지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수

요약

여기에서는 지능형 고처리량 항균 감도 검사/파지 스크리닝 시스템의 원리, 구조 및 지침을 소개합니다. 그 응용은 중국 산둥성의 가금류에서 분리한 살모넬라균 을 예로 들어 설명합니다. Lar 지수를 계산하고 항생제 내성 평가에 대한 중요성을 종합적으로 논의합니다.

초록

내성 박테리아에 대한 항균제 감수성 검사(AST) 및 파지 고처리량 스크리닝의 효율성을 개선하고 검출 비용을 줄이기 위해 96도트 매트릭스 접종기, 이미지 획득 변환기 및 해당 소프트웨어를 포함한 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템이 AST 기준 및 CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute)에서 공식화한 내성(R) 중단점에 따라 개발되었습니다. 중국 산둥성의 가금류에서 분리한 1,500개의 살모넬라 균주의 최소 억제 농도(MIC) 분포(R/8에서 8R까지)와 10개의 항균제에 대한 통계는 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템에 의해 수행되었습니다. "항생제가 적고, 내성이 적고, 항생제가 거의 없을 때까지 잔류한다"는 의미의 Lar 지수는 각 MIC의 가중 평균을 계산하고 R로 나누어 구했습니다. 이 접근법은 내성이 강한 균주의 항생제 내성(AMR) 정도를 특성화하기 위해 내성 유병률을 사용하는 것과 비교하여 정확도를 향상시킵니다. AMR이 높은 살모넬라 균주의 경우, 이 시스템에 의해 파지 라이브러리에서 용해 파지를 효율적으로 스크리닝하고 용해 스펙트럼을 계산 및 분석했습니다. 그 결과 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템이 작동 가능하고, 정확하고, 매우 효율적이며, 저렴하고, 유지 관리가 용이하다는 것을 보여주었습니다. 산둥성 수의학 항생제 내성 모니터링 시스템과 결합된 이 시스템은 AMR과 관련된 과학 연구 및 임상 검출에 적합했습니다.

서문

세균성 전염병을 예방하기 위해 항생제가 널리 사용됨에 따라 항생제 내성(AMR)은 전 세계적인 공중 보건 문제가 되었습니다¹. 항생제 내성 퇴치는 역학적 병원체의 항생제 내성 모니터링과 민감한 항균제 및 용해성 박테리오파지의 시너지 요법의 현재 주요 임무이다².

체외 항생제 감수성 검사(AST)는 요법을 모니터링하고 항생제 내성 수치를 감지하기 위한 핵심입니다. 이는 항균 약리학의 중요한 부분이며 임상 약물의 중요한 기초입니다. 미국의 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)와 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)는 AST의 국제 기준을 공식화 및 개정하고 AST 방법 및 중단점을 지속적으로 수정 및 보완하여 특정 "유기체-항균제" 조합의 MIC를 민감성(S), 내성(R) 또는 중간체(I)로 결정합니다.^{3, 4}입니다.

1980년대부터 1990년대까지 자동 마이크로 브로트 희석 기기가 빠르게 개발되어 임상 실습에 적용되었으며, Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM 및 Cobasbact ^5,6,7 등이 그 예입니다. 그러나 이러한 기기는 고가의 소모품이 필요하고 검출 범위는 임상 환자 약물 ^5,6,7을 위해 설계되었습니다. 이러한 이유로 수의학 임상 검사 및 대량의 고내성 균주 검출에는 적합하지 않습니다. 이 연구에서는 96도트 매트릭스 접종기(그림 1), 이미지 획득 변환기(그림 2) 및 해당 소프트웨어⁸을 포함한 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템을 개발하여 한천 희석 방법으로 한 번에 여러 항균제에 대해 박테리아 균주 배치에 대해 AST를 수행했습니다. 또한, 이 시스템은 항생제 내성 박테리아⁹에 대한 파지의 용해 패턴을 검출하고 분석하는 데에도 사용되었으며, 파지 라이브러리에서 용해 파지를 효율적으로 선택했습니다. 이 시스템은 효율적이고 저렴하며 작동하기 쉬운 것으로 밝혀졌습니다.

그림 1: 96 도트 매트릭스 접종기의 구조도. 1: 접종 핀 플레이트; 2: 이동 통신사; 3 : 시드 블록; 4 : 배양 된 판; 5: 베이스; 6 : 작동 핸들; 7: 한계 핀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 이미지 획득 컨버터의 구조도. 1: 쉘; 2 : 디스플레이 화면; 3 : 이미지 획득실; 4 : 검출 보드 베이스 ; 5: 창고 안팎의 감지 보드; 6 : 제어반 ; 7 : 영상 취득 변환 장치; 8 : 광원; 9: 이미지 스캐너. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

이 연구에 사용된 살모넬라 균주는 중국 산둥성 농업과학원 동물과학 및 수의학 연구소 생물안전위원회의 승인을 받은 후 중국 산둥성의 가금류에서 수집되었습니다.

1. 지능형 고처리량 AST 시스템 적용⁸

1. 접종 준비
   1. 품질 관리 유기체 대장균과 93개의 살모넬라 균주를 배양하여 37°C에서 16-18시간 동안 Mueller-Hinton 한천(MHA) 플레이트에서 AST를 테스트합니다³.
   2. CLSI 표준³에 명시된 방법에 따라 0.5 McFarland 탁도 기준에 맞게 각 균주의 접종물을 준비한 후 10회 희석합니다.
   3. 멸균 생리식염수 200μL를 96웰 플레이트의 수평 1차 웰(A1)에 음성 대조군으로 배치하고, 품질 관리 유기체의 두 가지 현탁액을 각각 양성 대조군으로 수평 2차 및 3^차 웰(A2 및 A3)에 배치하고 품질 관리를 수행합니다. 테스트된 각 염색제의 희석된 접종 현탁액 200μL를 96웰 시드 블록의 해당 93웰에 추가합니다.
2. 항균 한천 플레이트의 제조
   1. Lar 지수의 계산 범위(0.125R에서 8R까지)에 따라 테스트한 다양한 항균제의 농도 범위를 설정합니다. 농도 범위는 품질 관리 범위 또는 0.0625R(더 낮은 범위에 따름)에서 8R입니다.
      알림: Lar 지수가 계산되지 않은 경우 AST의 필요에 따라 항생제 농도 범위를 설정할 수 있습니다.
   2. CLSI 표준³에 지정된 한천 희석 방법에 따라 적절한 스톡 농도로 시작하여 항생제 용액에 대한 log2 이중 희석 계획을 실행합니다.
   3. 18mL의 Mueller-Hinton 한천 배지가 들어 있는 50mL 유리병을 멸균합니다. 45-50 °C로 냉각된 용융 배지 18mL에 적절한 항균 용액 2mL를 희석하여 넣고 완전히 혼합한 다음 생물 안전 캐비닛의 플레이트에 붓습니다.
   4. 한천이 실온(RT)에서 응고되도록 하고 배양된 접시의 뚜껑 아래에 틈을 두고 불어서 한천 표면을 건조시킨 후 접종합니다.
   5. 항균제의 종류와 농도를 배양 플레이트의 뒷면에 표시하십시오. 각 항균제의 여러 배양 플레이트를 log2-doublebling 희석 순서로 스택에 배열합니다.
   6. 각 항균제에 대한 대조군으로 두 개의 약물이 없는 한천 플레이트를 준비합니다.
3. 96 도트 매트릭스 접종기의 접종 단계
   1. 생물 안전 캐비닛의 96점 매트릭스 접종기 지지대에 고압멸균 접종 핀 플레이트를 설치합니다.
   2. 테스트된 균주와 한천 배양 플레이트가 있는 준비된 시드 블록을 두 플레이트에 대해 동일한 위치 각도로 모바일 캐리어에 놓습니다.
   3. 시드 블록이 접종 핀 플레이트 바로 아래에 오도록 이동 통신사를 밉니다.
   4. 작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 아래로 이동한 다음 96개의 핀을 종자 블록의 96웰에 있는 접종물에 향하게 합니다.
   5. 제어 상태에서 작동 핸들을 놓은 다음 스프링의 작용으로 접종 핀 플레이트를 재설정합니다.
   6. 작동 손잡이를 2-3회 눌러 각 접종물을 잘 저어주고 담그십시오. 배양된 플레이트가 접종 핀 플레이트 바로 아래에 오도록 캐리어 플레이트를 밀고 이동합니다.
   7. 작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 아래로 이동한 다음 1-2초 동안 정지하여 접종 핀이 배양 플레이트의 표면에 완전히 닿도록 합니다.
   8. 작동 핸들을 놓습니다. 이것으로 1회의 접종이 완료됩니다. 다른 배양 플레이트를 교체하고 한 그룹의 항균 한천 플레이트가 완성될 때까지 사이클을 계속합니다.
   9. 다른 접종 핀 플레이트와 시드 블록을 교체하고 테스트된 다른 균주 그룹을 접종합니다. 모든 접종이 완료될 때까지 순환합니다.
      알림: 대조군 한천 플레이트(항균제 없음)를 먼저 접종한 다음 약물 농도가 낮은 것부터 높은 것까지 플레이트를 접종하고 두 번째 대조군 한천 플레이트를 마지막에 접종하여 오염 또는 항균제 이월이 없도록 합니다. 접종 부피는 약 2μL의 각 핀의 자연 증착 부피에 의존합니다.
4. 항균 한천 플레이트 배양
   1. 접종 지점의 수분이 한천에 흡수될 때까지 접종된 항균 한천 플레이트를 RT에서 배양합니다.
   2. 플레이트를 뒤집고 테스트된 균주에 대해 37°C에서 16-20시간 동안 배양하여 억제되지 않은 박테리아가 콜로니를 형성하도록 합니다.
5. 이미지 수집 및 데이터 통계
   1. 96 도트 매트릭스 AST 이미지 수집 시스템을 두 번 클릭하여 프로그램을 엽니다.
   2. 작업 표시줄에서 테스트 정보를 클릭합니다. 새로 만들기 를 클릭하여 새 테스트 작업을 만들고 프롬프트에 따라 코드, 이름, 출처, 박테리아, 균주 수, 항생제 및 그래디언트를 포함한 정보를 입력합니다.
   3. 데이터 수집> 사진 > 테스트 항목을 클릭하여 생성된 새 작업을 선택합니다. 항생제(Antibiotics)를 클릭하여 항생제의 이름을 선택하고 그라데이션(Gradient)을 클릭하여 이 항생제의 초기 농도를 선택합니다.
   4. Connect( 연결 )를 클릭하여 이미지 획득 변환기와 연결합니다.
   5. 해당 배양된 플레이트를 검출 플레이트 베이스에 놓고 방향을 위해 오른쪽 전면에 누락된 각도를 두고 이미지 획득 변환기에 밀어 넣습니다.
   6. 컬렉션을 클릭하여 이미지를 가져옵니다. 항생제 그라데이션은 자동으로 다음 그라데이션으로 이동합니다. 다음 플레이트를 차례로 놓고 이 항생제의 플레이트가 수집될 때까지 수집을 계속 클릭합니다.
   7. Antibiotics(항생제)를 클릭하고 다음 배양 플레이트 세트를 선택합니다. 그라디언트를 클릭하여 시작 그라디언트를 선택하고 이미지 컬렉션의 다음 라운드로 진행합니다.
   8. 모든 수집을 완료한 후 제출을 클릭합니다. 이 프로그램은 이미지의 각 접종 지점에서 포맷된 흰색 픽셀의 수를 자동으로 인식하고 콜로니 형성이 있는지 확인하고 이미지를 MIC 값으로 변환합니다.
   9. Query( 쿼리 )를 클릭하면 테스트된 항생제에 대한 균주의 모든 MIC 결과를 얻을 수 있습니다.
      참고: 지능형 고처리량 AST 시스템은 대규모 박테리아 균주의 MIC를 결정하는 데 적합합니다. 준비, 접종, 배양 및 결과 판독을 포함한 테스트 과정은 3일이 소요됩니다. 항생제의 종류와 MIC 검출 범위는 각각의 필요에 따라 설정할 수 있으며 주요 소모품을 재사용할 수 있습니다.
6. Lar 지수 계산
   1. 다음 공식을 사용하여 Lar 지수를 정확하게 결정하십시오.
      MIC_i: 최소 억제 농도.
      _MIC-3에서 MIC₃까지의 MIC 분포 범위는 R을 중심으로 한 직렬 2중 농도(0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R 및 8R)를 나타냅니다.
      는 2 i이고,ⁱ의 범위는 -3 내지 3이다.
      R : CLSI에 의해 표준화 된 항균제에 대한 박테리아의 내성 중단 점.
      f: MIC 주파수 분포.
      참고: 일반 Lar 지수는 모든 Lar 지수의 산술 평균입니다. Lar 지수를 계산한 후 최종 값을 소수점 뒤의 유효 두 자리로 반올림합니다.

2. 지능형 고처리량 파지 스크리닝 시스템⁹

1. 파지 종자 블록과 박테리아를 포함하는 이중층 배양 플레이트를 준비합니다.
   1. 다른 파지를 만들기 위해 이중층 한천 방법¹⁰ 또는 액체 배양 방법¹¹ 을 사용하십시오. 1 x 10^4-5 pfu/mL의 역가를 사용하여 적절한 병렬 농도로 희석하고 200μL의 파지 접종물을 96웰 종자 블록에 추가합니다.
   2. 테스트할 박테리아(10mL의 하단 한천 배지[한천 12g/L] 및 6mL의 상부 세미 한천 배지[6g/L]와 100μL의 박테리아[0.5 McFarland])가 있는 이중층 플레이트를 만듭니다.
   3. 테스트할 각 균주에 대해 이중층 배양 플레이트를 만듭니다. 이중층 플레이트의 뚜껑 아래에 틈을 두고 불어서 생물 안전 캐비닛의 한천 표면을 건조시킵니다.
2. 선별 검사
   1. 준비된 파지 종자 블록과 이중층 플레이트를 96점 매트릭스 접종기의 이동 캐리어에 놓고 모든 파지 접종물을 반한천 표면으로 옮깁니다. 테스트된 모든 균주가 완료될 때까지 사이클을 계속합니다.
   2. 접종 부위의 수분이 반 한천에 완전히 흡수 될 때까지 접종 된 이중층 플레이트를 RT에 유지하십시오.
   3. 플레이트를 뒤집고 4-6시간 동안 테스트된 균주에 적합한 조건에서 배양하여 명확한 용해 반점이 형성되도록 합니다.
3. 데이터 분석
   1. 이미지 획득 변환기(1.5.4-1.5.6단계)를 사용하여 각 이중층 플레이트의 실험 결과 이미지를 얻고 저장합니다.
   2. 획득한 이미지를 기반으로 다양한 모양의 반점의 수와 형태를 스프레드시트에 기록하고 다양한 종류의 파지의 각 비율을 계산합니다.

결과

지능형 고처리량 AST 시스템의 프로토콜에 따라 중국 산둥성 가금류의 살모넬라균 을 예로 들 수 있습니다.

이미지 획득 변환기에 의해 측정된 2 - 256 μg/mL 농도에서 암피실린(R 32 μg/mL)이 포함된 한천 플레이트에서 살모넬라 균주의 성장은 그림 3에 나와 있습니다. 수평 1st^웰 A1은 음성 대조군이었고 콜로니 성장을 보여주지 않았습니...

토론

한천 희석 방법은 잘 확립되어 널리 사용되고 있습니다. 고처리량 AST 시스템의 원리는 한천 희석 방법의 원리였습니다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 중 하나는 한 번에 96개의 접종물을 정확하게 고처리량으로 이전하는 것이었고, 이는 연속으로 여러 번 수행되었습니다. 이 중요한 단계를 완료하기 위해 96 도트 매트릭스 접종기의 핀은 균일하고 매우 매끄러웠습니다. 각 핀의 자연 증착은 약 2μL?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well  culture plate	Beijing lanjieke Technology Co., Ltd	11510
96-dot matrix AST image acquisition system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
96-dot matrix inoculator	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8274-1
Amikacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A857053
Amoxicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A822839
Ampicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A830931
Analytical balance	Sartorius	BSA224S
Automated calculation software for Lar index of AMR	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Bacteria Salmonella strains	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Animal origin
Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Ceftiofur	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C873619
Ciprofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824343
Clavulanic acid	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824181
Clean worktable	Suzhou purification equipment Co., Ltd	SW-CJ-2D
Colistin sulfate	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C805491
Culture plate	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Doxycycline	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	D832390
Enrofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	E809130
Filter 0.22 μm	Millipore	SLGP033RB
Florfenicol	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	F809685
Gentamicin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	G810322
Glass bottle 50 mL	Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd	QX-7
High-throughput resistance detection system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Image acquisition converter	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Meropenem	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	M861173
Mueller-Hinton agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB6232
Petri dish 60 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16021-1
Petri dish 90 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16001-1
Salmonella phages	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A
Shaker incubator	Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd	MQD-S2R
Turbidimeter	Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd	F-TC2015
Varms base type library system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Vertical high-pressure steam sterilizer	Shanghai Shen'an medical instrument factory	LDZX-75L
Veterinary pathogen resistance testing management system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright