Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries

Résumé

Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques de Plastoglobule sont un sous-compartiment dynamique des chloroplastes et des cyanobactéries des plantes. Présents partout parmi les espèces photosynthétiques, on pense qu’ils jouent un rôle central dans l’adaptation et le remodelage de la membrane thylakoïde dans des conditions environnementales en évolution rapide. La capacité d’isoler des plastoglobules de haute pureté a grandement facilité leur étude grâce à des méthodologies protéomiques, lipidomiques et autres. Avec des plastoglobules de grande pureté et de rendement, il est possible d’étudier leur composition lipidique et protéique, leur activité enzymatique et leur topologie protéique, entre autres caractéristiques moléculaires possibles. Cet article présente un protocole rapide et efficace pour l’isolement des plastoglobules à partir de chloroplastes de tissus foliaires végétaux et présente des variations méthodologiques pour l’isolement des plastoglobules et des structures de gouttelettes lipidiques apparentées à partir de feuilles de maïs, du tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, Eragrostis nindensis, et de la cyanobactérie, Synechocystis . sp. PCC 6803. L’isolement repose sur la faible densité de ces particules riches en lipides, ce qui facilite leur purification par flottation de densité saccharose. Cette méthodologie s’avérera utile dans l’étude des plastoglobules de diverses espèces.

Introduction

La compréhension actuelle de la composition et de la fonction des plastoglobules a émergé grâce à des études protéomiques et lipidomiques détaillées 1,2,3,4,5. De telles études ont été grandement facilitées par une méthode d’isolement rapide et efficace qui repose sur leur très faible densité pour une séparation efficace à l’aide de gradients de saccharose. Les méthodes initiales d’isolement des plastoglobules ont été réalisées à partir d’espèces telles que le hêtre (Fagus sylvatica), le genêt à balais (Sarothamnus scoparius), l’oignon (Allium cepa), les épinards (Spinacia oleracea), la pensée (Viola tricolor), le poivre (Capsicum annuum) et le pois (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,^12,13. Une méthode mise à jour pour isoler les plastoglobules chloroplastiques d’une manière plus efficace et plus efficace a été présentée plus tard par Ytterberg et ^coll.3,14. Alors qu’initialement utilisé pour l’étude des plastoglobules des chloroplastes des feuilles d’Arabidopsis thaliana, nous avons utilisé avec succès cette méthode mise à jour pour les tissus foliaires sains d’autres espèces végétales, à la fois monocotylédones et dicotylédones, y compris le maïs (Zea mays), la tomate (Solanum lycopersicum), l’herbe d’amour (Eragrostis nindensis), le faux brome pourpre (Brachypodium distachyon) et le tabac sauvage (Nicotiana benthamiana ; résultats non publiés). De plus, la méthode d’isolement a été adaptée avec succès aux plastoglobules des cyanobactéries, y compris Synechocystis sp. PCC 6803 et Anabaena sp. PCC 7120¹⁵, et au tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, E. nindensis.

Les plastoglobules chloroplastiques du tissu foliaire sain sont physiquement connectés aux membranes thylakoïdes¹⁶. Malgré cette continuité physique, les deux sous-compartiments chloroplastiques conservent des compositions lipidiques et protéiques distinctes, bien que l’échange régulé de lipides et de protéines entre les deux compartiments ait été proposé 2,4,17,18,19. En fait, un modèle d’hémifusion intéressant a récemment été proposé pour le trafic de lipides neutres entre les chloroplastes et le cytosol¹⁹. En raison de la continuité physique des plastoglobules et des thylakoïdes, la méthode d’isolement avec du tissu foliaire sain commence par la collecte d’une préparation de thylakoïdes bruts en granulés, qui est ensuite soniquée pour séparer les plastoglobules des thylakoïdes, contrairement aux méthodes utilisées pour isoler les gouttelettes lipidiques cytosoliques²⁰ . L’ultracentrifugation sur un coussin de saccharose fait ensuite flotter les plastoglobules de faible densité à travers le saccharose, les séparant efficacement des thylakoïdes, des noyaux et d’autres matériaux à haute densité. En revanche, les plastoglobules dans les cyanobactéries, ainsi que ceux des tissus foliaires desséchés, existent évidemment in vivo sous une forme flottante librement. Par conséquent, leur isolement implique de flotter directement sur un gradient de saccharose. Cet article démontre la méthode d’isolement à partir de tissus foliaires sains et démontre en outre deux variantes qui peuvent être utilisées pour isoler des plastoglobules à partir de tissus foliaires desséchés ou de cultures de cyanobactéries, élargissant considérablement l’étendue physiologique et le contexte évolutif dans lequel les plastoglobules peuvent être étudiés.

Les plastoglobules isolés peuvent ensuite être utilisés pour un certain nombre d’analyses en aval afin d’étudier les caractéristiques moléculaires. Nous avons utilisé les plastoglobules isolés du tissu foliaire d’A. thaliana pour une analyse protéomique et lipidomique approfondie dans différentes conditions environnementales ou génotypes, démontrant la modification sélective de la composition protéique et lipidique en adaptation au stress 2,4,21,22. En outre, des essais in vitro kinases démontrant une activité de transphosphorylation associée à des plastoglobules isolés ont été effectués²², les états oligomères des composants protéiques ont été étudiés à l’aide de l’électrophorèse sur gel ^{natif 21} et des tests de rasage de protéase ont été effectués²³.

Le principal avantage de cette méthode est la vitesse relative de la procédure. D’après notre expérience, les protocoles décrits ci-dessous peuvent être entièrement complétés en environ 4 heures. Une autre méthode pour isoler les plastoglobules du tissu foliaire a été décrite, ce qui permet l’isolement simultané d’autres sous-compartiments chloroplastiques²⁴. Cette méthode alternative offre des avantages évidents lorsque la comparaison quantitative avec les autres sous-compartiments chloroplastiques est nécessaire ou souhaitée. Cependant, cette méthode alternative est également plus fastidieuse et fournira un rendement significativement plus faible de plastoglobules isolés à partir de quantités comparables de tissu foliaire. Lorsqu’une étude ciblée des plastoglobules est l’objectif, la méthodologie décrite ici est le choix optimal. Néanmoins, des aliquotes totales de feuilles et de thylakoïdes bruts peuvent être recueillies pendant la préparation de l’échantillon, et il est fortement recommandé de le faire, afin de disposer d’échantillons de référence pour une comparaison ultérieure.

Protocole

1. Isolement brut de plastoglobules

1. Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires de maïs non stressés
   1. Acquérir six plants de maïs sains âgés d’environ 3 semaines et presque au stade de croissance V5, pesant environ 120 g.
   2. Coupez toutes les feuilles à la base de la tige, plongez-les rapidement dans un bain de glace et transportez-les dans la chambre froide.
   3. En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du bain de glace et coupez-les en morceaux plus petits (environ 5 cm x 5 cm) à l’aide de ciseaux.
   4. Broyer délicatement mais soigneusement la moitié du tissu foliaire coupé dans un mélangeur commercial dans 350 ml de tampon de broyage (tableau 1). Démarrez-arrêtez le mélangeur 5x-6x pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. N’utilisez pas de niveau supérieur au niveau 7 sur le mélangeur.
   5. Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu de nylon de 25 μm sur un grand entonnoir dans quatre bouteilles centrifugeuses de 250 mL. Ensuite, répétez l’étape 1.1.4 avec la seconde moitié du tissu foliaire coupé.
   6. Répartir uniformément le filtrat entre les quatre flacons et centrifuger pendant 6 min à 1 840 x g à 4 °C. Prélever une partie aliquote du filtrat de feuilles et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille.
   7. Verser le surnageant résultant et remettre doucement en suspension la pastille dans 12 mL de milieu R 0,2 contenant 0,2 M de saccharose (tableau 1) en remuant et en remettant en suspension avec de doux mouvements de la brosse. Après avoir remis chaque pastille en suspension, portez la suspension sur le flacon suivant et répétez la remise en suspension. Regroupez les suspensions dans une seule bouteille.
   8. Répartir la suspension groupée entre six tubes à ultracentrifugeuses de 3 mL, en atteignant un volume maximal de 2,5 mL dans chaque tube.
   9. Soniquer chaque tube 4x, pendant 10 s à chaque fois, en utilisant un sonicateur à pointe à une amplitude de 100%. Veillez à garder la corne du sonicateur immergée et éloignée de la surface du liquide pour éviter la mousse.
   10. Déplacez lentement la corne du sonicateur de haut en bas dans la suspension pendant chaque tour. Alternez entre les quatre tubes, en retournant chaque tube dans un seau à glace après chaque sonication pour permettre à l’échantillon de refroidir.
   11. Centrifuger la suspension de thylakoïdes bruts soniqués à 150 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Récolter le tampon flottant résultant de plastoglobules bruts à la surface du coussin de saccharose (facilement considéré comme un tampon jaune huileux) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G en écumant la surface du coussin avec l’ouverture de l’aiguille, récupérant environ 500 μL de chaque tube. Déposer dans un tube de 2,0 mL.
   12. Recueillir des aliquotes du thylakoïde brut avant et après la sonication et la libération de plastoglobules. Passez à l’étape 2.1. Vous pouvez également conserver les plastoglobules bruts à −80 °C et les purifier ultérieurement.
2. Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires d’E. nindensis desséchés
   1. Acquérir un pot (composé de trois plantes individuelles par pot) d’E. nindensis , âgé de 8 à 9 semaines (près de 40 g de tissu) entièrement desséché.
   2. Coupez tout le tissu foliaire de la base de la plante, juste au-dessus du sol, à l’aide de ciseaux et trempez immédiatement le tissu dans un bain de glace. Transportez le mouchoir en papier dans la chambre froide.
   3. En travaillant sous une lampe de sécurité verte, coupez le E. Les feuilles de Nindensis sont en morceaux plus petits (environ 5 cm x 5 cm) à l’aide de ciseaux.
   4. Broyer doucement mais soigneusement les feuilles avec 100 ml de tampon de broyage (tableau 1) dans un mélangeur commercial. Démarrez-arrêtez le mélangeur plusieurs fois pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. N’utilisez pas de niveau supérieur au niveau 7 sur le mélangeur.
   5. Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu de nylon de 25 μm sur un grand entonnoir dans une fiole conique de 250 mL. Prélever une partie aliquote du filtrat de feuilles et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille.
   6. Ajouter la quantité appropriée de saccharose pour porter à une concentration finale de 0,5 M et répartir la solution dans des tubes à centrifuger de 250 mL.
      NOTE: Une concentration plus élevée de saccharose par rapport à la préparation de Z. mays est utilisée pour assurer la flottation des gouttelettes lipidiques cytosoliques avant la sonication / libération ultérieure des plastoglobules liés aux thylakoïdes.
   7. Centrifuger les tubes à 45 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Un mélange de plastoglobules et de gouttelettes lipidiques cytosoliques sera facilement vu comme un tampon jaune huileux sur ou près de la surface du coussin de saccharose (Figure 1B). Recueillir le matériau flottant à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 22 G en écumant la surface du coussin avec l’ouverture de l’aiguille, et déposer dans un tube.
   8. Jeter le surnageant restant après avoir recueilli le mélange de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant librement.
   9. Pour isoler les plastoglobules reliés au thylakoïde résiduel, remettre la pastille en suspension dans 12 mL de milieu R 0,2 en remuant et en la remettant en suspension avec de doux mouvements de la brosse. Regroupez les suspensions dans une seule bouteille. Passez à l’étape 1.1.8.
3. Extraction brute de plastoglobules à partir de cyanobactéries
   1. Cultiver une culture de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 jusqu’à la phase stationnaire (environ 7-10 jours) et ajuster la densité cellulaire à une DO₇₅₀ de 2,0 à l’aide d’un spectrophotomètre. Pour les conditions de culture, utiliser un milieu BG-11 et cultiver dans un incubateur à une intensité lumineuse de 150 μmol photons/m 2/s, 2% de CO₂, 32 °C et avec agitation continue à 150 tr/min.
   2. Pour éliminer les polysaccharides, laver les cellules en centrifugeant la culture de 50 mL à 6 000 x g pendant 45 minutes à 4 °C, puis en retirant le surnageant. Continuez en lavant les cellules deux fois dans 50 mL de tampon A (tableau 1). Retirer une partie aliquote de l’homogénat cellulaire et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit stockée en tant qu’échantillon cellulaire total représentatif
   3. Remettez en suspension la pastille lavée dans 25 ml de tampon A et cassez les cellules à l’aide d’une cellule de pression française à 1 100 psi, en répétant le processus 3x (mettez l’échantillon sur de la glace entre chaque cycle pour éviter la dénaturation des protéines) jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge-bleu-vert sous lumière blanche. Utilisez une cellule pré-refroidie et effectuez cette étape dans la chambre froide.
   4. Répartir l’homogénat résultant entre huit tubes à ultracentrifugeuses de 3 mL remplis jusqu’à un maximum de 2,5 mL dans chaque tube, puis recouvrir soigneusement de 400 μL de milieu R, produisant un gradient progressif.
      NOTA : Voir Yang, et al. et Kelekar, et al. pour des descriptions détaillées de la préparation du gradient de saccharose^25,26.
   5. Équilibrer soigneusement les tubes en ajoutant un milieu R supplémentaire, si nécessaire, et centrifuger pendant 30 min à 150 000 x g à 4 °C. Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds (y compris les corps polyhydroxyalcanoates) granulent, tandis que les plastoglobules seront facilement vus comme un tampon jaune huileux sur ou près du sommet du gradient de saccharose (Figure 1C).
   6. Récolter le tampon flottant résultant de plastoglobules bruts avec une seringue et une aiguille 22G et déposer dans un tube de 2 mL. Grattez les plastoglobules du côté de la paroi du tube ultracentrifuge avec l’extrémité de l’aiguille si nécessaire.
   7. Passez à l’étape 2.2. Vous pouvez également conserver les plastoglobules bruts à -80 °C et les purifier plus tard.

2. Récolte de plastoglobules purs

1. Traitement des tissus végétaux
   1. Produire des gradients de saccharose dans des tubes à ultracentrifugeuses de 2,5 mL en superposant d’abord 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1.1 ou 1.2 mélangés à 500 μL de milieu R 0,7, pour porter à un volume total de 1 mL, puis superposer avec 400 μL de milieu R 0,2, puis superposer avec 400 μL de milieu R.
      NOTA : Voir Yang et coll. et Kelekar et coll. pour une description détaillée de la préparation du gradient de saccharose^25,26.
   2. Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant l’excès de milieu R à la couche supérieure, si nécessaire. Puis centrifuger à 150 000 x g pendant 1,5 h à 4 °C.
   3. Prélever le tampon flottant de plastoglobules purs (figure 1A) obtenu à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 22G et le déposer dans un tube de 2 mL. Grattez les plastoglobules du haut de la paroi du tube de centrifugation avec l’extrémité de l’aiguille si nécessaire.
   4. Aliquote les plastoglobules purs et la congélation flash dans l’azote liquide. Conserver directement à -80 °C ou lyophiliser en poudre sèche.
2. Traitement des cyanobactéries
   1. Produire un gradient de saccharose dans quatre tubes ultracentrifuges de 2,5 mL superposés d’abord avec 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1,3 mélangés à 750 μL de milieu R 0,7, puis superposés avec 750 μL de milieu R 0,2.
      NOTA : Voir Yang et coll. et Kelekar et coll. pour une description détaillée de la préparation du gradient de saccharose^25,26.
   2. Centrifuger le gradient de saccharose à 150 000 x g pendant 90 min à 4 °C. Prélever les plastoglobules purs (figure 1C) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G dans la phase supérieure du gradient de saccharose et transférer dans un tube de 1,5 mL.
   3. Aliquote les plastoglobules purs et surgélation instantanée dans de l’azote liquide. Conserver directement à −80 °C ou lyophiliser en poudre sèche.

Résultats

À la fin de l’étape 1 du protocole, on devrait être en mesure de voir facilement une quantité considérable de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant sur (ou à proximité) de la couche supérieure du coussin de saccharose (figure 1B-C). D’autres fractions pourraient également être collectées à ce stade. Par exemple, les thylakoïdes seront granulés et pourront être remis en suspension avec un milieu R 0,2 pour des analyses ultérieure...

Discussion

Pour minimiser les changements physiologiques / biochimiques du matériau et protéger certains pigments prényl-lipidiques photo- et thermo-labiles qui sont un composant riche des plastoglobules, il est essentiel d’effectuer l’isolement à 4 ° C et à l’abri de la lumière. Comme indiqué ci-dessus, les étapes initiales sont effectuées en chambre froide sous une lampe de sécurité à l’aide d’une ampoule à émission verte. Les étapes suivantes effectuées en laboratoire sont sous des lumières tamisées ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A