Применение интеллектуальной высокопроизводительной системы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам/скрининга фагов и индекса устойчивости к противомикробным препаратам Lar

Резюме

Здесь мы познакомим вас с принципом, структурой и инструкцией интеллектуальной высокопроизводительной системы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам/скрининга фагов. Его применение проиллюстрировано на примере сальмонеллы , выделенной от домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай. Рассчитан индекс Лара и всесторонне рассмотрено его значение в оценке антимикробной резистентности.

Аннотация

Для повышения эффективности тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) и высокопроизводительного скрининга фагов на резистентные бактерии, а также для снижения затрат на обнаружение, была разработана интеллектуальная высокопроизводительная система AST/фагового скрининга, включающая 96-точечный матричный инокулятор, преобразователь получения изображений и соответствующее программное обеспечение, в соответствии с критериями AST и точками разрыва резистентности (R), сформулированными Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). АСТ и статистические данные о распределении минимальной ингибирующей концентрации (МПК) (от R/8 до 8R) 1500 штаммов сальмонеллы , выделенных от домашней птицы в Шаньдуне, Китай, по сравнению с 10 антимикробными агентами были проведены с помощью интеллектуальной высокопроизводительной системы скрининга АСТ/фагов. Индекс Лара, означающий «меньше антибиотика, меньше резистентности и остаточный до тех пор, пока антибиотика мало», был получен путем вычисления средневзвешенного значения каждого МПК и деления на R. Такой подход повышает точность по сравнению с использованием показателя распространенности резистентности для характеристики степени устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) штаммов с высокой устойчивостью. Для штаммов сальмонелл с высоким УПП литические фаги были эффективно отобраны из библиотеки фагов с помощью этой системы, а также рассчитан и проанализирован спектр лизиса. Результаты показали, что интеллектуальная высокопроизводительная система скрининга АСТ/фагов является работоспособной, точной, высокоэффективной, недорогой и простой в обслуживании. В сочетании с Шаньдунской ветеринарной системой мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам эта система была пригодна для научных исследований и клинического выявления УПП.

Введение

Поскольку противомикробные препараты широко используются для профилактики бактериальных инфекционных заболеваний, устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) стала глобальной проблемой общественного^{здравоохранения1}. Борьба с УПП в настоящее время является основной миссией мониторинга УПП эпидемиологических патогенов и синергической терапии чувствительных антимикробных препаратов и литических бактериофагов².

Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам in vitro (АСТ) является основой для мониторинга терапии и определения уровня УПП. Это важная часть фармакологии противомикробных препаратов и важнейшая основа для клинических препаратов. Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI) Соединенных Штатов Америки и Европейский комитет по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам (EUCAST) сформулировали и пересмотрели международные критерии АСТ, а также постоянно модифицировали и дополняли методы АСТ и контрольные точки для определения МПК одной определенной комбинации «организм-антимикробный агент» как чувствительного (S), резистентного (R) или промежуточного (I)^{3. 4}. См.

В период с 1980-х по 1990-е годы были быстро разработаны и применены в клинической практике автоматические приборы для разведения микробульона, в том числе Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM и Cobasbact ^5,6,7. Однако эти приборы были дорогими, требовали дорогостоящих расходных материалов, а их диапазоны обнаружения были рассчитаны на клиническое лечение пациентов ^5,6,7. По этим причинам они не подходят для ветеринарного клинического обследования и выявления больших количеств высокорезистентных штаммов. В данном исследовании была разработана интеллектуальная высокопроизводительная система скрининга АСТ/фагов, включающая 96-точечный матричный инокулятор (рис. 1), преобразователь получения изображений (рис. 2) и соответствующее программное обеспечение⁸, для проведения АСТ для партии штаммов бактерий против нескольких антимикробных агентов одновременно методом агарового разведения. Кроме того, система также использовалась для обнаружения и анализа паттернов лизиса фагов против устойчивых к противомикробным препаратам бактерий⁹, а литические фаги были эффективно отобраны из библиотеки фагов. Эта система оказалась эффективной, доступной и простой в эксплуатации.

Рисунок 1: Структурная схема 96-точечного матричного инокулятора. 1: Штифтовая пластина для прививки; 2: Оператор мобильной связи; 3: Исходный блок; 4: Инкубационная пластина; 5: База; 6: Рукоятка управления; 7: Ограничительный штифт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Структурная схема конвертера для получения изображений. 1: Оболочка; 2: Экран дисплея; 3: Помещение для получения изображений; 4: Основание платы детектирования; 5: Доска обнаружения на складе и за его пределами; 6: Пульт управления; 7: Устройство преобразования изображения; 8: Источник света; 9: Сканер изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Штаммы сальмонеллы, использованные в этом исследовании, были получены от домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай, после получения одобрения от Комитета по биобезопасности Института животноводства и ветеринарной медицины Шаньдунской академии сельскохозяйственных наук, Китай.

1. Применение интеллектуальной высокопроизводительной системы АСТ⁸

1. Подготовка посевного материала
   1. Инкубируют микроорганизм контроля качества Escherichia coli и 93 штамма сальмонеллы для тестирования на АСТ на планшетах из агара Мюллера-Хинтона (MHA) в течение 16-18 ч при 37 °C³.
   2. Приготовьте посевной материал каждого штамма в соответствии со стандартом мутности 0,5 по Мак-Фарланду на основе метода, указанного в стандарте CLSI³, а затем разбавьте в 10 раз.
   3. Поместите 200 мкл стерильного физиологического раствора в горизонтальную 1-ю лунку (А1) 96-луночной планшета в качестве отрицательного контроля, две суспензии микроорганизма контроля качества в горизонтальные 2-ю и^3-ю лунки (А2 и А3) в качестве положительного контроля и контроля качества, соответственно. Добавьте 200 мкл разбавленной суспензии посевного материала каждого испытуемого пятна в соответствующие 93 лунки в 96-луночном семенном блоке.
2. Приготовление антимикробной агаровой пластины
   1. Установите диапазоны концентраций различных антибактериальных средств, тестируемых в соответствии с диапазоном расчета индекса Лара (от 0,125R до 8R). Концентрация колеблется от диапазона контроля качества или 0,0625R (в зависимости от нижнего диапазона) до 8R.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если индекс Лара не рассчитан, диапазон концентраций антибиотиков может быть установлен в соответствии с потребностями АСТ.
   2. Выполняйте схему удвоения log2 для раствора антибиотика, начиная с подходящей концентрации запаса на основе метода разбавления агара, указанного в стандарте^{CLSI 3}.
   3. Стерилизовать стеклянные флаконы объемом 50 мл, содержащие 18 мл агаровой среды Мюллера-Хинтона. Добавьте 2 мл соответствующих разведений противомикробного раствора к 18 мл расплавленной среды, охлажденной до 45-50 °C, тщательно перемешайте и разлейте по тарелкам в шкафу биобезопасности.
   4. Дайте агару застыть при комнатной температуре (RT), оставьте зазор под крышкой инкубированных планшетов и продуйте, чтобы высушить поверхность агара перед инокуляцией.
   5. Маркируйте типы противомикробных агентов и их концентрации на обратной стороне инкубированных планшетов. Расположите несколько инкубационных планшетов каждого противомикробного препарата в стопку в порядке удвоения log2.
   6. Подготовьте две безлекарственные агаровые пластины в качестве контрольных для каждого противомикробного средства.
3. Этапы инокуляции для 96-точечного матричного инокулятора
   1. Установите булавочную пластину для автоклавного инокуляции на опору 96-точечного матричного инокулятора в шкафу биобезопасности.
   2. Подготовленный семенной блок с испытуемыми штаммами и агаровую инкубационную пластину помещают на подвижный носитель с одинаковым углом позиционирования для двух планшетов.
   3. Сдвиньте передвижной держатель так, чтобы семенной блок находился прямо под пластиной инокуляционного штифта.
   4. Нажмите на рукоятку управления, переместите пластину инокуляционного штифта вниз и направьте штифты 96 на инокуляцию в 96 лунок семенного блока.
   5. Отпустите рукоятку управления с управлением, затем сбросьте пластину штифта прививки под действием пружины.
   6. Нажмите на ручку управления 2-3 раза, чтобы хорошо перемешать каждый посевной материал и окунуть. Надавите и переместите несущую пластину так, чтобы инкубационная пластина находилась прямо под пластиной для прививки.
   7. Нажмите на рукоятку управления, переместите пластину инокуляционного штифта вниз и остановитесь на 1-2 с, чтобы инокуляционные штифты полностью соприкоснулись с поверхностью инкубируемой планшета.
   8. Отпустите рукоятку управления. На этом одна прививка завершена. Замените другую инкубационную чашку и продолжайте цикл до тех пор, пока не закончится одна группа антимикробных агаровых планшетов.
   9. Замените другую инокуляционную контактную пластину и семенной блок и инокуляцию другой группы тестируемых штаммов. Цикл до тех пор, пока все прививки не будут завершены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала засейте контрольную агаровую пластину (без антимикробного агента), затем планшет в порядке концентрации препарата от низкой до высокой и вторую контрольную агаровую пластину последней, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения или переноса антимикробного агента. Объем инокуляции зависит от объема естественного осаждения каждого штифта, составляющего примерно 2 мкл.
4. Инкубация антимикробных агаровых планшетов
   1. Инкубируют модифицированные антимикробные агаровые пластины при РТ до тех пор, пока влага в пятнах посева не впитается в агар.
   2. Переверните планшеты и инкубируйте их в течение 16-20 ч при 37 °C для испытуемых штаммов, чтобы убедиться, что неингибированные бактерии образуют колонии.
5. Получение изображений и статистика данных
   1. Дважды щелкните по 96-точечной матричной системе получения изображений AST , чтобы открыть программу.
   2. Нажмите « Тестовая информация » на панели задач. Нажмите « Создать », чтобы создать новое тестовое задание, и заполните информацию в соответствии с подсказками, включая код, название, источник, бактерии, количество штаммов, антибиотиков и градиент.
   3. Нажмите на пункт Data Collection > Photograph > Test , чтобы выбрать новую созданную задачу. Нажмите « Антибиотики », чтобы выбрать название антибиотика, и нажмите « Градиент », чтобы выбрать начальную концентрацию этого антибиотика.
   4. Нажмите « Подключиться», чтобы подключиться к конвертеру для получения изображений.
   5. Поместите соответствующие инкубированные планшеты на основание планшета обнаружения так, чтобы недостающий угол был справа спереди для ориентации, и вставьте их в конвертер для получения изображений.
   6. Нажмите на Коллекцию , чтобы получить изображения. Градиент антибиотика автоматически перейдет к следующему градиенту. Поместите следующую тарелку по очереди и продолжайте нажимать на «Сбор » до тех пор, пока не будут собраны пластины для этого антибиотика.
   7. Нажмите « Антибиотики» и выберите следующий набор инкубационных планшетов. Нажмите на Градиент, чтобы выбрать начальный градиент и перейти к следующему раунду сбора изображений.
   8. После завершения всех коллекций нажмите « Отправить». Программа автоматически распознает количество белых пикселей, отформатированных в каждой точке посева на изображениях, определит, есть ли образование колоний, и преобразует изображения в значения MIC.
   9. Нажмите « Запрос», чтобы получить все результаты МПК штаммов против тестируемых антибиотиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интеллектуальная высокопроизводительная система AST подходит для определения MICs больших партий бактериальных штаммов. Процесс тестирования, включая подготовку, посев, инкубацию и считывание результатов, занимает 3 дня. Типы антибиотиков и диапазоны обнаружения МПК могут быть установлены в соответствии с соответствующими потребностями, а основные расходные материалы могут быть использованы повторно.
6. Расчет индекса Лара
   1. Точно определите индекс Лара по формуле: , где:
      MIC_i: минимальная ингибирующая концентрация.
      Диапазон распределений МПК от _MIC-3 до MIC₃ представляет собой последовательные двойные концентрации, центрированные на R: 0,125R, 0,25R, 0,5R, R, 2R, 4R и 8R.
      равен 2ⁱ, а диапазон i равен -3 до 3.
      R: точки разрыва резистентности бактерий к антимикробным препаратам, стандартизированные CLSI.
      f: частотное распределение микрофона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий индекс Лара представляет собой среднее арифметическое всех индексов Лара. После вычисления индекса Lar округлите итоговое значение до двух значащих цифр после запятой.

2. Интеллектуальная высокопроизводительная система фагового скрининга⁹

1. Подготовка фагового затравочного блока и двухслойных инкубационных планшетов, содержащих бактерии.
   1. Для получения различных фагов используют метод¹⁰ двухслойного агара или метод¹¹ жидкого культивирования. Разбавляют до подходящей параллельной концентрации с титром 1 x 10^4-5 КОЕ/мл и добавляют 200 мкл фагового посевного материала в 96-луночный посевной блок.
   2. Изготовьте двухслойные пластины с бактериями (10 мл нижней агаровой среды [агар 12 г/л] и 6 мл верхней полуагарной среды [6 г/л] со 100 мкл бактерий [0,5 Макфарланда]) для испытания.
   3. Сделайте двухслойную инкубационную пластину для каждого тестируемого штамма. Оставьте зазор под крышкой двухслойной пластины и выдуйте для просушки поверхность агара в шкафу биобезопасности.
2. Скрининговый тест
   1. Подготовленный фаговый затравочный блок и двухслойную пластину поместить на мобильный носитель 96-точечного матричного инокулятора и перенести весь фаговый посевной материал на поверхность полуагара. Продолжайте циклы до тех пор, пока не будут завершены все тестируемые штаммы.
   2. Оставьте модифицированные двухслойные пластины на RT до тех пор, пока влага в пятнах посева полностью не впитается в полуагар.
   3. Переверните планшеты и инкубируйте в условиях, подходящих для испытуемых штаммов, в течение 4-6 ч, чтобы обеспечить образование четких литических пятен.
3. Анализ данных
   1. Получение и сохранение изображения экспериментального результата каждой двухслойной пластины с помощью преобразователя получения изображений (шаги 1.5.4-1.5.6).
   2. Запишите количество и морфологию пятен различной формы в электронную таблицу на основе полученных изображений и рассчитайте соответствующие пропорции различных видов фагов.

Результаты

Следуя протоколу интеллектуальной высокопроизводительной системы АСТ, ее применение было проиллюстрировано на примере сальмонеллы домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай.

Рост штаммов сальмонелл на агаровых пластинах с ампициллином (R 32 мкг/мл) в концентрац...

Обсуждение

Метод разбавления агаром хорошо зарекомендовал себя и широко используется. Принцип работы высокопроизводительной системы АСТ был основан на методе разбавления агара. Одним из важнейших шагов в рамках протокола была точная высокопроизводительная передача 96 инокулей за один раз, кото?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well  culture plate	Beijing lanjieke Technology Co., Ltd	11510
96-dot matrix AST image acquisition system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
96-dot matrix inoculator	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8274-1
Amikacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A857053
Amoxicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A822839
Ampicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A830931
Analytical balance	Sartorius	BSA224S
Automated calculation software for Lar index of AMR	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Bacteria Salmonella strains	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Animal origin
Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Ceftiofur	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C873619
Ciprofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824343
Clavulanic acid	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824181
Clean worktable	Suzhou purification equipment Co., Ltd	SW-CJ-2D
Colistin sulfate	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C805491
Culture plate	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Doxycycline	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	D832390
Enrofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	E809130
Filter 0.22 μm	Millipore	SLGP033RB
Florfenicol	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	F809685
Gentamicin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	G810322
Glass bottle 50 mL	Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd	QX-7
High-throughput resistance detection system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Image acquisition converter	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Patented product
Meropenem	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	M861173
Mueller-Hinton agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB6232
Petri dish 60 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16021-1
Petri dish 90 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16001-1
Salmonella phages	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A
Shaker incubator	Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd	MQD-S2R
Turbidimeter	Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd	F-TC2015
Varms base type library system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Vertical high-pressure steam sterilizer	Shanghai Shen'an medical instrument factory	LDZX-75L
Veterinary pathogen resistance testing management system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright