Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

Abstract

פינצטה מגנטית של מולקולה בודדת (MTs) שימשה ככלי רב עוצמה לחקירה מאולצת של ביומולקולות, כגון חומצות גרעין וחלבונים, ולכן הן צפויות להיות שימושיות בתחום המכנוביולוגיה. מכיוון שהשיטה מסתמכת בדרך כלל על מעקב מבוסס תמונה של חרוזים מגנטיים, המהירות המותרת בהקלטה וניתוח של תמונות, כמו גם התנודות התרמיות של החרוזים, הקשו זה מכבר על יישומה בצפייה בשינויים מבניים קטנים ומהירים במולקולות המטרה. מאמר זה מתאר שיטות מפורטות לבנייה ותפעול של מערך MT ברזולוציה גבוהה שיכול לפתור דינמיקה ננומטרית, אלפית שנייה של ביומולקולות והקומפלקסים שלהן. כדוגמאות ליישום, מודגמים ניסויים עם סיכות ראש של DNA וקומפלקסים של SNARE (מכונות איחוי ממברנה), תוך התמקדות באופן שבו ניתן לזהות את המצבים והמעברים הארעיים שלהם בנוכחות כוחות בקנה מידה פיקוניוטון. אנו מצפים כי MTs במהירות גבוהה ימשיכו לאפשר מדידות ננומכניות בדיוק גבוה על מולקולות החשות, מעבירות ומייצרות כוחות בתאים, ובכך יעמיקו את ההבנה שלנו ברמה המולקולרית של מכנוביולוגיה.

Introduction

תאים חשים באופן פעיל ומגיבים לגירויים מכניים. בעשותן כך, ביומולקולות רבות מציגות תכונות תלויות כוח המאפשרות שינויים מבניים דינמיים. דוגמאות מוערכות כוללות תעלות יונים רגישות למכנו ואלמנטים ציטו-שלדיים המספקים לתאים מידע מכני חשוב מסביבתם.

בנוסף, מולקולות בעלות אופי ייחודי של נשיאת כוח יכולות להיחשב גם רגישות למכנו במובן רחב יותר. לדוגמה, היווצרות מקומית והתכה של דופלקסים של חומצות גרעין, כמו גם מבנים מסדר גבוה יותר כגון G-quadruplexes, ממלאים תפקידים מכריעים בשכפול, שעתוק, רקומבינציה, ולאחרונה, עריכת גנום. יתר על כן, כמה חלבונים עצביים המעורבים בתקשורת סינפטית לבצע את תפקידיהם על ידי יצירת כוחות פיזיים העולים על רמות של אינטראקציות בין-מולקולריות טיפוסיות. לא משנה איזו דוגמה חוקרים, חקירת ננומכניקה של הביומולקולות המעורבות בדיוק מרחבי-זמני גבוה תוכיח את עצמה כשימושית ביותר בחשיפת מנגנונים מולקולריים של התהליכים המכנוביולוגיים הקשורים 1,2,3.

שיטות ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת שימשו ככלים רבי עוצמה לבחינת התכונות המכניות של ביומולקולות 2,4,5,6. הם יכולים לעקוב אחר שינויים מבניים בחומצות גרעין ובחלבונים במקביל להפעלת כוח, ובכך לבחון תכונות תלויות כוח. שני מערכים ידועים הם פינצטה אופטית ופינצטה מגנטית (MTs), המשתמשים בחרוזים בגודל מיקרון כדי לתפעל מולקולות 5,6,7,8. בפלטפורמות אלה, פוליסטירן (עבור פינצטה אופטית) או חרוזים מגנטיים (עבור MTs) קשורים למולקולות מטרה (למשל, חומצות גרעין וחלבונים) באמצעות "ידיות" מולקולריות, העשויות בדרך כלל מקטעים קצרים של DNA דו-גדילי (dsDNA). לאחר מכן החרוזים מועברים כדי להפעיל כוח ומצולמים כדי לעקוב אחר מיקומם המדווח על שינויים מבניים במולקולות המטרה. פינצטה אופטית ומגנטית ניתנות במידה רבה להחלפה ביישומים שלהן, אך קיימים הבדלים חשובים בגישותיהן לשליטה בכוח. פינצטה אופטית היא במהותה מכשירי מהדק מיקום הלוכדים חרוזים במקומם, שבגללם הכוח המופעל משתנה כאשר מבנה מטרה עובר שינויי צורה; הארכה מוגברת, כגון מפתיחה, משחררת את הקשירה ומפחיתה מתח, ולהיפך. למרות שניתן ליישם משוב אקטיבי כדי לשלוט בכוח בפינצטה אופטית, MTs לעומת זאת פועלים באופן טבעי כמכשיר מהדק כוח, תוך ניצול כוחות מגנטיים יציבים בשדה רחוק על ידי מגנטים קבועים, שיכולים לעמוד גם בהפרעות סביבתיות.

למרות ההיסטוריה הארוכה והעיצוב הפשוט שלהם, MTs פיגרו אחרי פינצטה אופטית ביישומים שלהם למדידות דיוק גבוה, בעיקר בגלל אתגרים טכניים במעקב חרוזים מהיר. לאחרונה, עם זאת, מספר קבוצות הובילו במשותף שיפור רב-גוני של חומרה ותוכנה עבור מכשירי MT 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . בעבודה זו, אנו מציגים דוגמה של מערך כזה הפועל במהירות של 1.2 קילוהרץ ומתארים כיצד להשתמש בו לביצוע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח. כמערכות מודל, אנו משתמשים בסיכות ראש של DNA ובקומפלקסים של SNARE עצבי ובוחנים את השינויים המבניים המהירים שלהם במשטר הפיקוניוטון. סיכות ראש DNA מציגות מעברים פשוטים של שני מצבים בטווח כוח מוגדר היטב20,21, ולכן משמשות כמודלים צעצוע כדי לאמת את הביצועים של מערך פינצטה. כאשר חלבוני SNARE מתאספים לקומפלקס רגיש לכוח המניע היתוך ממברנה22, הם נחקרו בהרחבה גם על ידי ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת 14,23,24,25. מוצגות גישות סטנדרטיות לניתוח נתונים וחילוץ מידע שימושי על תרמודינמיקה וקינטיקה. אנו מקווים שמאמר זה יוכל להקל על אימוץ MTs מדויקים במחקרים מכנוביולוגיים ולהניע את הקוראים לחקור את מערכות העניין הרגישות לכוח שלהם.

Protocol

כל החומרים והציוד המתוארים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים. תוכנת LabVIEW להפעלת הגדרת MT במהירות גבוהה המתוארת להלן, כמו גם סקריפטים של MATLAB לניתוח נתונים לדוגמה, מופקדים ב- GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) וזמינים לציבור.

1. בניית מנגנון

הערה: העיקרון הכללי של בניית MT במהירות גבוהה דומה למערכות MT סטנדרטיות קונבנציונליות, למעט השימוש במצלמת מוליכים למחצה (CMOS) משלימה במהירות גבוהה ומקור אור קוהרנטי בעוצמה גבוהה (איור 1). עיין במקורות אחרים לקבלת תיאורים נוספים של מכשירי MT סטנדרטיים 5,26,27.

  1. הגדר מיקרוסקופ הפוך על שולחן אופטי נגד רטט. התקן מצלמת CMOS במהירות גבוהה ותופס פריימים.
  2. בניית שלב תרגום למניפולציה של מגנטים בתלת מימד. הרכיבו שלב ליניארי ממונע (>20 מ"מ נסיעה) אנכית על גבי שלב XY ידני.
    הערה: התנועה האנכית שולטת בכוח, ואילו שלב XY מיועד ליישור ידני של מגנטים לציר האופטי לצורך הבנייה הראשונית של ההתקנה.
  3. התקן מנוע צעד סיבובי ומערכת חגורה וגלגלת למגנטים מסתובבים.
    הערה: החגורה משדרת את התנועה הסיבובית בין מוט המנוע לבין מגנטים הנמצאים במרחק של כמה סנטימטרים זה מזה. סיבוב המגנטים הוא פנימי למניפולציה התרגומית.
  4. הרכיבו את המגנטים. השתמשו במחזיק אקריליק (שהוזמן מחברה יצרנית; ראו איור משלים S1) שיכול לאחסן בחוזקה שני מגנטים זהים במקביל, עם רווח מוגדר היטב של 1 מ"מ בין המגנטים (איור 1B). כדי לנצל את הכוח המרבי שניתן להשיג עם זוג מגנטים נתון, התאימו את המיקום האנכי של שלב התרגום כך שהמשטח התחתון של המגנטים יתיישר עם מישור הדגימה כאשר הוא מועבר למיקום הנמוך ביותר.
    הערה: עיין ב- Lipfert et al. לקבלת מידע נוסף על עיצוב המחזיק ותצורה של מגנטים28. הגובה והכיוון של מגנטים נשלטים על ידי תוכנת LabVIEW בשילוב עם איסוף נתונים.
  5. צפייה בעדשה אובייקטיבית בהגדלה נמוכה, יישרו את המגנטים למרכז שדה הראייה. בדקו שסיבוב המגנטים אינו גורם לתזוזה גדולה של מרכז זוג המגנטים.
    הערה: אם נקודת האמצע בין המגנטים מסתובבת סביב ציר הסיבוב, סביר להניח שהמגנטים אינם ממורכזים בגלל מחזיק לא מושלם. רמה קטנה של חוסר התאמה ביחס לגודל הפער היא נסבלת, מכיוון שסיבוב המגנט נועד רק לבדיקת קשירה והפעלת מומנטים ביישומים ספציפיים.
  6. התקן דיודה סופרלומינסנטית (SLD) להארת חרוזים. מעבירים את הקרן דרך רווח של 1 מ"מ בין שני המגנטים. יש לוודא שהקרן מחוברת כראוי כדי להתאים לרווח והתאורה אינה מוצללת על ידי המגנטים.
  7. התקן סורק עדשות piezo על האף והרכיב עדשה אובייקטיבית 100x טבילת שמן (צמצם מספרי [NA]: 1.45) למעקב אחר חרוזים. כדי למנוע ממצאים פוטנציאליים במעקב אחר תוצאות, ודא שהתאורה נשמרת באופן אחיד בעת הזזת המגנטים. לבסוף, התאם את רמת האור לבהירות המרבית מבלי להרוות פיקסלים.
    הערה: להשוואה בין מקורות אור שונים למעקב מהיר אחר חרוזים, עיין ב- Dulin et al.29.

2. כיול הכוח המגנטי

  1. באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR; ראו טבלה 1), הכינו מקטעי dsDNA של 5kbp (באמצעות Primer B, Primer Z_5k ו-λ-DNA) המסומנים בביוטין בקצה אחד (לחיבור פני השטח) ואזיד בקצה השני (לחיבור חרוזים).
  2. לאחר סעיף 6, הכינו תא זרימה עם מולקולות 5 kbp.
  3. לאחר סעיף 7, זהה מבנה קשירת חרוזים טוב על ידי אימות ההרחבה והסיבוב שלו. בפרט, הקפד לבחור חרוז עם מסלול סיבוב מינימלי (כלומר, עם רדיוס <200 ננומטר) כדי למזער את היסט גובה החרוז עקב חיבור לא ממורכז30,31. לאחר זיהוי קשירה טובה, התחל לעקוב אחר חרוזים, תוך התייחסות לסעיף 9.
  4. אם ההתקנה חדשה, אפיין את הרעש והיציבות שלה למדידות אמינות ברזולוציה גבוהה. מקמו את המגנט ~3 מ"מ מפני השטח של תא הזרימה (כדי להחיל >10 pN ולדכא את התנועה הבראונית של חרוז), עקבו אחר מיקום z של החרוז ב-1.2 קילוהרץ, וחשבו את סטיית אלן (AD) מסדרת הזמן קואורדינטות z 32,33 (איור 2C). בדקו כי ערכי אלצהיימר של ננומטרים בודדים ניתנים להשגה במשטר המהירות הגבוהה (<0.1 שניות), וכי מעקב דיפרנציאלי (מיקום חרוז מגנטי ביחס לחרוז ייחוס) מפחית את האלצהיימר בטווח הזמן הארוך יותר.
    הערה: בדרך כלל אנו מקבלים AD של <3 ננומטר בקצב המרבי (רזולוציה של 1.2 קילו-הרץ או 0.83 אלפיות השנייה), וה-AD ממשיך לרדת לפחות עד 10 שניות, מה שמרמז על סחף מינימלי. אחרים דיווחו על ערכים דומים בהגדרות דומות 9,10,11,12,34.
  5. עם מגנטים במצב מנוחה (F ~ 0 pN), רשום את קואורדינטות x ו - y של החרוז הקשור ב- 1.2 קילוהרץ. רשום את המיקום לתקופה ארוכה מספיק (כלומר, ארוכה מספיק מזמן ההרפיה האופייני של תנודות35) כך שהתנועה הבראונית נדגמת מספיק.
    הערה: כאן, כיוון ה-x הוא לאורך כיוון השדה המגנטי, ואילו התנועה ב-y מייצגת את התנועה הרוחבית בניצב לשדה.
  6. קרבו את המגנטים לתא הזרימה וחזרו על מדידות מיקום החרוזים עד שהמגנטים נוגעים בעדינות בחלק העליון של תא הזרימה. נעו בצעדים גדולים (למשל, 1-2 מ"מ) כאשר המגנטים נמצאים במרחק של יותר מ-7 מ"מ ממישור הדגימה (מאחר שהכוח המופעל גדל לאט בשדה הרחוק של מגנטים), אך צמצמו את גודל הצעד בהדרגה (למשל, 0.1-0.5 מ"מ) ככל שהם מתקרבים יותר לכיול עדין יותר ברמות כוח גבוהות יותר (איור 2B).
  7. חשב את הכוח בכל מיקום מגנט, d, באמצעות אחת משתי השיטות החלופיות (סקריפט MATLAB "force calibration.m" הכולל את שתי השיטות מסופק; ראה קובץ משלים 1).
    1. מדדו את השונות של קואורדינטות figure-protocol-5560 y של החרוז (איור 2D) ואת מיקום figure-protocol-5689 z הממוצע של החרוז ביחס למיקום הנמוך ביותר (איור 2B, למטה). לאחר מכן, השתמש במשוואה (1)7,27,36 כדי להעריך את הכוח (עם רדיוס חרוז קבוע R = 1,400 ננומטר ואנרגיה תרמית k RT = 4.11 pN∙nm):
      figure-protocol-6183(1)
    2. לחלופין, חשב את הצפיפות הספקטרלית של הספק (PSD) של קואורדינטות y, Sy (איור 2E). קבע את הכוח המופעל F על ידי התאמת מודל לורנציאני כפול37 ל- Sy הנמדד באמצעות משוואה (2).
      figure-protocol-6603(2)
      כאן, , R הוא רדיוס חרוזים, γ yו- γφ הם מקדמי הגרר התרגומי והסיבובי, בהתאמה (מוערך ממשוואת סטוקס-איינשטיין), kRT היא האנרגיה התרמית, figure-protocol-6925f+ ו- f- הם שני תדרים אופייניים המתקבלים באמצעות משוואה (3).
      figure-protocol-7134 (3)
      הערה: מכיוון שסיומת הקשירה L היא פונקציה של כוח העוקבת אחר מודל השרשרת דמוית התולעת (WLC) המבוסס היטב, הביטויים לעיל משאירים את F כפרמטר המתאים היחיד (אנו מתקנים את R להיות 1,400 ננומטר לשם הפשטות מכיוון שהוא משותף לכל רמות הכוח והערך המדויק אינו משפיע על התוצאות במידה ניכרת). במידת הצורך, טשטוש תנועה והחלקה מרכישת תמונה מבוססת מצלמה חייבים להיחשב38,39, אך השפעה זו זניחה במדידות המהירות הגבוהה שלנו מעל 1 kHz עם קשירה של 5 kbp.
  8. חזור על שלבים 2.4-2.7 לקבלת כמה מבנים נוספים. בדקו שלושה עד חמישה חרוזים שונים כדי לחשב את השתנות הכוח בין החרוזים המגנטיים.
    הערה: יש לשקול שינוי כוח בין החרוזים המגנטיים הנמצאים בשימוש כדי לקבוע את המספר הנכון של מבנים לממוצע. שונות זו קטנה אך יכולה להוביל לטעות של יותר מ-1 pN בכוח הנמדד, אפילו עבור מוצרים מסחריים31. עבור רוב היישומים, שבהם הקביעה המוחלטת של הכוחות המעורבים אינה חיונית, ממוצע תוצאות הכיול של שלושה עד חמישה חרוזים הוא בדרך כלל מספיק. גישה חלופית להסביר שונות זו היא למדוד את הכוח עם קשירה בודדת בתחילת הניסוי, אשר יכול לקחת זמן. אפשרות נוספת היא להטמיע מבני סיכות ראש שנפתחים ברמות כוח ידועות בכל מבנה31.
  9. התווה את הכוח הנמדד כפונקציה של מרחק מגנט והתאים פונקציה מעריכית כפולה לנתונים (איור 2F) באמצעות משוואה (4).
    figure-protocol-8632(4)
    כאן, F0 (קו בסיס), A 1 ו- A 2 (אמפליטודות), ו- d 1 ו- d2 (קבועי דעיכה) הם פרמטרים מתאימים. ודא שערכי הכוח משתי השיטות, כמו גם ההתאמות המעריכיות הכפולות הנובעות מכך, מסכימים במידה רבה (איור 2F,G).
    הערה: כדי לוודא שכיול הכוח מתבצע כראוי, ודא את יחסי הכוח-הארכה של המבנים הנבדקים על-ידי התוויית ההרחבה לעומת הכוח הנמדד.
  10. כדי לתקן את היסט גובה החרוז z off כתוצאה מהטיה תלוית כוח של החרוזים המגנטיים30,31, הערך z off מההיסט הצידי x off, בהתחשב בגיאומטריה של קשירה לא ממורכזת עם רדיוס חרוז באמצעות משוואה (5), והחל את הערכים על ערכי ההרחבה הנמדדים. שלב זה מיושם בסקריפט MATLAB "force calibration.m" (שורות 252-254).
    figure-protocol-9635(5)
    הערה: אף על פי שתיקון זה מבצע שינויים קטנים בהרחבה, במיוחד עבור חרוזים עם רדיוס סיבוב קטן (<200 ננומטר), היסט זה משפיע לעתים קרובות באופן קריטי על התגובה האלסטית, כפי שניתן לראות בשינוי מאיור 2H לאיור 2I 30,31.
  11. בדוק את אורך ההתמדה Lp על-ידי התאמת מודל WLC ניתן להרחבה לנתונים באמצעות משוואה (6).
    figure-protocol-10212(6)
    כאן, L 0 הוא אורך קווי המתאר (1.7 מיקרומטר עבור 5 kbp) ו- K0 הוא המודולוס למתיחה אנתלפית.
    הערה: למרות ש-L p של dsDNA מקובל היטב להיות 40-50 ננומטר במאגר טיפוסי כגון מלח חוצץ פוספט (PBS), נוסחת WLC המיושמת על מולקולות קצרות (<5 kbp) מעריכה באופן שיטתי את L p כמו L0 פוחת31,40. הסיבה לכך היא שמודל WLC הקלאסי מניח פולימר שאורך השרשרת שלו ארוך מספיק מאורך ההתמדה שלו. כאן, קיבלנו Lp = 40 ± 3 ננומטר עבור מבנה 5 kbp (איור 2H), ותיקון ההרחבה הניב K0 הומוגני של 1,100 ± 200 pN (איור 2I). החלת מודל WLC סופי 31,40, כמו גם תיקון לאי-גאוסיות בהתפלגות הרחבה 41, תגדיל מעט את Lp.
  12. לאחר אימות כיול הכוח, החל את פרמטרי ההתאמה המתקבלים של המודל המעריכי הכפול על תוכנת LabVIEW שסופקה (קובץ משלים 2) והמתן עד שהתוכנה תחשב את הכוח הנוכחי בזמן אמת מקריאות מוטוריות (כלומר, מיקום מגנט). מכיוון שביטוי אנליטי עבור הפונקציה ההופכית d(F) אינו זמין, הכינו טבלת בדיקת מידע של d לעומת F בשלבים של 0.1 pN לפי הערכה מספרית של רמות כוח היעד d. אחסן טבלה זו גם בתוכנה כדי לפקד על בקרת הכוח.

3. סינתזה של סיכות שיער DNA

הערה: מבנים של סיכות ראש של דנ"א עבור ניסויי MT מוכנים על-ידי הגברה PCR של אזור של 510 bp ב-λ-DNA עם שני פריימרים מותאמים אישית, שאחד מהם מכיל מבנה סיכת ראש בקצה 5′ שלו (איור 3A). בדרך זו, מוטיב סיכת ראש ממוקם בקצה אחד של מוצר PCR.

  1. מכינים את הפריימרים.
    1. פריימר קדמי: פריימר B_hp שמסומן ב-5′-ביוטין לחיבור משטח זכוכית ונקשר ל-λ-DNA. פריימר זה מכיל מוטיב סיכת ראש עם גבעול 8 bp ולולאה 6 nt, 5′ לאזור קשירת λ.
    2. פריימר הפוך: פריימר Z_hp המסומן בתווית 5′-אזיד לחיבור חרוזים מגנטיים ונקשר ל-λ-DNA במרחק של 1 kbp מהפריימר הקדמי.
  2. הגדר והפעל את ה- PCR עם λ-DNA (תבנית), nTaq פולימראז ותנאי PCR סטנדרטיים (ראה טבלה 1). נקו את המוצר עם ערכת טיהור מסחרית.
  3. למדוד את ריכוז הדנ"א על ידי ספיגת UV ב 260 ננומטר (A260) ולבצע אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (2% ג'ל) (ראה טבלה 2) כדי לאמת את גודל המוצר. תפוקה אופיינית היא ~ 35 μL של ~ 600 ננומטר פתרון.

4. הכנת חלבוני SNARE

הערה: קומפלקסים עצביים של SNARE מורכבים על-ידי שילוב של שלושה חלבוני חולדה מטוהרים המבוטאים מ-E. coli: VAMP2/synaptobrevin-2, syntaxin-1A ו-SNAP-25 (איור 3B). כדי להקל על הרכבתם, תחביר ו-SNAP-25 מבוטאים יחד עם מקטע VAMP2 (חסר את אזור N-terminal; המכונה "ΔN-VAMP2") למבנה הנקרא "קומפלקס ΔN", ולאחר מכן מעורבבים עם VAMP2 באורך מלא לאחר חיבור DNA לטיפול ליצירת קומפלקסים מלאים.

  1. הכינו פלסמידים המכילים cDNA לביטוי חלבוני SNARE (רצפי DNA לכל הפלסמידים ניתנים בטבלת החומרים).
    1. הכינו VAMP2 6×His-tagged חסר את תחום הטרנסממברנה (2-97; L32C/I97C עבור קישורים דיסולפידים) משוכפל לתוך וקטור pET28a.
    2. הכינו תחביר-1A חסר את תחום Habc ואת תחום הטרנסממברנה (191-267, I202C/I266C החלפות לקישורים דיסולפידים) המשוכפלים יחד עם 6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49-96) לווקטור pETDuet-1.
    3. הכינו את האיזופורם b באורך מלא מסוג SNAP-25 (2-206, כל C עד A) המשוכפל לווקטור pET28a. זה ישמש להכנת מתחמי ΔN.
    4. הכינו את האיזופורם b באורך מלא SNAP-25 באורך מלא באורך ×6 (1-206, כל C עד A) המשוכפל לווקטור pET28a להוספה ישירה למאגר בדיקת MT כדי להרכיב מחדש את מתחמי SNARE לאחר הפתיחה.
  2. הכינו שתי שפופרות של תאי E. coli של רוזטה (DE3). המר קבוצה אחת עם פלסמידים VAMP2 (משלב 4.1.1), קבוצה אחת עם תחביר-1A/ΔN-VAMP2 ופלסמידים SNAP-25 לא מתויגים (משלבים 4.1.2 ו-4.1.3) לביטוי קומפלקס ΔN, והשנייה עם פלסמידים SNAP-25 המתויגים שלו (משלב 4.1.4).
  3. העבירו את התאים שעברו טרנספורמציה למרק לוריא-ברטאני (LB) עם אנטיביוטיקה מתאימה (כאן, קנמיצין וכלוראמפניקול עבור VAMP2 ו-His-tagged SNAP-25; קנמיצין, כלוראמפניקול ואמפיצילין עבור קומפלקס ΔN). מגדלים אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד (220 סל"ד) עד שהצפיפות האופטית (OD) של המרק מגיעה ל-0.7-0.9.
  4. הוסף 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) כדי לגרום ביטוי חלבון לדגור את התאים במשך 3-4 שעות ב 37 ° C באינקובטור רועד (220 סל"ד).
  5. גלולה למטה את התאים על ידי צנטריפוגה התרבית ב 4,500 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  6. הכינו מאגרים לטיהור חלבונים (ראו טבלה 2).
  7. יש להשהות כדורי תאים המבטאים SNARE ב-40 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח וליז את התאים על ידי סוניקציה על קרח (15% משרעת, 5 שניות דולקות ו-5 שניות, 30 דקות בסך הכל).
  8. צנטריפוגה את הליזט ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C כדי להסיר חומרים בלתי מסיסים.
  9. מעבירים את הסופרנאטנט דרך עמוד כבידה מלא ב-1 מ"ל של שרף ני-נת"ע. לשטוף את השרף עם לשטוף חיץ A, ולאחר מכן עם חיץ לשטוף B, ואת delute החלבונים עם 10 מ"ל של חיץ elution.
  10. הסר tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ו imidazole מן eluent באמצעות עמודת התפלה (בצע את הוראות היצרן). יש להצדיע לדגימה באמצעות PBS.
  11. רכז את החלבונים עם מסננים צנטריפוגליים (חיתוך של 10 kDa ) ל~ 70 מיקרומטר תוך שמירה על החלבונים ב- PBS (בדרך כלל מניב 2 מ"ל). מדוד את ריכוז החלבון על ידי ספיגה אולטרה סגולה (UV) ב 280 ננומטר (A280) או על ידי מבחן ברדפורד.
  12. הכינו אליציטוטים קטנים, הקפיאו במהירות הבזק בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
    הערה: קומפלקסים מלאים של SNARE יורכבו לאחר הצמדת קומפלקס ΔN על ידית DNA (ראה להלן).

5. חיבור של ידיות DNA

הערה: שתי ידיות dsDNA של 510 bp המכילות קבוצות אמין ראשוניות בקצה אחד מוכנות תחילה על ידי PCR, ולאחר מכן קבוצות האמין מומרות לקבוצות מלימיד באמצעות crosslinker דו-תפקודי, SM(PEG)2. שתי הידיות מקושרות באופן קוולנטי לקומפלקסים של SNARE באמצעות קבוצות הציסטאין שלהן לצורך צימוד ספציפי לאתר (איור 3B).

  1. הכינו פריימרים.
    1. הכינו פריימרים קדמיים: פריימר B (להגברת ידית B) המסומן 5′-ביוטין לחיבור משטח זכוכית ונקשר ל-λ-DNA; פריימר Z (להגברת ידית Z) המסומן 5′-אזיד לחיבור חרוזים מגנטיים ובעל רצף זהה לפריימר B.
    2. הכינו פריימר הפוך: פריימר N (משותף לידית B ולידית Z) המסומן בתווית 5′-אמין להצמדת חלבונים ונקשר ל-λ-DNA במרחק של 510 bp מהפריימר הקדמי.
  2. הגדר והפעל שתי קבוצות של תגובות PCR (18 צינורות של תגובת 200 μL לכל ידית) עם λ-DNA (תבנית), nTaq פולימראז ותנאי PCR סטנדרטיים (ראה טבלה 1). נקו את המוצר עם ערכת ניקוי PCR ועטפו כל ידית ב-45 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. השתמש בנפח מינימלי של מים כדי להשיג ריכוזים גבוהים של ידיות לתגובה יעילה בשלבים מאוחרים יותר.
  3. מדדו את ריכוז הדנ"א ב-A260. התפוקה האופיינית היא ~ 650 μL של ~ 2 מיקרומטר תמיסה עבור כל ידית. יש לשמור דגימות קטנות בנפרד לצורך אימות מאוחר יותר באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  4. הגב כל ידית (1 מיקרומטר ב-PBS) עם 5 mm sm(peg)2. דוגרים בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין. לאחר שעה אחת, השתמש בערכת טיהור DNA כדי להסיר SM(PEG)2 שלא מגיב. הצביעו על כל ידית עם 250 μL של PBS כדי לקבל ~2 מיקרומטר תמיסות.
  5. ערבבו את התמיסות של קומפלקס ידית B ו-ΔN ביחס מולארי של 1:16 (למשל, 1 מיקרומטר ידית B ו-16 מיקרומטר ΔN קומפלקס) ב-PBS ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה. יש להפריד דגימה קטנה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  6. הוסף תמיסה של VAMP2 בעודף טוחנת פי 2.5 מעל קומפלקס ΔN ששימש בשלב הקודם. דוגרים על התערובת עוד שעה בטמפרטורת החדר עם תסיסה. מתחמי SNARE מלאים מורכבים בשלב זה.
  7. הסר חלבונים חופשיים על ידי החלפת חיץ עם PBS טרי ומסנן צנטריפוגלי (חיתוך של 100 kDa ): צנטריפוגה ב 14,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, חזור על לפחות 6x, ולרוץ במשך 15 דקות עבור הסחרור האחרון. מדוד את הגידול ביחס A260/A280 כדי לפקח על הסרת חלבונים חופשיים. יש להפריד דגימה קטנה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  8. הוסף את ידית Z לתמיסה בעודף טוחנת של פי 15 מעל ידית B. שמור על ריכוז ידית Z לפחות מעל 1 מיקרומטר כדי להקל על התגובה. לדגור על התערובת במשך הלילה ב 4 °C עם תסיסה.
  9. אמת את חומרי הביניים (ידית B והצמדות החלבונים שלה) ואת המוצר הסופי (קומפלקס SNARE עם שתי ידיות) באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 3B, inset) (ראה טבלה 2).
    הערה: אם החלבונים מחוברים בהצלחה לידית ב', יזוהה שינוי תנועתי. בפרט, היווצרות קומפלקסים מלאים של SNARE על ידיות דנ"א יכולה להיות מאושרת על ידי עמידותם לנתרן דודציל סולפט (SDS), בניגוד לקומפלקסים של ΔN, שמפורקים ב-SDS ומשאירים רק תחביר קשור לדנ"א (השוו בין b ו-c באיור 3B).
  10. הכינו אליציטוטים קטנים, הקפיאו במהירות הבזק בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
    הערה: למרות שהפתרון הסופי מכיל ידיות לא מגיבות, רק המבנה הרצוי המסומן פעמיים עם ביוטין ואזיד ייבחר במהלך הרכבת הדגימה בתא זרימה.

6. ייצור תאי זרימה

הערה: תאי זרימה למדידות MT בנויים משני כיסויי זכוכית המחוברים זה לזה באמצעות סרט דו-צדדי (איור 3C). כיסוי אחד מצופה בתערובת של PEG ופוליאתילן גליקול ביוטינילציה (PEG) כדי למנוע קשירה לא ספציפית ולאפשר קשירה ספציפית של מולקולות מטרה באמצעות קישור ביוטין-נויטראבידין (איור 3D). לאחר מכן, התמיסות של חומרים עבור ניסויי MT מוחדרות ברצף לתוך תא זרימה באמצעות משאבת מזרק (איור 3C,D).

  1. הכינו שני כיסויי זכוכית, אחד כל אחד למשטח העליון (24 מ"מ × 50 מ"מ, עובי מס' 1.5) והתחתון (24 מ"מ × 60 מ"מ, עובי מס' 1.5). נקו את הכיסויים על ידי סוניקציה ב-1 M KOH למשך 30 דקות. לאחר הסוניקציה, שטפו את הכיסויים במים מזוקקים ושמרו במים עד לשלב הבא.
  2. PEGylate את תלוש הכריכה התחתונה בעקבות פרוטוקולים שפורסמו42,43. השתמש N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine עבור silanization ותערובת 1:100 (ww) של ביוטין-PEG-SVA ו- mPEG-SVA במאגר ביקרבונט 100 mM. שמרו את הכיסויים PEGylated יבשים בטמפרטורה של -20°C ואחסנו אותם למשך מספר שבועות.
  3. ביום הניסויים, הוציאו את כיסויי ה-PEGylated וייבשו אותם באקדח חנקן. בדקו ויזואלית אם יש לכלוך כדי לוודא שהם נקיים.
  4. כדי ליצור את תעלות הדגימה, הכינו רצועות ברוחב ~2 מ"מ של סרט דו-צדדי והניחו ארבע רצועות על משטח כיסוי תחתון (משטח PEGylated למעלה), במקביל ומופרדות זו מזו על ידי ~5 מ"מ (איור 3C).
    הערה: בדרך זו, ניתן ליצור שלושה ערוצי דגימה ברוחב 5 מ"מ בתא זרימה יחיד.
  5. הניחו את החלקת הכיסוי העליונה במרכז הכיסוי התחתון, והותירו ~ 5 מ"מ של מקום בקצוות הקצרים עבור פתחי ערוצים ושקעים. לחץ בעדינות על החלק האחורי של הכיסוי העליון עם פינצטה כדי לאטום היטב את התעלות.
  6. כדי ליצור מאגר כניסה, קצצו את הקצה של קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. חותכים ~ 10 מ"מ מהפתח הרחב יותר כדי לאפשר אחיזה ~ 200 μL של תמיסה. הכינו שלושה מהם לשלושת ערוצי הזרימה. כדי להגדיר את השקעים, הכינו שלוש מחטי מזרק שמתאימות לצינור עבור משאבת המזרק.
  7. באמצעות אפוקסי של 5 דקות, מדביקים את המאגרים ורכזות המחטים לתא הזרימה. ודאו שנוצר איטום מלא למניעת דליפה, ושהתעלות אינן חסומות בדבק עודף. תן לו להתייבש לפחות 30 דקות.

7. הרכבה של מבני קשירת חרוזים

הערה: התמיסות של חומרים לניסויי MT, כולל אלה של מבני קשירת חרוזים, מוחדרות ברצף לתאי זרימה באמצעות משאבת מזרק (איור 3C,D).

  1. הכינו חרוזים מגנטיים. קח 5 מ"ג של חרוזי אפוקסי M270 מתמיסת מלאי (~ 3.3 × 108 חרוזים ב 167.5 מיקרוליטר של דימתילפורממיד) והחלף את הממס בחיץ פוספט (ראה טבלה 2) על ידי הפרדה מגנטית של החרוזים.
  2. הכינו את החרוזים ב~1.1 × 109 חרוזים מ"ל−1 בחיץ פוספט עם 1 M אמוניום סולפט והגיבו אותם עם 2 mM dibenzocyclooctyne (DBCO)-NH2. דוגרים על התערובת במשך 3 שעות על מיקסר מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר התגובה, שטפו את החרוזים 3x עם חיץ פוספט טרי כדי להסיר מולקולות שלא הגיבו.
    הערה: ניתן לאחסן את החרוזים השטופים ללא סיבוב נוסף בטמפרטורה של 4°C למשך מספר שבועות לפני השימוש.
  3. חבר מחט ביציאת תעלת תא הזרימה למשאבת המזרק באמצעות צינורות פוליאתילן. אזנו את הערוצים עם PBS.
  4. הכניסו את הפתרונות הבאים ברצף לתעלה על ידי שאיבה עם המשאבה: נויטראבידין, מבני מטרה (סיכות ראש DNA או קומפלקסים SNARE עם ידיות DNA), חרוזי פוליסטירן ייחוס וחרוזים מגנטיים מצופים DBCO. לפני השימוש, מערבלים היטב את תמיסות החרוזים כדי לפזר אגרגטים פוטנציאליים של חרוזים.
  5. שטפו חרוזים לא קשורים תוך הפעלת 0.1 pN של כוח.
    הערה: הפעלת כוח קטן כלפי מעלה מקלה על הסרת חרוזים לא קשורים ומסייעת למנוע קרע של מבנים קשורים במיוחד של קשירת חרוזים.
  6. עבור ניסויים עם מתחמי SNARE, כלול 1.5 מיקרומטר SNAP-25 במאגר הסופי.
    הערה: מולקולות SNAP-25 החופשיות יכולות לקשור מחדש קומפלקסים של SNARE לאחר הפתיחה ולאפשר מדידות חוזרות ונשנות על קומפלקס יחיד.

8. זיהוי מבני מטרה

  1. על פני השטח של תעלת תאי זרימה, חפשו את החרוזים המגנטיים הקשורים על ידי מולקולות בודדות של מבנה המטרה. ודא שחרוז הפניה נמצא בקרבת מקום.
  2. סובבו חרוז מועמד ובדקו שהוא מסתובב בחופשיות. אם החרוז קשור במספר מולקולות, הוא מפגין תנועה מוגבלת.
  3. סובב את החרוז במשך כמה סיבובים שלמים וגלה את רדיוס הסיבוב (פונקציה זו מיושמת בתוכנה שסופקה). רצוי, לבחור חרוז עם רדיוס סיבוב קטן.
    הערה: רדיוס זה מציין עד כמה החרוז מנותק מציר הקשירה, אשר נקבע באופן אקראי במהלך מכלול קשירת החרוזים30,31. בכל הניסויים, מרכוז מינימלי של חרוז מקל על ממצאים רבים הקשורים ליחס ההארכה הגבוה של רדיוס החרוז לקשירה שבו אנו משתמשים.
  4. הגדל את הכוח מ- 0 ל- 5 pN כדי לזהות חרוזים קשורים יחידים טובים. חפש שינוי גדול בתבנית העקיפה של חרוז כתוצאה מתיחה של קשירה של 1 kbp (או שתי ידיות מקבילות של 510 bp). אם דפוס העקיפה אינו משתנה באופן משמעותי, הנמיכו את הכוח לאפס וסרקו חרוז מועמד אחר.
    הערה: ניתן להבחין בקלות בהרמת ~300 ננומטר של חרוז מהתמונות הגולמיות מבלי להתחיל את תהליך המעקב בפועל.

9. מעקב חרוזים למדידות הרחבה

הערה: מעקב אחר חרוזים מתבצע על ידי ניתוח תמונות חרוזים בזמן אמת בתוכנת LabVIEW המצורפת למאמר זה. שיטת המעקב וגרסאותיה שימשו ברוב מערכות MT הקונבנציונליות ומוסברות בספרות קודמת 2,5,7,26. על ידי מדידת מיקומו של חרוז מגנטי ביחס לחרוז ייחוס קבוע (כלומר, מעקב דיפרנציאלי), מדידות המיקום הופכות חסינות ביותר להפרעה חיצונית.

  1. לאחר איתור חרוז מגנטי תקין יחד עם חרוז ייחוס, לחצו על כפתור הכיול כדי להתחיל להתכונן למעקב אחר חרוזים.
  2. לחץ על החרוזים בתמונה כדי להגדיר את מיקומי החרוזים. לאחר מכן התמונות ייחתכו לאזורי עניין (ROIs) (לדוגמה, 150 x 150 פיקסלים עבור חרוז של 3 מיקרומטר) סביב החרוזים ולאחר מכן ינותחו עוד יותר כדי לחלץ את קואורדינטות החרוזים המדויקות.
  3. המתן להשלמת סיבוב המגנט. תהליך זה מתעד את קואורדינטות x ו- y של החרוז (על ידי חישוב מתאם צולב דו-ממדי44 או באמצעות סימטריה רדיאלית45 של תמונות החרוז, עם ביצועים דומים) תוך סיבוב המגנטים כדי לתעד את החיבור הלא ממורכז של החרוז31.
  4. למעקב בכיוון z, המתן עד שהתוכנה תיצור טבלת חיפוש של תמונות עקיפה של החרוזים במרחקים שונים ממישור המוקד. זה מתבצע על ידי דריכת עדשת האובייקט עם סורק piezo בצעדים שווים ורישום תמונות חרוזים ממוצעים תנודתיות בכל מיקום. לאחר מכן, קואורדינטות z של החרוזים בניסויים אמיתיים נקבעות על ידי השוואת תמונות החרוזים בזמן אמת לטבלת החיפוש עם אינטרפולציה7.
  5. בסיום יצירת טבלת בדיקת המידע, הפעל מעקב ומיקוד אוטומטי (לחץ על Track ? and AF? כפתורים) ולחץ על לרכוש כפתור כדי להתחיל להקליט מיקומי חרוזים.
    הערה: מיקוד אוטומטי הוא אופציונלי אך מומלץ לתקן את סטיית השלב ב - z במהלך הרכישה.

10. כפה תוכניות יישום

  1. ניסויי כבש כוח: כדי לאמת את יחסי הכוח-הארכה של המבנה, הפעילו כבש כוח למעלה ולמטה בקצב העמסה קבוע (± 1.0 pN s−1) (איור 4A). לדוגמה, החל שלושה סבבים של מחזור pN של 0-20-0 כדי לאמת את האורך הכולל של המבנה ואת עקומת הארכת הכוח של נקודות האחיזה.
  2. על ידי ציון פרמטרי הקשירה בתוכנה, שכבו עקומת הארכת כוח WLC על גבי הנתונים הנמדדים, וקבעו אם חרוז המטרה קשור על ידי מבנה דגימה אמיתי עם ידיות DNA מתאימות. השתמש באורך קווי המתאר הידוע (למשל, ~ 340 ננומטר עבור 1 kbp dsDNA) ובאורך התמדה WLC (30-45 ננומטר עבור dsDNA31 קצר) של המבנה כנקודת התחלה. החל את שיטת תיקון ההרחבה המתוארת בשלב 2.11 במידת הצורך.
  3. אם המבנה מאומת, בחן בפירוט את תגובת הארכת הכוח כדי לחפש הרחבה נוספת הנובעת ממולקולות המטרה - סיכות שיער או קומפלקסים של SNARE.
  4. ניסויי כוח קבוע: שנו בהדרגה את הכוח המופעל בצעדים בדידים כדי לבחון את רגישות הכוח של מולקולות המטרה (איור 4B).
    הערה: MTs מאפשרים ניסויים פשוטים ויעילים בכוח קבוע מכיוון שהכוח המופעל נשמר קבוע כאשר המגנטים מוחזקים במקום.
    1. עבור סיכות שיער DNA, יש להפעיל 4-8 pN של כוח עם צעדים של 0.2-0.5 pN, ולמדוד את מיקום החרוז עבור ~ 10 שניות בכל רמת כוח.
    2. עבור מתחמי SNARE, החל 14-16 pN של כוח עם צעדים 0.1-0.2 pN, ולמדוד את מיקום החרוז עבור ~ 10 s בכל רמת כוח.
  5. ניסויי קפיצת כוח: שימו לב לאירועי המעבר של מתחמי SNARE.
    הערה: ניסויים בקפיצת כוח, כמו ניסויים בכוח קבוע, כרוכים בשינויים ברמות הכוח. עם זאת, קפיצות כוח משתמשות בשינויים פתאומיים יותר בכוח המופעל, ומאפשרות ניטור של אירועים המופעלים על ידי כוח במולקולות הנחקרות, כגון קרע פתאומי של קומפלקסים חלבוניים. לדוגמה, מאחר שקומפלקסים של SNARE מפגינים היסטרזה מבנית במחזורכוח 23, זה אינפורמטיבי לבצע ניסויים בקפיצת כוח ולמדוד את ההשהיה למעבר (איור 4C).
    1. פתיחת רוכסן: קילוף מולקולת VAMP2 מקומפלקס SNARE טרינרי שלם, ומותיר קומפלקס בינארי של תחביר-1A ו-SNAP-25.
    2. רוכסן: רוכסן של מולקולת VAMP2 ללא רוכסן כדי ליצור קומפלקס SNARE שלם.
      1. מתגלגל: פירוק מלא של קומפלקס SNARE מלווה בדיסוציאציה מוחלטת של SNAP-25. רק מולקולות VAMP2 ותחביר נשארות במבנה לאחר ההתפתחות.
      2. קיפול מחדש: התחדשות של קומפלקס SNARE עם קשירה של מולקולת SNAP-25 חופשית מהחיץ.
  6. ב 2 pN, לגרום להרכבה של קומפלקס SNARE שלם על ידי המתנה (~ 30 שניות) עבור שיוך של מולקולת SNAP25 חופשית. ירידה פתאומית בהרחבה נצפתה עם היווצרות קומפלקס SNARE.
  7. כדי לצפות באירועי פתיחת רוכסן, המתן מספר שניות ב- 10-12 pN, ולאחר מכן עבור ל- 14-15 pN בפתאומיות עם מהירות המנוע המרבית האפשרית. בהתאם לכוח המטרה, קומפלקס SNARE יציג מעבר הפיך בין מתווכים לא מכווצים חלקית (כמו בניסויי כוח קבוע) או קפיצה ~25 ננומטר למצב גבוה יותר, ללא רוכסן לאחר זמן המתנה אקראי (או השהיה).
  8. כדי לצפות באירועי רוכסן, הנמיכו את הכוח ל 10-12 pN מיד לאחר פתיחת הרוכסן. שוב, קומפלקס SNARE מציג מעבר סטוכסטי למצב התחתון עם הרוכסן לאחר השהיה אקראית כלשהי. אם הפתיחה התרחשה לאחר פתיחת הרוכסן, המתחם לא יצליח לדחוס, מכיוון שמולקולת SNAP-25 תהיה חסרה.
  9. כדי לצפות באירועים מתפתחים, המתן פרק זמן ארוך יותר לאחר פתיחת הרוכסן נצפה כדי לזהות עלייה נוספת בהרחבה (~ 2 ננומטר).

11. ניתוח נתונים

הערה: סוגי הניתוח שניתן לבצע עם נתוני MT תלויים במערכת היעד. אולם ישנן גישות נפוצות לחילוץ מידע שימושי מהניסויים המתאימים המתוארים באיור 4. כל הניתוחים מבוצעים באמצעות MATLAB (R2021a) באמצעות הקודים המותאמים אישית שסופקו במאמר זה. קודים אלה יוצרים מגרשים באמצעות אותם נתונים המוצגים במאמר זה. שים לב שבעוד שנתונים גולמיים ממעקב של 100 הרץ נלקחו ישירות לניתוח, נתונים ממעקב של 1.2 קילוהרץ היו בדרך כלל מסוננים בחציון (עם חלון הזזה של חמש נקודות) לפני הניתוח כדי להפחית את הרעש (למעט ניתוח רעש).

  1. ניסויי כבש כוח: לנתח את יחסי הכוח-הארכה (למשל, גמישות של פולימרים) ולהעביר את הכוח כדי לחלץ מידע על תכונות ננומכניות.
  2. ניסויי כוח קבוע: לנתח אוכלוסיות מצב וזמן שהייה (או קצב מעבר) כפונקציה של כוח כדי לחלץ פרמטרים מבניים (למשל, אזורים המעורבים במעבר), תרמודינמיים (למשל, הפרשי אנרגיה חופשית) וקינטיים (למשל, מחסום אנרגיה) של השינויים הקונפורמטיביים.
  3. ניסויי קפיצת כוח: לנתח קינטיקה של קרע (למשל, אינטראקציות חלבון-חלבון וקישור קולטן-ליגנד) או את משך החיים של מתווכים חולפים (למשל, התפתחות של ביומולקולות) כדי לחלץ את היציבות של מולקולות המטרה ואת מצבן.
  4. כיישומים מייצגים, נתח את נתוני הדגימה עבור סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE:
    1. מעברים דו-מדינתיים של סיכת ראש של DNA: פתיחת כוח, מרחק פתיחה, תלות בכוח של הסטת אוכלוסייה, ומדידות הקצאה וקצב מעבר של מצב עם מודל מרקוב נסתר (HMM) (קודי MATLAB מסופקים).
    2. שינויים קונפורמטיביים של קומפלקסים SNARE: כוח רוכסן, תלות בכוח של מצבי ביניים וחביון פתיחת רוכסן, היסטרזיס ב rezipping, והתנהגות פתיחה/קיפול מחדש.
      הערה: מודלים של הארכת כוח עבור ידיות DNA, סיכות שיער של DNA וקונפורמציות מורכבות של SNARE ניתנים בהפניות קודמות14,31.

תוצאות

כיול כוח
התוצאות משתי שיטות מדידת הכוח (שונות התזוזה הצידית של חרוזים וניתוח ספקטרום הספקטרום) היו שונות ב-0-2 pN (איור 2G). לפי התוצאות באיור 2F, אנו יכולים להגיע באופן אמין עד 30 pN עם מגנטים רגילים של ניאודימיום.

מעברים דו-מדינתיים ש...

Discussion

בעבודה זו הצגנו מערך ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת שיכול לצפות בשינויים מבניים של ביומולקולות בדיוק מרחבי-זמני גבוה. מצלמת ה-CMOS המהירה שבה נעשה שימוש מקבלת 1,200 פריימים s−1 ברזולוציה של 1,280 x 1,024, ומאפשרת מעקב חרוזים של 1.2 קילוהרץ. עם זאת, מהירות המדידות מוגבלת כיום על ידי תוכנת מעק?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 ו-NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. נתמך על ידי מענק NRF (2021R1C1C2009717).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis systemAdvanceMupid-2plus
DNA ladderBioneerD-1037
nTaq polymeraseEnzynomicsP050A
PCR purification kitLaboPassCMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2ThermoFisher Scientific22102For SNARE–DNA coupling
Primer BBioneer5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3'For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hpIDT5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		For hairpin construct
Primer NBioneer5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'For DNA handles
Primer ZBioneer5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3'For DNA handles
Primer Z_5kBioneer5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hpBioneer5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3'For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher ScientificS33102
λ-DNABioneerD-2510Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28ahomemadetggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28ahomemadetggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1homemadeggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28ahomemadetggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-MercaptoethanolSIGMAM3148-25ML
AgarLPS SolutionAGA500
Ampicillin, Sodium saltPLSAC1043-005-00
ChloramphenicolPLSCR1023-050-00
Competent cells (E. coli)Novagen70956Rosetta(DE3)pLysS
GlycerolSIGMAG5516-500ML
HEPESSIGMAH4034-100G
Hydrochloric acid / HClSIGMA320331-500ML
ImidazoleSIGMAI2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTGSIGMA10724815001
Kanamycin SulfatePLSKC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) BrothLPS SolutionLB-05
Ni-NTA resinQiagen30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column)CytivaGE28-9180-07For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSFThermoFisher Scientific36978
Plasmids for SNARE proteinscloned in houseN/AAvailable upon request
Protease inhibitor cocktailgenDEPOTP3100
Sodium chlorideSIGMAS5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4SIGMAS7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4SIGMAS3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEPSIGMAC4706-2G
Trizma baseSIGMAT1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVALAYSAN BIOBIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1gFor PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2SIGMA761540-10MGFor bead coating
Double-sided tape3M136For flow cell assembly
Epoxy glueDEVCONS-208For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surfaceVWR48393-251Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surfaceVWR48393-241Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic beadThermoFisher Scientific14301Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVALAYSAN BIOmPEG-SVA 1gFor PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMFSIGMAD4551-250MLFor bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamineSIGMA104884-100MLFor PEGylation
NeutravidinThermoFisher Scientific31000For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2PLSPR2007-100-00
Plastic syringeNorm-jectA55 ml, luer tip
Polyethylene TubingSCIBB31695-PE/4PE-60
Reference beadSPHEROTECHSVP-30-5Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needleKovax21G-1 1/4''21 G
Syringe pumpKD SCIENTIFIC788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stagePIM-126.PD1For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stageST1LEE400For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnetsDaiKwang Precisioncustum orderDrawing available upon request
Frame grabberActive SiliconAS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS cameraMikrotronEoSens 3CXP
Inverted microscopeOlympusIX73P2F-1-2
Neodymium magnetsLG magnetND 10x10x12tDimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lensOlympusUPLXAPO100XOOil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositionerMad City LabsNano-F100S
Rotation stepper motorAUTONICSA3K-S545WFor rotating magnets
Superluminescent diodeQPHOTONICSQSDM-680-2680 nm
Software
LabVIEWNational Instrumentsv20.0f1
MATLABMathWorksv2021a

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -. K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -. Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -. H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -. Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -. F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -. H., Yoon, T. -. Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -. W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -. K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE195DNASNARE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved