Method Article
* These authors contributed equally
אוסטאוקלסטים הם תאי מפתח סופחי עצם בגוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להבחנה חוץ גופית של אוסטאוקלסטים ממונוציטים של דם היקפי אנושי. שיטה זו יכולה לשמש ככלי חשוב להבנה נוספת של הביולוגיה של אוסטאוקלסטים בהומאוסטזיס ובמחלות.
אוסטאוקלסטים (OCs) הם תאים סופחי עצם הממלאים תפקיד מרכזי בהתפתחות השלד ובעיצוב מחדש של עצמות בוגרות. מספר הפרעות עצם נגרמות על ידי התמיינות מוגברת והפעלה של OCs, ולכן עיכוב של פתולוגיה זו הוא עיקרון טיפולי מרכזי. שני גורמים עיקריים מניעים את ההבחנה של OCs ממבשרי מיאלואידים: גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ומפעיל קולטן של ליגנד קאפה-B (RANKL). מונוציטים CD14+ במחזור אנושי ידועים מזה זמן רב כמתמיינים לOCs במבחנה. עם זאת, זמן החשיפה וריכוז ה- RANKL משפיעים על יעילות הבידול. אכן, תוארו פרוטוקולים ליצירת OCs אנושיים במבחנה , אך לעתים קרובות הם גורמים לתהליך בידול גרוע וממושך. בזאת, מסופק פרוטוקול חזק וסטנדרטי ליצירת OCs אנושיים בוגרים פעילים פונקציונלית בזמן. מונוציטים CD14+ מועשרים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) ודרוכים עם M-CSF כדי לווסת את RANK. חשיפה עוקבת ל- RANKL יוצרת OCs באופן תלוי מינון וזמן. OCs מזוהים ומכומתים על ידי צביעה עם phosphatase עמיד חומצה טרטרט (TRAP) וניתוח מיקרוסקופ אור. צביעה אימונופלואורסצנטית של גרעינים ו-F-actin משמשת לזיהוי OCs פעילים מבחינה תפקודית. בנוסף, OCs בוגרים של OSCAR+CD14− מועשרים עוד יותר באמצעות מיון תאי ציטומטריה של זרימה, ופונקציונליות OC המכומתת על ידי מבחני ספיגה מינרליים (או דנטין/עצם) והיווצרות טבעות אקטינים. לבסוף, מעכב OC ידוע, רוטנון, משמש על OCs בוגרים, מה שמוכיח כי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) חיוני לשלמות טבעת האקטין ולתפקוד OC. לסיכום, במחקר זה נקבע מבחן חזק להבחנה בין מספר גבוה של OCs, אשר בשילוב עם צביעת טבעת אקטין ובדיקת ATP מספק מודל שימושי במבחנה להערכת תפקוד OC ולסינון תרכובות טיפוליות חדשניות שיכולות לווסת את תהליך ההתמיינות.
אוסטאוקלסטים (OCs) הם תאי ענק מרובי גרעינים של שושלת המטופויטית עם יכולת ייחודית לספוח עצם. הם אחראים על פיתוח ושיפוץ מתמשך של השלד 1,2. בשלבי ההתפתחות של השלד, OCs ומקרופאגים שוכני רקמות נגזרים מאבות אריתרו-מיאלואידים ומאכלסים את נישת העצם ורקמות האיברים. במצבים פיזיולוגיים, אבות אריתרו-מיאלואידים נדרשים להתפתחות עצם תקינה ולבקיעת שיניים, בעוד שזרם מונוציטים במחזור הדם לתוך נישת העצם מספק תחזוקה לאחר הלידה של OCs, מסת העצם וחלל מח העצם3. בתנאים פתולוגיים, מונוציטים מגויסים לאתרים של דלקת פעילה ויכולים לתרום להרס עצם פתולוגי 4,5.
חולים עם מספר צורות של דלקת פרקים חווים דלקת מפרקים, המובילה להרס מפרקים מתקדם הנגרם על ידי OCs6. לדוגמה, בדלקת מפרקים שגרונית (RA), OCs מופעלים יתר על המידה אחראים לשחיקת עצם פתולוגית והרס מפרקים7,8, והטיפולים הנוכחיים לעתים קרובות אינם משפרים או עוצרים את הנזק לעצם9,10,11. שינויים במונוציטים במחזור הן מבחינת התפלגות האוכלוסייה והן מבחינת חתימות שעתוק ואפיגנטיות דווחו בחולי RA12,13,14. יתר על כן, דווח כי תגובות מונוציטים משתנות לגירוי דלקתי משפיעות על אוסטאוקלסטוגנזה בחולי RA עם מחלה פעילה15,16,17.
התמיינות של OCs היא תהליך מורכב ורב-שלבי הכולל את המחויבות של תאים מקדימים מיאלואידים להתמיין למבשרי OC. במהלך אוסטאוקלסטוגנזה, OCs הופכים לענקים ומרובי גרעינים באמצעות איחוי תאים, ציטוקינזיס לא שלם, ותהליך מחזור גרעיני המתואר כביקוע ואיחוי18,19,20. היכולת להבדיל בין OCs במבחנה אפשרה התקדמות משמעותית בהבנת הביולוגיה של העצם21. OCs נבדלים מקודמנים בחשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ומפעיל קולטן של גורם גרעיני קאפה-B ליגנד (RANKL). האחרון חיוני להתפתחות ותפקוד תקין של OCs במבחנה ו in vivo, גם בתנאים דלקתיים 6,22,23. RANKL מוצג על ידי אוסטאובלסטים ואוסטיאוציטים, כמו גם על ידי תאי T פעילים ופיברובלסטים בסינוביום RA מודלק 2,24,25. במהלך תהליך התמיינות OC, מונוציטים שנחשפו ל-M-CSF משפרים את מפעיל הקולטן של ביטוי גורם גרעיני קאפה-B (RANK) על קרום התא שלהם, ותחת גירוי עוקב עם RANKL, מתמיינים לקדם-OCs חד-גרעיניים חד-גרעיניים עמידים לטרטרט (TRAP) ולאחר מכן ל-OCs15,26 מרובי גרעינים. OCs מייצרים מספר אנזימים, העיקרי שבהם הוא TRAP, המאפשר פירוק של פוספופרוטאינים בתוך עצם27. וסת וסמן של התמיינות OC הוא קולטן הקשור ל-OC (OSCAR). הוא מווסת בשלב מוקדם בתאים מקדימים המתחייבים לשושלת OC28. OCs מרובי גרעינים ענקיים בוגרים יכולים לפרק (לספוג מחדש) את מטריצת השלד על ידי יצירת אזור איטום גדול, העשוי מטבעת אקטין המקיפה גבול פרוע21,29,30. יכולת ספיגת העצם של OCs דורשת ארגון מחדש של השלד הציטו-שלד וכתוצאה מכך קיטוב והיווצרות של קרום מפותל, שהוא מה שנקרא גבול פרוע. הגבול הפרוע מוקף ברצועה עגולה גדולה של מבנה עשיר באקטין F, שהוא טבעת האקטין או אזור האיטום. שלמות טבעת אקטין חיונית עבור OCs כדי לספוח מחדש את העצם הן במבחנה והן in vivo, והיווצרות גבול פרועה פגומה קשורה לביטוי אדנוזין טריפוספטאז ואקולרי תחתון (V-ATPase)31,32,33. יתר על כן, OCs הם תאים עשירים במיטוכונדריה, ואדנוזין טריפוספט (ATP) קשור למבנים דמויי מיטוכונדריה בOCs הממוקמים בגבול הפרוע31,32,33. רוטנון פועל כמעכב חזק של קומפלקס המיטוכונדריה I ומשפיע על ייצור ATP. רוטנון הוכח גם כמעכב התמיינות OC ותפקוד34.
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ואופטימלית של אוסטאוקלסטוגנזה חוץ גופית מדגימות דם היקפיות אנושיות. בדם היקפי אנושי, מונוציטים CD14+ הם המקור העיקרי של OCs15,35,36. בפרוטוקול זה, הקינטיקה של החשיפה והריכוזים של M-CSF ו-RANKL הותאמו לאוסטאוקלסטוטנזה אופטימלית. תאים חד-גרעיניים מופרדים תחילה מן אריתרוציטים גרנולוציטים נוכח דם שלם על ידי שיפוע צפיפות; לאחר מכן הם מועשרים עבור מונוציטים CD14+ באמצעות ברירה חיובית על ידי חרוזים מגנטיים. המונוציטים המבודדים CD14+ מודגרים למשך הלילה עם M-CSF. זה מכין את המונוציטים כדי לווסת את הביטוי של דרגה15,26. התוספת הבאה של RANKL גורמת לאוסטאוקלסטוגנזה ורב-גרעינים באופן תלוי זמן. OCs סופגים פעילים מראים את הפיזור האופייני של טבעות F-actin בקצה קרום התא30,32 ואת הצביעה עבור TRAP. OCs בוגרים מנותחים על ידי כימות תאים מרובי גרעינים TRAP+ (יותר משלושה גרעינים). ניתן להעריך את היכולת התפקודית של OCs בוגרים על ידי ספיגתם, שלמות טבעות האקטין וייצור ATP. יתר על כן, ניתן להעשיר OCs CD14-OSCAR+ מובחנים ולהשתמש בהם כדי להעריך את ההשפעות של תרכובות מסוימות על פונקציונליות OC באמצעות ספיגת מינרלים (או דנטין) וארגון F-actin. בנוסף, בעבודה זו, מעכב OC ידוע, רוטנון, משמש כדוגמה לתרכובת המשפיעה על הפונקציונליות של OCs. פעילות ספיגת OC מופחתת תחת רוטנון קשורה לייצור ATP מופחת ולפיצול טבעת אקטין (actin ring). לסיכום, פרוטוקול זה קובע בדיקה חזקה שיכולה לשמש כשיטת התייחסות לחקר מספר היבטים ביולוגיים של התמיינות OC ותפקוד במבחנה.
מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי להעריך (1) את הפוטנציאל של מונוציטים במחזור להתמיין לOCs בבריאות ובמחלות, כמו גם (2) את ההשפעה של מועמדים טיפוליים על התמיינות OC ותפקוד. פרוטוקול אוסטאוקלסטוגנזה חזק זה מאפשר לקבוע את היעילות והמנגנונים של טיפולים ממוקדי עצם הן על התמיינות OC מתאים מקדימים והן על תפקודם של OCs בוגרים.
מעילי באפי המתקבלים משירות עירוי הדם הלאומי הסקוטי (אדינבורו) וקונוסים לויקוציטים המתקבלים מ- NHS דם והשתלות (ניוקאסל) מסופקים לחוקרי אוניברסיטת גלזגו בצורה אנונימית לחלוטין (לא ניתנת לזיהוי) מתורמי דם NHS בהסכמה מלאה. מעיל באפי ורכיבי דם חרוט לויקוציטים מיוצרים מתרומת דם סטנדרטית של NHS הניתנת במרכז תורמי דם של NHS בסקוטלנד או באנגליה. תורם הדם נותן הסכמה מדעת בעת תרומת הדם לעודפי דם שאינם משמשים בפרקטיקה הקלינית הסטנדרטית של NHS לשימוש במחקרים רפואיים מאושרים. האישור האתי מוועדת האתיקה למחקר של NHS וטפסי הסכמת התורמים החתומים לשימוש בתרומות דם אלה מוחזקים על ידי שירות תרומת הדם של NHS. אישור לגשת ולהשתמש בתרומות דם מוסכמות אלה במחקרים רפואיים מאושרים התבקש והושג באמצעות תהליך היישום והסקירה הפנימי הסטנדרטי של שירות עירוי הדם הלאומי (סקוטלנד) ו- NHS דם ותחבורה (אנגליה). לא נדרש אישור נוסף של NHS REC או אישור פנימי של ועדת האתיקה של אוניברסיטת גלזגו כדי להשתמש במרכיבי הדם למחקרים הרפואיים שאושרו.
1. הערות כלליות לפני תחילת העבודה
2. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדם שלם
3. העשרת מונוציטים CD14+ ממרכזיות מרכזיות
4. בידול OC במבחנה
איור 1: זרימת עבודה של בידול המהרה (OC). סקירה סכמטית של בידוד מונוציטים CD14+ מ- PBMCs והתמיינות ל- OCs בוגרים בנוכחות M-CSF ו- RANKL למשך 7-14 ימים. RT = טמפרטורת החדר. התמונה נוצרה באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
5. צביעת מלכודת לאוסטאוקלסטים
6. בדיקת ספיגת עצם
7. צביעה פלואורסצנטית של טבעת אקטין
8. העשרת OCs בוגרים ומבשרי OC באמצעות מיון ציטומטריית זרימה
9. בדיקת ATP לפעילות מיטוכונדריאלית
יצירת המהרה ממונוציטים CD14+
שיטה זו נועדה להבדיל בקלות בין מספר רב של OCs לבין מונוציטים CD14+ בדם היקפי אנושי במבחנה, בדרך כלל בשבוע אחד. ראשית, מונוציטים CD14+ הועשרו מ-PBMCs והוכשרו עם M-CSF בן לילה כדי להעלות את רמת ה-RANK, כפי שדווח בעבר15. לאחר פריימינג מונוציטים, כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של RANKL עבור התמיינות OC והבשלה, נעשה שימוש בריכוזי RANKL של 1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL ו-100 ng/mL, יחד עם 25ng/mL M-CSF. התוספת של RANKL יצרה מספר גדל והולך של OCs מרובי גרעינים חיוביים גדולים ל-TRAP באופן תלוי מינון, וזה הוערך באמצעות צביעת TRAP. OCs בוגרים מוגדרים כתאים חיוביים למלכודת עם גרעינים מרובים (בדרך כלל יותר משלושה; איור 2A,B ואיור משלים 1). יתר על כן, הקינטיקה של התמיינות OC ממונוציטים נחקרה באמצעות צביעת TRAP ומיקרוסקופ אור במשך תקופת תרבית של 2-14 ימים. במקרה זה, התמיינות OC באמצעות ריכוז ביניים של 50 ng/mL RANKL נבחרה כדי להעריך באיזו מהירות OCs התמידו בתרבית. בתנאי התרבית האלה, OCs מרובי גרעינים נראו מהיום ה-5 ואילך, וההתמיינות האופטימלית הושגה ביום ה-7 (איור 2C). הדגירה הממושכת של תרביות מעבר ל-10 ימים על פלסטיק הביאה לאיחוי תאים ענקיים באופן חריג. בפרוטוקול זה, ימים 6-8 משמשים בדרך כלל כנקודת הקצה האופטימלית של יצירת OC. ניתן לכמת את הOCs או להשתמש בהם לבדיקות במורד הזרם.
הערכה תפקודית של OCs מובחנים
כדי לקבוע את הפעילות התפקודית של OCs שנוצרו, בחנו את פעילות הספיגה שלהם על ידי הבחנה בין OCs על משטח מינרלי. מכיוון שOCs גדולים נוצרים רק לאחר תקופת תרבית של 7 ימים, וכדי לאפשר מספיק זמן לספוג מחדש את מצע המינרלים, התרביות נשמרו עד היום ה-10. היווצרות חורים עגולים, או בורות ספיגה, נצפתה רק על משטחים מינרליים של בארות המכילות תאים שטופלו גם ב-M-CSF וגם ב-RANKL (איור 3). לפיכך, אחוז משטח מינרלי מומס (בורות ספיגה) מאפשר לקבוע את יכולת ספיגת OC. נוסף על כך, ה-OCs שהתבדלו בעקבות פרוטוקול זה עד ליום ה-7, הן בשקופיות פלסטיק והן בשקופיות של תאי זכוכית, הציגו מבנה טבעתי אקטין מאורגן היטב שניתן היה להמחיש באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית (איור משלים 2).
השפעת מעכב על תפקוד OC בוגר
תנאי ההתרבות שהוזכרו לעיל נוצלו כדי לקבוע את היכולת התפקודית של OCs שנוצרו במבחנה בנוכחות מעכב OC ידוע, רוטנון34. OCs היו מובחנים במשך 6-8 ימים, CD14-OSCAR+ OCs ומבשרי OC הועשרו באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 4). התאים המועשרים צופו ב-50,000 תאים/לבאר על צלחת מצופה מינרלים בת 96 בארות בתווך פרו-אוסטאוקלסטוגני (25 ננוגרם/מ"ל, M-CSF ורנקל) למשך 3 ימים. טיפול ברוטנון (איור 5A,B) עיכב באופן תלוי מינון את ספיגת המשטח המינרלי בהשוואה לבאר הבקרה שלא טופלה, בהתאם למחקרים קודמים34. בנוסף, פונקציונליות OC הוערכה באמצעות ייצור ATP ויצירת טבעות אקטין (actin ring). עיכוב תלוי רוטנון של ספיגת OC היה קשור לעיכוב ייצור ATP (איור 5C). OCs סופגים מחדש הם תאים מקוטבים מאוד המווסתים את יכולת הספיגה שלהם על ידי קידום ארגון השלד הציטו-שלד. פלואידין מצומד Alexa fluor 647 שימש לסימון שלד ציטוקלטון F-actin של OCs בוגרים שגודלו בתרבית בנוכחות או היעדר רוטנון. רוטנון גרם לפיצול טבעת האקטין שמקורה ב-RANKL של OCs בוגרים (איור 5D).
איור 2: OCs מבדילים ביעילות ממבשרי מונוציטים CD14+ . מונוציטים CD14+ הועשרו מגנטית, צופו ב 1 x 105 תאים / באר בלוחות 96 בארות, והודגרו בן לילה עם 25 ng / ml m-CSF. (A) מונוציטים מוקפצים M-CSF עוררו בריכוזים הולכים וגדלים של RANKL (1 ננוגרם/מ"ל, 25 נ"ג/מ"ל, 50 נ"ג/מ"ל ו-100 נ"ג/מ"ל), תוקנו ונצבעו ל-TRAP ביום השביעי. התמונות נרכשו, והתאים מרובי הגרעינים (MNCs) של TRAP+ נספרו. תמונות מייצגות של צביעת TRAP מוצגות באיור משלים 1. קווי השגיאה מציגים ממוצע ± SD (n = 3). הנתונים נותחו באמצעות מבחן השוואות מרובות חד-כיווני של ANOVA והולם-סידאק עבור נתונים זוגיים; * P ≤ 0.05 ו- ** P ≤ 0.005. (B) תמונה מייצגת של באר מוכתמת ב-TRAP של לוח בעל 96 בארות המראה את הכמות האופיינית של OCs/באר צפויה ואת המורפולוגיה שלהם מתחת ל-25 ng/mL RANK-L בהשוואה למקרופאגים שמקורם ב-M-CSF ביום 7. פסי קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (C) תמונות מייצגות של היווצרות OC מתחת ל-50 ננוגרם/מ"ל RANKL שהוערכו באמצעות צביעת TRAP מהיום השני עד היום ה-14. OCs נראים מהיום החמישי ואילך. OCs ענקיים שהתמזגו באופן חריג נמצאים לאחר 10 ימים. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: OCs סופגים נבדלים ממונוציטים CD14+ . תאי CD14+ שבודדו מ-PBMCs התמינו במשך 10 ימים ל-OCs בנוכחות 25 ננוגרם/מ"ל, M-CSF (M) ו-RANKL (R) על פני השטח של בדיקת מינרלים (אוסטאו-אסאי). (A) תמונות של בארות ייצוגיות משוחזרות שצולמו בהגדלה של פי 10 כדי לנתח את הספיגה ביום ה-10 (מצע מינרלי באפור; בורות ספיגה בלבן). פסי קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (B) כימות אחוז השטח שנספג. נתוני הספיגה נותחו באמצעות ניתוח זוגי של Wilcoxon. קווי השגיאה מציגים ממוצע ± SD (n = 7). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: העשרת ציטומטריה של זרימה של OCs CD14-OSCAR+. מונוציטים CD14+ הועשרו מ-PBMCs, וה-OCs נבדלו כפי שתואר קודם לכן. תרביות OC דבקות נותקו עם אקוטאז ונצבעו עבור ציטומטריית זרימה. (א-ג) OCs ביום 8 מוינו על בסיס CD14 וביטוי OSCAR. (א) אסטרטגיית מיון מייצגת. התאים גודרו כסינגלטים, שליליים לכתמים מתים, ותת-הקבוצות CD14+ OSCAR+ (אדום) ו-CD14-OSCAR+ (כחול) מוינו. (B) תרשימים מייצגים המראים את צביעת OSCAR החופפת של OCs הנגזרים מ-RANKL (ציאן) ומקרופאגים שמקורם ב-M-CSF (כתום). באדום נמצאת הבקרה המוכתמת באיזוטיפ OSCAR של OCs הנגזרים מ-RANKL. (C) האוכלוסיות הממוינות צופו על פלסטיק והורשו להיצמד במשך שעתיים בתווך פרו-OC (25 ננוגרם/מ"ל M-CSF ו-50 ננוגרם/מ"ל RANKL), ולאחר מכן צביעה והדמיה של TRAP. התמונות המייצגות מראות מחסור בתאי TRAP+ בתת-הקבוצה CD14+ (אדום) ובתת-קבוצה מונו-וגרעינית של TRAP+ קדם-OCs ו-OCs בתת-הקבוצה CD14− (כחול). פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בדיקות להערכת תפקודם של OCs בוגרים. כדי להעריך את תפקודם של OCs בוגרים, תאי CD14+ שבודדו מ- PBMCs גודלו בתרבית עם M-CSF (M) בלבד או בשילוב עם RANKL (R) במשך 7 ימים, OCs הועשרו באמצעות ציטומטריית זרימה, ולאחר מכן OCs טופלו עם רוטנון מעכב במשך 24 שעות. (A) OCs בוגרים מוינו באמצעות ציטומטריית זרימה (CD14−OSCAR+) וגודלו בתרבית על משטח בדיקת מינרלים בנוכחות או היעדר רוטנון במשך 3 ימים, ולאחר מכן התאים הולבנו וצולמו במהירות של פי 10 כדי לחשוף את האזור שנספג מחדש (בורות ספיגה בלבן). (A) תמונות משוחזרות מייצגות של בארות. פסי קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (B) כימות אחוז השטח שנספג. הנתונים ב-(B) נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של דאן (n = 7); * P ≤ 0.05 ו** P ≤ 0.01. פסי השגיאה מציגים את הממוצע ± SD. (C) תכולת ATP תוך-תאית כוללת של OCs בוגרים לא מובחנים ויום 7 מובחנים עם RANKL ומטופלים ברכב או ברוטנון (10 ננומטר ו-30 ננומטר). כאן, 2DG ואוליגומיצין שימשו כבקרות חיוביות לבדיקה ונוספו 30 דקות לפני ליזה התאית וכימות ATP. קווי השגיאה מציגים את הממוצע ± SD (n = 4). הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ומבחן השוואה מרובה של Dunnett עבור נתונים זוגיים. ** P ≤ 0.01. (D) תמונה מייצגת של 20x OCs בוגרים מוכתמת להיווצרות טבעת אקטין (אדום) וגרעינים (כחול), המראה את אובדן טבעת האקטין עם המעכב. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
פורמט צלחת | 96 צלחת באר | 48 צלחת באר | 24 צלחת באר | 12 צלחת באר | 6 צלחת באר |
נפח | 100 מיקרוליטר | 225–250 מיקרוליטר | 450–500 מיקרוליטר | 0.8–1 מ"ל | 1.8–2 מ"ל |
טבלה 1: נפח מתלה התא עבור תבניות לוחות שונות. אמצעי האחסון מחושבים החל מתמיסת 1 x 106 תאים/מ"ל ומספקים צפיפות אופטימלית לאיחוי תאים.
פלואורופור, שיבוט | נפח (μL) לכל 106 תאים | |
CD14 | PE/ציאנין7, הידרוכלוריד14 | 5 מיקרוליטר |
אוסקר | FITC, REA494 | 10 מיקרוליטר |
מאגר מיון תאים | 80 מיקרוליטר |
טבלה 2: תמיסת תערובת אב נוגדנים.
איור משלים 1: צביעת TRAP של תגובת מינון RANKL. מונוציטים CD14+ הועשרו מגנטית, צופו ב-1 x 105 תאים/באר בלוחות של 96 בארות, והודגרו בן לילה עם 25 ננוגרם/מ"ל m-csf, כמו באיור 2. תמונות מייצגות של צביעת TRAP מראות מונוציטים מוקצים MCSF עם ריכוזים הולכים וגדלים של RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL ו-100 ng/mL), קבועים ומוכתמים עבור TRAP ביום השביעי. פסי קנה מידה: 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים 2: צביעת טבעות משחק ב-OCs מובחנים לחלוטין. (A) הגדלה של OCs פי 10 המובחנת על פלסטיק TC ומוכתמת בפלואידין AF647 (באדום). סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. (B) הגדלה של OCs פי 40 המובחנת בשקופיות תא זכוכית ומוכתמת בפלואידין AF488 (בצהוב). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.הגרעינים מוכתמים ב-DAPI, מוצגים בכחול ב-(A) ובציאן ב-(B). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: ההשפעה של אצוות FBS שונות על יעילות התמיינות OC. OCs נבדלו מונוציטים CD14+ בנוכחות 25 ng / mL M-CSF ו 50 ng / mL RANKL (MR) במשך 7 ימים. בארות הבקרה היו M-CSF בלבד (M). (A) הגדלות מייצגות של 10x (פסי קנה מידה: 400 מיקרומטר) ו-(B) כימות של OCs מוכתמים במלכודת המובחנים מתורם אחד בשתי קבוצות שונות של FBS. קווי השגיאה מציגים את ממוצע ± SD של שלושה עותקים טכניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
התרבית הקלה והבידוד של מספר גדול של OCs פונקציונליים במבחנה חשובים לקידום ההבנה של ביולוגיה של העצם ומחלות בתיווך OC. באופן קלאסי, OCs נוצרו בתרביות משותפות עם אוסטאובלסטים או תאי סטרומה ותאים המטופויטיים מהטחול או מח העצם38,39. פריצת דרך משמעותית בהבנת אוסטאוקלסטוגנזה הייתה זיהויו של RANKL כמווסת העיקרי של היווצרות, התמיינות והישרדותOC 40. פרוטוקולים מוקדמים של מערכות תרבות תלויות RANKL השתמשו במרכזיות עבור דור OC21,41,42. עם זאת, תרבויות מעורבות אלה הן ארוכות ומציגות גורמים מבלבלים רבים המגבילים את היכולת לבחון את ההשפעות הישירות על התמיינות OC ותפקודו. פרוטוקול זה מתאר מודל יעיל ואמין במבחנה של אוסטאוקלסטוגנזה ממונוציטים היקפיים אנושיים CD14+ שבו ניתן להשיג אוסטאוקלסטוגנזה אופטימלית תוך 7 ימים (איור 1 ואיור 2), שהוא מהיר משמעותית בהשוואה לפרוטוקולים אחרים43,44,45,46. המאפיינים העיקריים של פרוטוקול זה הם (1) השימוש במונוציטים מטוהרים CD14+, (2) הקדמת המונוציטים עם M-CSF לפני החשיפה ל- RANKL, (3) אורך התרבית (<7 ימים), ו- (4) זיהוי אמין של עיכוב היווצרות OC (צביעת TRAP) ותפקוד (ספיגה מחדש, ייצור ATP, ארגון מחדש של טבעת אקטין עם מעכבים.
במהלך אופטימיזציה של המתודולוגיה זוהו מספר נקודות קריטיות. נצפה כי התמיינות במבחנה של OCs תלויה במידה רבה בצפיפות הזריעה של מונוציטים CD14+. לכן, בפרוטוקול זה, התאים נזרעים בצפיפות גבוהה (1 x 105 תאים / באר של צלחת 96 באר, ב 100 μL של תווך), כפי שהוא חיוני עבור התאים להיות מסוגלים לתקשר אחד עם השני ולהיות בקרבת נתיך ולהיות OCs בוגרים. באופן דומה, זריעה של תאים בצפיפות גבוהה מדי מגבילה את התמוותם וצמיחתם בשל מגבלות בינוניות ומחסור במקום הנדרש. יתר על כן, כדי להשיג הצלחה מרבית עם פרוטוקול זה, חשוב לבצע את הפרדת שיפוע הצפיפות בזהירות ולהבטיח כי האוכלוסייה המועשרת של תאי CD14+ היא טהורה ככל האפשר. לדוגמה, שלבי שטיפה לא מספקים גורמים לחוסר הסרה של טסיות, מה שכתוצאה מכך מעכב התמיינות OC47,48. באופן דומה, נוכחות של זיהום תאי T מינורי בתכשירי CD14+ מבודדים המעוררים עם M-CSF בלבד יכולה לגרום להתמיינות OC, אולי באמצעות הפרשת RANKL על ידי תאי T49. לכן, חשוב לכלול בקרת M-CSF לכל ניסוי. בדיקת טוהר שגרתית, במיוחד בעת שימוש בערכת בידוד חדשה, מומלצת גם היא כדי לוודא את טוהר הדגימה.
מספרי OC אופטימליים (טווח: ~200-1,600 OCs / באר) מושגים באמצעות מדיום α-MEM מועשר בנוקלאוזידים ו- L-גלוטמין. אמצעי תרבות קונבנציונליים אחרים, כולל מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) ומדיום הזיכרון של רוזוול פארק (RPMI) 1640, משפיעים על תפוקת OC. המקור של FBS יכול גם להשפיע על osteoclastogenesis. אצוות שונות של FBS יכולות להוביל לירידה באוסטאוקלסטוגנזה שמקורה ב-RANK-L, כמו גם להופעה של מספר נמוך של תאים מרובי גרעינים מסוג TRAP+ בפקדי M-CSF (איור משלים 3). לכן, כדי להשיג תוצאות עקביות, מומלץ לבדוק אצוות FBS חדשות לפני השימוש ולהמשיך עם אותה אצווה לאורך כל הניסויים כדי למזער שינויים בתהליך ההתמיינות. בנוסף, השונות בין תורם לתורם, במונחים של המספר הכולל של OCs מובחנים המתקבלים בנקודת זמן הסיום, מהווה מגבלה בעת שימוש בפרוטוקול זה כדי להשוות, למשל, תורמים בריאים לחולים. במקרים אלה, זה הכרחי להשתמש בדיוק באותם תנאים ואת אותו הרבה של בינוני, FBS, ריאגנטים אחרים.
צעד הכרחי נוסף להתמיינות והבשלה אופטימלית של OC הוא הכנת המונוציטים עם M-CSF לפני הוספת RANKL. חשיפת התאים ל-M-CSF 18-24 שעות לפני RANKL גורמת למונוציטים לווסת את ביטוי RANK15,26. התוספת של RANKL בנקודת זמן זו מבטיחה התמיינות אופטימלית של OC באופן תלוי מינון. מידת התמיינות OC משתנה מתורם לתורם; עם זאת, 25 ננוגרם/מ"ל רנקל בדרך כלל מספיקים כדי להבדיל בין מספר גבוה של OCs ברוב התורמים. בנוסף, ניתן להשתמש ב- 25 ng/mL RANKL בבדיקות לסינון ראשוני של תרכובות, מכיוון שהוא מאפשר הערכה של ההשפעות המשפרות והמעכבות של תרכובות הבדיקה. מערכות תרבית אחרות השתמשו בזמני M-CSF ארוכים יותר לפני הדגירה לפני הוספת RANKL, אך התוצאה היא זמן גידול ארוך יותר עבור אוסטאוקלסטוגנזה50. בנוסף, השארת מונוציטים דרוכים לדגור לילה מאפשר להם להתחבר לצלחת, אם כי לא במצב דבק לחלוטין. לכן, כאשר RANKL הוא הציג בפעם הראשונה, המדיום חייב להיות חצי שונה בזהירות רבה ולא שונה לחלוטין כדי למנוע ניתוק ואובדן של מונוציטים דרוך. המדיום גם צריך להיות רענן כל 3-4 ימים כדי למנוע דלדול בינוני ולמנוע מוות תאי. יתר על כן, בשל הנפח הנמוך המשמש בבדיקה זו (100 μL / באר בצלחת 96 בארות), יש חשיבות עליונה למסגרת של בארות ריקות המלאות בתמיסה מימית (כלומר, H2O או PBS מזוקק סטרילי) סביב בארות הבדיקה. זה מונע אידוי בינוני ואפקטים בקצוות.
לבסוף, עבור בדיקות מטבוליות (למשל, מבחני ATP), הכרחי שהתאים יהיו בני קיימא כדי להימנע מסטיית תקן עצומה בין עותקים משוכפלים (איור 5). כדאיות גבוהה של התאים חשובה גם למיון התאים ולהמשך ההתרבות של OCs ממוינים (איור 4). עם זאת, לשיטה זו מספר מגבלות. OCs בוגרים לחלוטין הם מאוד דבקים וקשה לנתק מן הצלחות. לעתים קרובות לא ניתן לנתק את הOCs הגדולים יותר, מה שעלול להוביל לתפוקת תאים נמוכה יותר. לכן, יש לספור את התאים לאחר מיון ולפני ציפוי בריכוז הנדרש. יתר על כן, בפרוטוקול הנוכחי, שיטה לא אנזימטית (accutase) לניתוק OCs משמשת למניעת שינויים בממברנות בצביעת פני השטח במורד הזרם עבור ציטומטריית זרימה. השימוש במגרדי תאים (שניהם בעלי קצוות רכים או קשים) נבדק גם הוא והוביל למוות תאי גבוה. ניתן להשתמש בניתוק אנזימטי באמצעות תמיסות טריפסין/EDTA של 0.05% לקבלת תפוקה גבוהה יותר של OCs מנותקים כאשר שלמות הממברנה אינה נדרשת עבור יישומים במורד הזרם. בנוסף, כדי למנוע מהOCs להתגבש יחד, מומלץ מאוד להשתמש בריכוז גבוה של EDTA בכל המאגרים לאחר ניתוק התא, כמו גם סינון מתאים לפני רכישת ציטומטריית זרימה. חשוב לציין כי תרביות OC הן אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המורכבת מOCs בוגרים, מבשרי OC ומקרופאגים. ניתן להבחין בקלות בין מקרופאגים לבין OCs, אף על פי שגם קדם-OCs חד-גרעיניים וגם OCs רב-גרעיניים מבטאים OSCAR ולא ניתן להבחין ביניהם בשיטה הנוכחית (איור 4). אכן, סוגיה אחרונה זו מהווה את המגבלה העיקרית של שיטה זו. נוסף על כך, ביטוי נמוך של OSCAR קיים גם בתרביות M-CSF (איור 4B), והוא עשוי להצביע על מקרופאגים שמוכנים למחויבות לשושלת OC. חשוב להגדיר את השער לתאי OSCAR+ בהתבסס על אות הצביעה של FMO, כפי שמוצג באיור 4B.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית וחזקה לייצור יעיל של OCs פעילים ובשלים מבחינה תפקודית ממונוציטים אנושיים ראשוניים במחזור. חוזקו של פרוטוקול זה הוא ביכולתו לייצר OCs בפרק זמן קצר ולהניב מספר גבוה של OCs מובחנים. שיטה זו פותחת את הדרך לחקר המנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס התמיינות OC ותפקודו.
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
המחברים מודים בהכרת תודה למתקן Flow Core ולמתקן ההדמיה של גלזגו (GIF) בתוך בית הספר לזיהום וחסינות על תמיכתם ועזרתם בעבודה זו.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
96-well TC plate | Corning | 3596 | |
96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Acetone | VWR | 20066.330 | |
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher - Invitrogen | A12379 | AF488 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher - Invitrogen | A22287 | AF647 |
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher - Invitrogen | 65-0865-14 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved