 R 0.7과 혼합된 단계 1.3의 미정제 플라스토글로불 500μL로 먼저 적층된 4개의 2.5mL 초원심분리 튜브에서 자당 구배를 생성한 다음 750μL의 배지 R 0.2로 오버레이합니다.
      참고: 자당 구배 준비^25,26에 대한 자세한 설명은 Yang et al. 및 Kelekar et al.을 참조하십시오.
   2. 자당 구배를 150,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 원심분리합니다. 자당 구배의 상단 단계에서 주사기와 22G 바늘로 순수한 플라스토글로불(그림 1C)을 수집하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   3. 순수한 플라스토글로불을 분취하고 액체 질소에서 급속 동결합니다. -80 ° C에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결 건조하십시오.

결과

프로토콜의 단계 1이 완료되면, 상당한 양의 플라스토글로불/지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층 상(또는 그 근처)에 떠 있는 것을 쉽게 볼 수 있어야 한다(도 1B-C). 이 단계에서 다른 분획도 수집 할 수 있습니다. 예를 들어, 틸라코이드는 펠릿화되고 후속 분석을 위해 중간 R 0.2로 재현탁될 수 있습니다. 후속 원심분리 후, 정제 된 플라스토 글?...

토론

재료의 생리적/생화학적 변화를 최소화하고 플라스토글로불의 풍부한 성분인 특정 광학적 및 열에 불안정한 프레닐 지질 안료를 보호하려면 4°C에서 분리를 수행하고 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 위에서 지적한 바와 같이, 초기 단계는 녹색 발광 전구를 사용하여 안전 램프 아래의 냉장실에서 수행됩니다. 실험실에서 수행되는 후속 단계는 희미한 조명 아래에서 얼음 또는 냉장 원심 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A