Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобулы липидных капель, связанных с различными фотосинтезирующими организмами. Успешное получение изолированных пластоглобул является важным первым шагом, который предшествует подробным молекулярным исследованиям, таким как протеомный и липидомический анализы.
Капли липидов пластоглобул являются динамическим субкомпоном растительных хлоропластов и цианобактерий. Считается, что они повсеместно встречаются среди фотосинтезирующих видов и играют центральную роль в адаптации и ремоделировании тилакоидной мембраны в быстро меняющихся условиях окружающей среды. Способность выделять пластоглобулы высокой чистоты значительно облегчила их изучение с помощью протеомных, липидомных и других методологий. С пластоглобулами высокой чистоты и выхода можно исследовать их липидный и белковый состав, ферментативную активность и топологию белка, среди других возможных молекулярных характеристик. В данной статье представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобул из хлоропластов ткани листьев растений и представлены методологические вариации выделения пластоглобул и связанных с ними липидных капельных структур из листьев кукурузы, высохшей листовой ткани воскрешающего растения Eragrostis nindensis и цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Изоляция зависит от низкой плотности этих богатых липидами частиц, что облегчает их очистку флотации плотности сахарозы. Эта методология окажется полезной при изучении пластоглобул различных видов.
Современное понимание состава и функции пластоглобул появилось благодаря подробным протеомным и липидомическим исследованиям 1,2,3,4,5. Таким исследованиям в значительной степени способствовал быстрый и эффективный метод изоляции, который опирается на их очень низкую плотность для эффективного разделения с использованием градиентов сахарозы. Первоначальные методы выделения пластоглобул были достигнуты из таких видов, как буковое дерево (Fagus sylvatica), шотландский веник (Sarothamnus scoparius), лук (Allium cepa), шпинат (Spinacia oleracea), анютины глазки (Viola tricolor), перец (Capsicum annuum) и горох (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Обновленный метод выделения хлоропластобул более эффективным и лучшим способом получения урожая был позднее представлен Ytterberg et al.3,14. Хотя первоначально мы использовались для изучения пластоглобул хлоропластов листьев Arabidopsis thaliana, мы успешно использовали этот обновленный метод для здоровой листовой ткани других видов растений, как монокота, так и дикота, включая кукурузу (Zea mays), помидор (Solanum lycopersicum), лавграсс (Eragrostis nindensis), фиолетовый ложный бром (Brachypodium distachyon) и дикий табак (Nicotiana benthamiana). ; неопубликованные результаты). Кроме того, метод выделения был успешно адаптирован к пластоглобулам цианобактерий, включая Synechocystis sp. PCC 6803 и Anabaena sp. PCC 712015, а также к высохшей листовой ткани воскрешающего растения E. nindensis.
Хлоропластовые пластоглобулы здоровой ткани листа физически соединены с тилакоидными мембранами16. Несмотря на эту физическую непрерывность, два субкомпамента хлоропластов сохраняют различные липидные и белковые композиции, хотя регулируемый обмен липидами и белками между двумя компартментами был предложен 2,4,17,18,19. На самом деле, недавно была предложена интересная модель гемифузии для обмена нейтральными липидами между хлоропластами и цитозолом19. Из-за физической непрерывности пластоглобул и тилакоидов метод выделения со здоровой тканью листьев начинается со сбора гранулированного сырого тилакоидного препарата, который впоследствии обрабатывают ультразвуком для отделения пластоглобул от тилакоидов, что в отличие от методов, используемых для выделения цитозольных липидных капель20 . Ультрацентрифугирование на сахарозной подушке затем запускает пластоглобулы низкой плотности вверх через сахарозу, эффективно отделяя их от тилакоидов, ядер и другого материала высокой плотности. Напротив, пластоглобулы в цианобактериях, а также в высохшей ткани листа, очевидно, существуют in vivo в свободно плавающей форме. Следовательно, их изоляция включает в себя непосредственное плавание на градиенте сахарозы. Эта статья демонстрирует метод выделения из здоровой листовой ткани и дополнительно демонстрирует две вариации, которые могут быть использованы для выделения пластоглобул из высохшей листовой ткани или цианобактериальных культур, значительно расширяя физиологическую широту и эволюционный контекст, в котором пластоглобулы могут быть изучены.
Изолированные пластоглобулы могут впоследствии использоваться для любого количества последующих анализов для исследования молекулярных характеристик. Мы использовали выделенные пластоглобулы из ткани листьев A. thaliana для обширного протеомного и липидомического анализа в различных условиях окружающей среды или генотипах, демонстрируя селективную модификацию белкового и липидного состава при адаптации к стрессу 2,4,21,22. Кроме того, были проведены анализы киназы in vitro, которые демонстрируют активность трансфосфорилирования, связанную с изолированными пластоглобулами, 22, олигомерные состояния белковых компонентов были исследованы с использованием нативного гелевого электрофореза 21 и протеазно-бритвенные анализы были выполнены23.
Основным преимуществом этого метода является относительная скорость процедуры. По нашему опыту, протоколы, описанные ниже, могут быть полностью завершены в течение примерно 4 часов. Описан альтернативный способ выделения пластоглобул из листовой ткани, который позволяет одновременно выделять другие подкомпоны24 хлоропласта. Этот альтернативный метод дает некоторые явные преимущества, когда количественное сравнение с другими подотсеками хлоропласта необходимо или желательно. Однако этот альтернативный метод также более утомителен и обеспечит значительно более низкий выход изолированных пластоглобул из сопоставимых количеств листовой ткани. Когда целью является целенаправленное изучение пластоглобул, методология, изложенная здесь, является оптимальным выбором. Тем не менее, общее количество листовых и сырых тилакоидных аликвот может быть собрано во время подготовки образца, и настоятельно рекомендуется сделать это, чтобы иметь эталонные образцы для последующего сравнения.
1. Выделение сырой пластоглобулы
2. Сбор чистых пластоглобул
По завершении этапа 1 протокола следует легко увидеть значительное количество пластоглобулы/липидного капельного материала, плавающего на верхнем слое сахарозной подушки (или рядом с ним) (рис. 1В-С). Другие фракции также могут быть собраны на этом этап...
Чтобы свести к минимуму физиологические/биохимические изменения материала и защитить определенные фото- и термолабильные прениллипидные пигменты, которые являются богатым компонентом пластоглобул, крайне важно выполнить изоляцию при 4 °C и защитить от света. Как указано выше, начальн...
Никаких конфликтов интересов для декларирования.
Исследования в лабораторной группе Лундквиста поддерживаются грантами NSF (MCB-2034631) и USDA (MICL08607) P.K.L. Авторы благодарят доктора Кэрри Хизер (МГУ) за поддержку в разработке метода выделения цианобактериальных пластоглобул.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
Zea mays | N/A | N/A |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены