יישום של מערכת חכמה לבדיקת רגישות מיקרוביאלית בתפוקה גבוהה / בדיקת פאגים ומדד Lar של עמידות מיקרוביאלית

Summary

כאן אנו מציגים את העיקרון, המבנה וההוראה של המערכת החכמה לבדיקת רגישות מיקרוביאלית בתפוקה גבוהה/מערכת סינון פאגים. היישום שלה מודגם על ידי שימוש בסלמונלה שבודדה מעופות בשאנדונג, סין, כדוגמה. מדד Lar מחושב, ומשמעותו בהערכת עמידות מיקרוביאלית נידונה באופן מקיף.

Abstract

כדי לשפר את היעילות של בדיקות רגישות מיקרוביאלית (AST) ובדיקות פאגים בתפוקה גבוהה עבור חיידקים עמידים ולהפחית את עלות האיתור, פותחה מערכת סינון חכמה של AST/פאגים בתפוקה גבוהה, הכוללת חיסון מטריצה של 96 נקודות, ממיר רכישת תמונה ותוכנה מתאימה, על פי קריטריוני AST ונקודות השבירה של התנגדות (R) שגובשו על ידי מכון התקנים הקליני והמעבדה (CLSI). AST וסטטיסטיקה של התפלגות ריכוז מעכב מינימלי (MIC) (מ-R/8 עד 8R) של 1,500 זני סלמונלה שבודדו מעופות בשאנדונג, סין, כנגד 10 חומרים אנטי-מיקרוביאליים בוצעו על ידי מערכת סינון AST/פאגים חכמה בעלת תפוקה גבוהה. מדד Lar, שמשמעותו "פחות אנטיביוזה, פחות עמידות ושאריות עד מעט אנטיביוזה", התקבל על ידי חישוב הממוצע המשוקלל של כל מיקרופון וחלוקה ב-R. גישה זו משפרת את הדיוק בהשוואה לשימוש בשכיחות העמידות כדי לאפיין את מידת העמידות האנטי-מיקרוביאלית (AMR) של זנים עמידים מאוד. עבור זני סלמונלה עם AMR גבוה, פאגים ליטיים נבדקו ביעילות מספריית הפאגים על ידי מערכת זו, וספקטרום הליזיס חושב ונותח. התוצאות הראו כי מערכת סינון AST/פאגים חכמה בעלת תפוקה גבוהה הייתה ניתנת להפעלה, מדויקת, יעילה מאוד, זולה וקלה לתחזוקה. בשילוב עם מערכת ניטור עמידות מיקרוביאלית וטרינרית בשאנדונג, המערכת התאימה למחקר מדעי ולזיהוי קליני הקשור ל- AMR.

Introduction

מכיוון שחומרים אנטי-מיקרוביאליים נמצאים בשימוש נרחב למניעת מחלות זיהומיות חיידקיות, עמידות מיקרוביאלית (AMR) הפכה לבעיה עולמית של בריאות הציבור¹. המאבק ב-AMR הוא המשימה העיקרית הנוכחית של ניטור AMR של פתוגנים אפידמיולוגיים וטיפול סינרגטי בחומרים אנטי-מיקרוביאליים רגישים ובקטריופאג'ים ליטיים².

בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית במבחנה (AST) היא עמוד התווך לניטור הטיפול ולזיהוי רמת AMR. זהו חלק חשוב בפרמקולוגיה מיקרוביאלית והבסיס הקריטי לתרופות קליניות. המכון לתקנים קליניים ומעבדתיים (CLSI) של ארצות הברית והוועדה האירופית לבדיקות רגישות מיקרוביאלית (EUCAST) ניסחו ותיקנו קריטריונים בינלאומיים של AST ושינו והשלימו ללא הרף שיטות AST ואת נקודות השבירה כדי לקבוע את המיקרופון של שילוב מסוים של "אורגניזם-סוכן מיקרוביאלי" כרגיש (S), עמיד (R) או ביניים (I)^{3, 4}.

משנות השמונים ועד שנות התשעים, מכשירים אוטומטיים לדילול מרק מיקרו פותחו במהירות ויושמו בפרקטיקה קלינית, עם דוגמאות כולל אלפרד 60AST, VITEK System, PHOENIXTM ו- Cobasbact ^5,6,7. עם זאת, מכשירים אלה היו יקרים, דרשו חומרים מתכלים בעלות גבוהה, וטווחי הגילוי שלהם תוכננו עבור תרופות קליניות^{לחולים 5,6,7}. מסיבות אלה, הם אינם מתאימים לבדיקה קלינית וטרינרית ולאיתור כמויות גדולות של זנים עמידים במיוחד. במחקר זה, מערכת סינון חכמה של AST/פאגים בעלת תפוקה גבוהה, הכוללת מחסנים של מטריצת 96 נקודות (איור 1), ממיר רכישת תמונה (איור 2) ותוכנה מקבילה⁸, פותחה כדי לבצע AST עבור קבוצה של זני חיידקים נגד מספר גורמים אנטי-מיקרוביאליים בו זמנית בשיטת דילול אגר. יתר על כן, המערכת שימשה גם כדי לזהות ולנתח את דפוסי הליזה של פאגים כנגד חיידקים עמידים מיקרוביאלית⁹, ופאגים ליטיים נבחרו ביעילות מספריית הפאגים. מערכת זו נמצאה יעילה, משתלמת וקלה לתפעול.

איור 1: תרשים מבני של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות. 1: צלחת סיכת חיסון; 2: ספק סלולרי; 3: בלוק זרעים; 4: צלחת מודגרת; 5: בסיס; 6: ידית הפעלה; 7: הגבל את הסיכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דיאגרמה מבנית של ממיר רכישת התמונות. 1: מעטפת; 2: מסך תצוגה; 3: חדר רכישת תמונות; 4: בסיס לוח איתור; 5: לוח איתור במחסן ומחוצה לו; 6: לוח בקרה; 7: מכשיר המרה לרכישת תמונות; 8: מקור אור; 9: סורק תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

זני הסלמונלה ששימשו במחקר זה נאספו מעופות בשאנדונג, סין, לאחר קבלת אישור מוועדת הבטיחות הביולוגית של המכון למדעי בעלי חיים ורפואה וטרינרית, האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג, סין.

1. יישום מערכת AST חכמה בעלת תפוקה גבוהה⁸

1. הכנת Inoculum
   1. לדגור על אורגניזם בקרת האיכות Escherichia coli ו -93 זני סלמונלה כדי להיבדק עבור AST על לוחות אגר מולר-הינטון (MHA) במשך 16-18 שעות ב 37 ° C³.
   2. הכינו את החיסון של כל זן כך שיתאים לתקן העכירות 0.5 McFarland על פי השיטה שצוינה בתקן CLSI³ולאחר מכן לדלל 10 פעמים.
   3. מקמו 200 μL של מלוחים רגילים סטריליים בבאר^{1 st} האופקית (A1) של צלחת 96 בארות כבקרה שלילית, שני מתלים של אורגניזם בקרת איכות^{לתוך הבארות} האופקיות 2^nd ו -3 rd (A2 ו- A3) כבקרה חיובית, ובקרת איכות, בהתאמה. הוסף 200 μL של מתלי החיסון המדוללים של כל כתם נבדק לתוך 93 הבארות המתאימות בבלוק הזרעים של 96 בארות.
2. הכנת צלחת אגר מיקרוביאלית
   1. הגדר את טווחי הריכוז של חומרים אנטיבקטריאליים שונים שנבדקו על פי טווח החישוב של מדד Lar (מ 0.125R ל 8R). הריכוזים נעים בין טווח בקרת האיכות או 0.0625R (בכפוף לטווח הנמוך יותר) ל-8R.
      הערה: אם מדד Lar אינו מחושב, ניתן לקבוע את טווח ריכוזי האנטיביוטיקה בהתאם לצרכים של AST.
   2. ביצוע תוכנית דילול הכפלת log2 לתמיסה אנטיביוטית החל מריכוז מלאי מתאים המבוסס על שיטת דילול אגר המפורטת בתקן CLSI³.
   3. יש לעקר בקבוקי זכוכית בנפח 50 מ"ל המכילים 18 מ"ל של אגר מדיה של מולר-הינטון. הוסף 2 מ"ל של דילולים מתאימים של תמיסה מיקרוביאלית ל 18 מ"ל של מדיה מותכת מקורר ל 45-50 ° C, לערבב היטב, ויוצקים לתוך הצלחות בארון בטיחות ביולוגית.
   4. מניחים לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר (RT), משאירים רווח מתחת למכסה הצלחות המודגרות ונושפים לייבוש משטח האגר לפני החיסון.
   5. תייגו את סוגי החומרים האנטי-מיקרוביאליים ואת הריכוזים בצד האחורי של הצלחות המודגרות. סדרו את לוחות הדגירה המרובים של כל סוכן אנטי-מיקרוביאלי בערימה בסדר דילול log2-doubleing.
   6. הכינו שתי צלחות אגר ללא תרופות כבקרות עבור כל סוכן אנטי-בקטריאלי.
3. שלבי חיסון לחיסון מטריצה 96 נקודות
   1. התקן את לוחית סיכת החיסון האוטומטית על התמיכה של חיסון מטריצה של 96 נקודות בארון הבטיחות הביולוגית.
   2. מניחים את גוש הזרעים המוכן עם זנים בדוקים וצלחת דגירה אגר על המוביל הנייד, עם זווית מיקום זהה עבור שתי הצלחות.
   3. דחפו את המוביל הסלולרי כך שגוש הזרעים יהיה ישירות מתחת לצלחת סיכת החיסון.
   4. לחץ על ידית הניתוח, הזז את צלחת סיכת החיסון כלפי מטה, וכוון את 96 הפינים לחיסון ב-96 בארות של גוש הזרעים.
   5. שחרר את ידית ההפעלה עם שליטה, ולאחר מכן אפס את לוחית סיכת החיסון תחת פעולת הקפיץ.
   6. לחץ על ידית הניתוח 2-3 פעמים כדי לערבב היטב כל חיסון ולטבול. דחפו והזיזו את צלחת המוביל כך שהצלחת המודגרת תהיה ישירות מתחת לצלחת סיכת החיסון.
   7. לחץ על ידית ההפעלה, הזז את צלחת סיכת החיסון כלפי מטה, ועצור למשך 1-2 שניות כדי לגרום לפינים של החיסון לבוא במגע מלא עם פני השטח של הצלחת המודגרת.
   8. שחרר את נקודת האחיזה להפעלה. זה משלים חיסון אחד. החליפו צלחת מודגרת אחרת והמשיכו את המחזור עד לסיום קבוצה אחת של צלחות אגר אנטי-מיקרוביאליות.
   9. החליפו צלחת סיכת חיסון אחרת ובלוק זרעים, וחסנו קבוצה אחרת של זנים שנבדקו. מחזור עד להשלמת כל החיסונים.
      הערה: חסן תחילה צלחת אגר בקרה (ללא חומר אנטי-מיקרוביאלי), לאחר מכן את הצלחת לפי סדר ריכוז התרופה מנמוך לגבוה, וצלחת אגר בקרה שנייה אחרונה כדי להבטיח שאין זיהום או חומר אנטי-מיקרוביאלי. נפח החיסון מסתמך על נפח התצהיר הטבעי של כל סיכה של כ-2 מיקרוליטר.
4. דגירה על צלחות אגר אנטי-מיקרוביאליות
   1. יש לדגור על לוחות האגר האנטי-מיקרוביאליים המחוסנים ב-RT עד שהלחות בכתמי החיסון נספגת באגר.
   2. הפכו את הצלחות ודגרו עליהן במשך 16-20 שעות בטמפרטורה של 37°C עבור הזנים שנבדקו כדי להבטיח שהחיידקים חסרי העכבות יוצרים מושבות.
5. רכישת תמונות וסטטיסטיקות נתונים
   1. לחץ פעמיים על מערכת רכישת תמונות AST של מטריצת 96 נקודות כדי לפתוח את התוכנית.
   2. לחץ על Test Information בשורת המשימות. לחץ על חדש כדי ליצור משימת בדיקה חדשה, ומלא את המידע בהתאם להנחיות, כולל הקוד, השם, המקור, החיידקים, מספר הזנים, אנטיביוטיקה ומדרג.
   3. לחץ על איסוף נתונים > צילום > פריט בדיקה כדי לבחור את המשימה החדשה שנוצרה. לחץ על אנטיביוטיקה כדי לבחור את שם האנטיביוטיקה, ולחץ על Gradient כדי לבחור את הריכוז הראשוני של אנטיביוטיקה זו.
   4. לחץ על התחבר כדי להתחבר לממיר רכישת התמונות.
   5. מקם את לוחות הדגירה המתאימים על בסיס לוחית הזיהוי עם הזווית החסרה בחזית הימנית לצורך התמצאות ודחוף לתוך ממיר רכישת התמונה.
   6. לחץ על אוסף כדי להשיג את התמונות. שיפוע האנטיביוטיקה יקפוץ אוטומטית לשיפוע הבא. מניחים את הצלחת הבאה בתורו וממשיכים ללחוץ על איסוף עד שהצלחות לאנטיביוטיקה זו נאספות.
   7. לחץ על אנטיביוטיקה, ובחר את הקבוצה הבאה של צלחות מודגרות. לחץ על Gradient כדי לבחור את מעבר הצבע ההתחלתי ולהמשיך לסבב הבא של אוסף תמונות.
   8. לאחר השלמת כל האוספים, לחץ על שלח. התוכנית תזהה באופן אוטומטי את מספר הפיקסלים הלבנים המעוצבים בכל נקודת חיסון בתמונות, תקבע אם יש היווצרות מושבה ותמיר את התמונות לערכי MIC.
   9. לחץ על שאילתה כדי לקבל את כל תוצאות המיקרופון של הזנים כנגד האנטיביוטיקה שנבדקה.
      הערה: מערכת AST החכמה בעלת התפוקה הגבוהה מתאימה לקביעת MICs של קבוצות גדולות של זני חיידקים. תהליך הבדיקה, כולל הכנה, חיסון, דגירה וקריאת תוצאות, אורך 3 ימים. ניתן להגדיר את סוגי האנטיביוטיקה וטווחי זיהוי המיקרופון בהתאם לצרכים המתאימים, וניתן לעשות שימוש חוזר בחומרים המתכלים העיקריים.
6. חישוב מדד Lar
   1. קבע את מדד Lar במדויק באמצעות הנוסחה: , כאשר:
      MIC_i: ריכוז מעכב מינימלי.
      טווח התפלגויות ה-MIC מ-MIC-3 _{ל-MIC 3} מייצג ריכוזים כפולים סדרתיים שבמרכזם R: 0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R ו-8R.
      הוא 2 i, והטווח שלⁱ הוא -3 עד 3.
      R: נקודות השבירה של עמידות חיידקים נגד חומרים אנטי-מיקרוביאליים המתוקננים על ידי CLSI.
      f: התפלגות התדרים של MIC.
      הערה: מדד Lar הכללי הוא הממוצע האריתמטי של כל מדדי Lar. לאחר חישוב מדד Lar, עגל את הערך הסופי לשתי ספרות משמעותיות אחרי הנקודה העשרונית.

2. מערכת סינון פאגים חכמה בתפוקה גבוהה⁹

1. הכנת בלוק זרעי פאגים וצלחות מודגרות דו-שכבתיות המכילות חיידקים.
   1. השתמש בשיטת אגר דו-שכבתית¹⁰ או בשיטת תרבית נוזלית¹¹ להכנת פאגים שונים. לדלל לריכוז מקביל מתאים עם טיטר של 1 x 10^4-5 pfu/mL, ולהוסיף 200 μL של פאג inoculum לתוך בלוק זרעים 96 באר.
   2. הכינו צלחות דו-שכבתיות עם חיידקים (10 מ"ל של אגר מדיה תחתון [אגר 12 גרם / ליטר] ו -6 מ"ל של מדיה חצי אגר עליונה [6 גרם / ליטר] עם 100 מיקרוליטר חיידקים [0.5 מקפרלנד]) לבדיקה.
   3. הכינו צלחת דגירה דו-שכבתית עבור כל זן לבדיקה. השאירו רווח מתחת למכסה של הצלחת הדו-שכבתית ונשפו לייבוש משטח האגר בארון הבטיחות הביולוגית.
2. בדיקת סקר
   1. הניחו את גוש זרעי הפאגים המוכן ואת הצלחת הדו-שכבתית על המוביל הנייד של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות, והעבירו את כל אינוקולה הפאג'ים למשטח החצי-אגר. המשך את המחזורים עד להשלמת כל הזנים שנבדקו.
   2. הניחו לצלחות הדו-שכבתיות המחוסנות להישאר ב-RT עד שהלחות בכתמי החיסון תיספג במלואה לתוך האגר למחצה.
   3. הפוך את הצלחות ודגר בתנאים מתאימים עבור הזנים שנבדקו במשך 4-6 שעות כדי להבטיח כי כתמים ליטיים ברורים נוצרים.
3. ניתוח נתונים
   1. השג ושמור את התמונה של תוצאת הניסוי של כל לוח דו-שכבתי על-ידי ממיר רכישת התמונה (שלבים 1.5.4-1.5.6).
   2. רשום את המספר והמורפולוגיה של צורות הכתמים השונות לתוך גיליון אלקטרוני בהתבסס על התמונות שהתקבלו, וחשב את הפרופורציות המתאימות של סוגי הפאגים השונים.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול של מערכת AST חכמה בעלת תפוקה גבוהה, היישום שלה הודגם על ידי סלמונלה מעופות בשאנדונג, סין, כדוגמה.

הגידול של זני סלמונלה על לוחות אגר עם אמפיצילין (R של 32 מיקרוגרם/מ"ל) בריכוזים של 2 עד 256 מיקרוגרם/מ"ל שנקבעו על-ידי ממיר רכישת התמונה מוצג באיור...

Discussion

שיטת דילול אגר כבר מבוססת היטב בשימוש נרחב. העיקרון של מערכת AST בתפוקה גבוהה היה זה של שיטת דילול אגר. אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול היה העברה מדויקת בתפוקה גבוהה של 96 חיסונים בו זמנית, שבוצעה מספר פעמים ברציפות. כדי להשלים את השלב הקריטי הזה, הפינים של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות היו אחידים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well  culture plate	Beijing lanjieke Technology Co., Ltd	11510
96-dot matrix AST image acquisition system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
96-dot matrix inoculator	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8274-1
Amikacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A857053
Amoxicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A822839
Ampicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A830931
Analytical balance	Sartorius	BSA224S
Automated calculation software for Lar index of AMR	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Bacteria Salmonella strains	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Animal origin
Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Ceftiofur	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C873619
Ciprofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824343
Clavulanic acid	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824181
Clean worktable	Suzhou purification equipment Co., Ltd	SW-CJ-2D
Colistin sulfate	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C805491
Culture plate	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Doxycycline	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	D832390
Enrofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	E809130
Filter 0.22 μm	Millipore	SLGP033RB
Florfenicol	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	F809685
Gentamicin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	G810322
Glass bottle 50 mL	Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd	QX-7
High-throughput resistance detection system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Image acquisition converter	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Meropenem	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	M861173
Mueller-Hinton agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB6232
Petri dish 60 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16021-1
Petri dish 90 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16001-1
Salmonella phages	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A
Shaker incubator	Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd	MQD-S2R
Turbidimeter	Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd	F-TC2015
Varms base type library system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Vertical high-pressure steam sterilizer	Shanghai Shen'an medical instrument factory	LDZX-75L
Veterinary pathogen resistance testing management system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright