JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים ייצור ואפיון של חומרים ביו-אקטיביים המכילים ננו-דיסקים. ננודיסקים של Amphotericin B נלקחים כדוגמה לתיאור הפרוטוקול בצורה מדורגת.

Abstract

המונח ננו-דיסק מתייחס לסוג בדיד של ננו-חלקיק המורכב מליפיד דו-שכבתי היוצר שומנים, חלבון פיגום וסוכן ביו-אקטיבי משולב. ננו-דיסקים מאורגנים כדו-שכבה ליפידית בצורת דיסק שהיקפו מוקף על ידי חלבון הפיגומים, בדרך כלל חבר במשפחת אפוליפופרוטאין הניתן להחלפה. חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים רבים נמסו ביעילות בננו-דיסקים על ידי שילובם בסביבה ההידרופובית של דו-שכבת השומנים של החלקיק, והניבו אוכלוסייה הומוגנית ברובה של חלקיקים בקוטר של 10-20 ננומטר. הניסוח של ננודיסקים דורש יחס מדויק של רכיבים בודדים, תוספת רציפה מתאימה של כל רכיב, ואחריו סוניקציה של תערובת הפורמולציה. חלבון הפיגום האמפיפתי בא במגע ספונטני ומארגן מחדש את תערובת השומנים/חומרים ביו-אקטיביים המפוזרים ויוצר אותם ליצירת אוכלוסייה בדידה והומוגנית של חלקיקי ננו-דיסק. במהלך תהליך זה, תערובת התגובה עוברת ממראה אטום ועכור לדגימה מזוקקת, שכאשר היא ממוטבת במלואה, אינה מניבה משקעים בצנטריפוגה. מחקרי אפיון כוללים קביעת יעילות מסיסות של חומרים ביו-אקטיביים, מיקרוסקופ אלקטרונים, כרומטוגרפיית סינון ג'ל, ספקטרוסקופיית ספיגה אולטרה סגולה גלויה (UV/Vis) ו/או ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית. זה בדרך כלל ואחריו חקירה של פעילות ביולוגית באמצעות תאים בתרבית או עכברים. במקרה של ננודיסקים המכילים אנטיביוטיקה (כלומר, אנטיביוטיקה פוליאן מקרוליד אמפוטריצין B), ניתן למדוד את יכולתם לעכב צמיחה של שמרים או פטריות כפונקציה של ריכוז או זמן. קלות הניסוח היחסית, הרבגוניות ביחס לחלקי הרכיבים, גודל החלקיקים הננומטריים, היציבות הטבועה והמסיסות המימית מאפשרים יישומים רבים במבחנה ו-in vivo של טכנולוגיית ננו-דיסק . במאמר זה, אנו מתארים מתודולוגיה כללית לניסוח ואפיון ננודיסקים המכילים אמפוטריצין B כסוכן ביו-אקטיבי הידרופובי.

Introduction

ליפופרוטאינים דיסקואידים בצפיפות גבוהה (HDLs) הם אבות טבעיים של HDL כדורי הרבה יותר נפוץ הקיים במערכת הדם האנושית. חלקיקים חדשים אלה, המכונים גם pre-ß HDL, הם בעלי תכונות מבניות ייחודיות וייחודיות1. ואכן, במקום להתקיים כחלקיק כדורי, HDL מתהווה הוא בצורת דיסק. מחקרי אפיון מבניים נרחבים על HDL דיסקואידים טבעיים ומשוחזרים גילו כי הם מורכבים מדו-שכבה פוספוליפידית שהיקפה מוקפת על ידי אפוליפופרוטאין אמפיפתי הניתן להחלפה (apo), כגון apoA-I. במטבוליזם של ליפופרוטאינים אנושיים, HDLs מתהווים במחזור צוברים שומנים מתאים היקפיים ומבשילים ל-HDL כדוריים בתהליך התלוי במתווכי חלבונים מרכזיים, כולל מעביר קלטות קושר ATP A1 ולציטין:כולסטרול אצילטרנספראז2. תהליך זה מהווה מרכיב קריטי במסלול העברת כולסטרול הפוך שנחשב כמגן מפני מחלות לב. חמושים בידע זה וביכולת לשחזר HDL דיסקואידלי, חוקרים השתמשו בחלקיקים אלה כהתערבות טיפולית לטיפול בטרשת עורקים3. בעיקרו של דבר, עירוי של HDL משוחזר (rHDL) לחולים מקדם את שטף הכולסטרול ממשקעי פלאק ומחזיר אותו לכבד לצורך המרה לחומצות מרה והפרשת מהגוף. מספר חברות ביוטכנולוגיה / תרופות נוקטות באסטרטגיית טיפול זו4.

במקביל, היכולת לייצר חלקיקים אלה במעבדה עוררה גל של פעילויות מחקר שהובילו ליישומים חדשים וטכנולוגיות חדשות. יישום בולט אחד כולל שימוש בחלקיקי rHDL כקרום מיניאטורי כדי לאכלס חלבונים טרנסממברנליים בסביבה דמוית ילידים5. עד כה, מאות חלבונים שולבו בהצלחה ב-rHDL דיסקואידלי, ומחקרים הוכיחו כי חלבונים אלה שומרים הן על קונפורמציה טבעית והן על פעילות ביולוגית כקולטנים, אנזימים, טרנספורטרים וכו'. חלקיקים אלה, המכונים "ננודיסקים", הוכחו גם כמתאימים לאפיון מבני, לעתים קרובות ברזולוציה גבוהה6. גישה זו לחקירות של חלבונים טרנסממברנליים מוכרת כעדיפה על מחקרים עם מיצלות דטרגנטים או ליפוזומים, וכתוצאה מכך, היא מתקדמת במהירות. חשוב להכיר בכך שדווחו שתי שיטות שונות המסוגלות ליצור rHDL. שיטת "דיאליזה כולאט"13 פופולרית ליישומים הקשורים לשילוב חלבונים טרנסממברנליים בשכבה הדו-שכבתיתrHDL 5. בעיקרו של דבר, שיטת ניסוח זו כוללת ערבוב של פוספוליפיד דו-שכבתי היוצר פוספוליפיד, חלבון פיגום והחלבון הטרנסממברנה המעניין במאגר המכיל את חומר הניקוי נתרן כולאט (או נתרן דאוקסיכולאט; משקל מולקולרי של מיצלה [MW] של 4,200 Da). חומר הניקוי מסיס ביעילות את מרכיבי התגובה השונים, ומאפשר לדגימה להיות מחוייגת כנגד חיץ חסר חומר ניקוי. במהלך שלב הדיאליזה, כאשר חומר הניקוי מוסר מהדגימה, נוצר rHDL באופן ספונטני. כאשר משתמשים בגישה זו כדי ללכוד חלבון טרנסממברנה מעניין, חלקיקי המוצר כונו ננודיסקים5. ניסיונות להשתמש בשיטה זו כדי לשלב חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים של מולקולות קטנות (MW <1,000 Da), עם זאת, לא צלחו ברובם. שלא כמו חלבונים טרנסממברנליים, חומרים ביו-אקטיביים של מולקולות קטנות מסוגלים לברוח משקית הדיאליזה יחד עם חומר הניקוי, מה שמקטין מאוד את יעילות השילוב שלהם ב-rHDLs. בעיה זו נפתרה על ידי השמטת חומרי ניקוי מתערובת הפורמולציה14. במקום זאת, הרכיבים מתווספים למאגר מימי ברצף, החל מהשכבה הדו-שכבתית היוצרת שומנים, ויוצרים סוכן ביו-אקטיבי יציב המכיל rHDL, המכונה ננודיסק. אחרים השתמשו ב-rHDL לשילוב והובלה של חומרי הדמיה in vivo 7. לאחרונה, rHDL מיוחד המורכב מפיגום אפוליפופרוטאין והגליצרופוספוליפיד האניוני, קרדיוליפין, שימשו במחקרי קשירת ליגנדים. חלקיקים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים על האינטראקציה של cardiolipin עם ליגנדות מסיסים במים שונים, כולל סידן, cytochrome c, ואת סוכן אנטי סרטני doxorubicin8.

המחקר הנוכחי מתמקד בניסוח rHDL בעל חומר ביו-אקטיבי הידרופובי משולב יציב (כלומר ננודיסק). היכולת של חומרים אלה להשתלב בסביבה השומנית של חלקיקי rHDL דיסקואידים מעניקה להם ביעילות מסיסות מימית. ככאלה, לננודיסקים יש פוטנציאל ליישומים טיפוליים in vivo . בעת גיבוש ננו-דיסקים, נדרשים תנאי דגירה/תגובה ספציפיים כדי לשלב בהצלחה חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים בדידים בחלקיק המוצר, ומטרת דוח זה היא לספק מידע מעשי מפורט שיכול לשמש כתבנית בסיסית ליצירת חלקיקי ננו-דיסק חדשניים עבור יישומים ספציפיים. לפיכך, בהקשר של כתב יד זה המונחים ננודיסק וננודיסק אינם ניתנים להחלפה. בעוד שננודיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח להכיל חלבון טרנסממברנה המוטבעבשכבה הדו-שכבתית 5 של השומנים, המונח ננו-דיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח לשלב משקל מולקולרי נמוך (< 1,000 Da) חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים, כגון אמפוטריצין B14.

קיימות מגוון שיטות לרכישת חלבוני פיגומים מתאימים. ניתן לרכוש חלבוני פיגומים מיצרנים [למשל apoA-I (SRP4693) או apoE4 (A3234)], אולם העלות עשויה להיות גורם מגביל. גישה מועדפת היא לבטא חלבוני פיגום רקומביננטיים ב- Escherichia coli. פרוטוקולים מתפרסמים עבור apoA-I9, apoE410 אנושי, כמו גם חלבון המולימפה אפוליפופורין-III11. לצורך הניסויים המתוארים כאן, נעשה שימוש בדומיין רקומביננטי אנושי מסוג apoE4 N-terminal (NT) (חומצות אמינו 1-183). רצף הנוקלאוטידים המקודד apoE4-NT האנושי סונתז והוכנס לווקטור ביטוי pET-22b (+) הסמוך ישירות לרצף מובילי pelB המקודד על ידי וקטור. מבנה זה מוביל לביטוי של חלבון היתוך מוביל pelB - apoE4-NT. לאחר סינתזת חלבונים, רצף מובילי pelB חיידקי מכוון את החלבון החדש המסונתז לחלל הפריפלסמי שבו פפטידאז מוביל חותך את רצף pelB. חלבון apoE4-NT המתקבל, ללא תגי רצף או זנבות, בורח לאחר מכן מהחיידקים ומצטבר בתווך התרבית11,12, מה שמפשט את העיבוד במורד הזרם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. טרנספורמציה, ביטוי וטיהור של רכיב חלבון פיגום

  1. טרנספורמציה חיידקית BL21 עם apoE4-NT המכיל פלסמיד
    1. הפשירו צינור של תאים מוכשרים BL21 (DE3) על קרח למשך 10 דקות.
    2. לאחר שכל הקרח נמס, ערבבו בעדינות ובזהירות פיפטה 50 μL של התאים לתוך צינור טרנספורמציה על קרח.
    3. הוסף 5 μL המכיל 50 ng של DNA פלסמיד (עבור רצף, ראה טבלה משלימה 1) לתערובת התא. בזהירות להעיף את הצינור ארבע או חמש פעמים כדי לערבב. אין לערבל.
    4. מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות.
    5. מחממים את התערובת בדיוק ב-42°C למשך 10 שניות.
    6. מניחים על קרח למשך 5 דקות.
    7. פיפטה 950 μL של S.O.C. בינוני לתוך הצינור בטמפרטורת החדר.
    8. מניחים את הצינור באינקובטור רעד של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות עם תנודה מוגדרת ל-250 סל"ד.
    9. ערבבו היטב את התאים על ידי הבהוב והפוך, ולאחר מכן פזרו 100 מיקרוליטר של תמיסת תאים על צלחת בחירה של 20 מ"ל Luria Broth + Agar שטופלה באמפיצילין בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל.
    10. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F), או עד מושבות גלויות גדלו.
  2. באמצעות פיפטור אלקטרוני, להעביר 25 מ"ל של תווך סטרילי, NZCYM לתוך בקבוק חרוטי סטרילי 250 מ"ל בטמפרטורת החדר ולהוסיף ampicillin לריכוז עבודה סופי של 0.1 מ"ג / מ"ל.
  3. באמצעות לולאת חיסון סטרילית, מעבירים מושבה בודדת אחת מצלחת הבחירה המכילה את זן החיידקים שעבר טרנספורמציה מתאימה ומוסיפים ישירות לבקבוק המכיל 25 מ"ל של מדיה NZCYM + אמפיצילין.
  4. הניחו את בקבוק תרבית זרעי NZCYM בנפח 25 מ"ל לתוך אינקובטור מטלטל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תנודה מסלולית המוגדרת ל-250 סל"ד.
    הערה: מומלץ לגדל תרבית זרעים זו במשך הלילה כדי להגיע לריכוז חיידקים מתאים (~ 1.5-2.0 יחידות צפיפות אופטית), כפי שנמדד באמצעות ספקטרופוטומטר המוגדר לאורך גל = 600 ננומטר.
  5. מעבירים 250 מ"ל של מדיום NZCYM סטרילי לארבע צלוחיות 1 ליטר מבולבלות ומוסיפים אנטיביוטיקה אמפיצילין לריכוז עבודה של 0.1 מ"ג/מ"ל.
  6. בתנאים סטריליים, העבירו 5 מ"ל של תרבית זרעים רוויים לכל אחת מארבע תרביות 250 מ"ל המכילות צלוחיות והניחו באינקובטור רעד של 37 מעלות צלזיוס עם תנודה מסלולית המוגדרת ל -250 סל"ד.
    הערה: בשלב זה, התרבות תיקרא תרבות התפשטות וצמיחה אקספוננציאלית תנוטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV1800. הצמיחה מותרת להמשיך עד שהצפיפות האופטית של התרבית ב 600 ננומטר (OD600) מגיעה לערך בין 0.6-0.8.
  7. לאחר שתרבית ההרחבה הגיעה לערך OD600 הרצוי של 0.6-0.8, הוסף 59.6 מ"ג איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לכל תרבית של 250 מ"ל המכילה בקבוק לריכוז סופי של 1 mM כדי לגרום לביטוי חלבון. בנקודה זו, תרבות ההתפשטות מכונה תרבות הביטוי. התחל ביטוי לתקופה של 5 שעות.
  8. בתום תקופת הביטוי של 5 שעות, מוציאים את ארבע הצלוחיות מאינקובטור הרעידה והפיפטה 125 מ"ל לשישה בקבוקי צנטריפוגות של 250 מ"ל (סה"כ 750 מ"ל).
  9. אזנו כל בקבוק צנטריפוגה כדי להבטיח שהמסה הכוללת תהיה בטווח של 0.5 מ"ג ± אחד מהשני.
    הערה: שלב זה חיוני כדי להבטיח הפעלה בטוחה של התקן הצנטריפוגה.
  10. הכן את התקן הצנטריפוגה על-ידי היפוך מתג ההפעלה למצב מופעל. לחץ על הלחצן שכותרתו "הגדר / בפועל" והתאם את הפרמטרים ל- "JA-14", "9,400 x g", 20.00 דקות ו- 4 ° C באמצעות החוגות המתאימות.
  11. יש להעמיס את ששת בקבוקי הצנטריפוגות המאוזנות לתוך רוטור צנטריפוגות בגודל מתאים ולהכניס לצנטריפוגה תוך הקפדה על פרמטרים בטיחותיים ספציפיים.
    הערה: המשיכו בשלב זה עד שכל תרביות תאי החיידקים יצוננו וייאספו סופרנאטנטים.
  12. סנן את הסופרנאטנט החיידקי המבודד באמצעות סינון ואקום או מכשיר שווה ערך המצויד במסנן 0.45 מיקרון כדי להסיר שאריות פסולת.
  13. טיהור הפרין של חלבון הפיגום הרקומביננטי apoE4-NT
    הערה: הליך טיהור העמודות מתבצע בטמפרטורת החדר.
    1. אזן את עמודת הפרין בהשמנה גבוהה על-ידי החלת 10 נפחי עמודות (50 מ"ל) של מאגר נתרן פוספט של 10 mM, pH 7.2, ופליטה בקצב של 5 מ"ל/דקה.
    2. החל מדיום מועשר apoE4-NT על העמודה בקצב של 2.5 מ"ל/דקה עד להחלת כל נפח התווך של 1 ליטר ומחק את הזרימה.
    3. שטוף את העמודה עם 10 נפחי עמודות (50 מ"ל) של מאגר נתרן פוספט של 10 mM, pH 7.2, ומחק את הזרימה.
    4. הצביעו על חלבון apoE4-NT הרצוי על ידי החלת שלושה נפחי עמודות (15 מ"ל) של חיץ אלוציה (10 mM נתרן פוספט חוצץ + 1.5 M NaCl, pH 7.2) על העמודה ואספו את הפולט.
  14. דיאליזה של apoE4-NT eluate
    1. הכינו קטע של צינורות דיאליזה (מידות צינורות הדיאליזה בהן נעשה שימוש היו 22 ס"מ אורך, 12 מ"מ קוטר פנימי ו-10,000 MWCO) על ידי השריה יסודית במים מזוקקים (DDI) למשך 10 דקות.
    2. הכן 1 ליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) (10 מ"מ נתרן פוספט + 150 מ"מ NaCl, pH 7.2) בכוס פלסטיק 1 ליטר או שווה ערך.
    3. באמצעות מהדק צינורות דיאליזה, הדקו קצה אחד של צינור הדיאליזה הספוג, וודאו שהמהדק מאובטח ושום נוזל לא יכול לברוח.
    4. הכנס משפך צוואר צר לקצה הפתוח של צינורות הדיאליזה ושפך את 15 מ"ל של apoE4-NT eluate לתוך צינורות הדיאליזה.
      הערה: חובה לבדוק אם יש נזילות בשלב זה.
    5. הסר את המשפך ומהדק את קצה צינור הדיאליזה עם מהדק צינור דיאליזה נוסף.
    6. מניחים דיאליזה מוקצף על אחד הקצוות האטומים של צינורות הדיאליזה ומניחים את צינור הדיאליזה המורכב לתוך הכד המכיל 1 ליטר של חיץ PBS.
    7. הניחו מוט ערבוב מגנטי בתחתית הכד והתאימו את בקרת הערבוב ל"נמוכה", כדי להבטיח שלא תיווצר מערבולת.
    8. לאחר סיום הדיאליזה, decant את retentate לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
      הערה: מומלץ לבצע דיאליזה זו בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.

2. ניסוח חומר ביו-אקטיבי המכיל ננו-דיסקים

  1. הכנת aliquot פוספוליפידים
    1. יש לשקול 5 מ"ג של פוספוליפיד מתאים (למשל, דימיריסטואילפוספטידילכולין [DMPC]) ולהעביר למבחנה מזכוכית.
    2. להמיס את 5 מ"ג של פוספוליפידים על ידי הוספת 300 μL שלCHCl 3 ו 100 μL של CH 3 OH עבור יחס כולל של3: 1 v/v.
    3. אידוי הממס האורגני על ידי הנחת מבחנה זכוכית תחת זרם עדין של גז N2 למשך 10-15 דקות, כך שנוצר סרט דק של פוספוליפידים מיובשים לאורך דפנות החלק התחתון של הצינור.
  2. ליופיליזציה של אליציטוטים פוספוליפידים
    1. הכן aliquots פוספוליפידים עבור lyophilization על ידי כיסוי פתח מבחנה זכוכית עם parafilm.
    2. לנקב את parafilm באמצעות מחט 24 G בערך 10-15 פעמים.
    3. הכניסו את האליציטוטים המחוררים למיכל ליופיליזציה מתאים וודאו שמכסה הגומי אטום כראוי.
    4. חבר את מיכל הליופיליזציה לסעפת הוואקום הממוקמת בחלק העליון של מכונת הליופיליזציה וודא שכל שאר השסתומים סגורים היטב.
    5. הפעל את מכונת הליופיליזציה על ידי היפוך מתג ההפעלה ולחיצה על לחצן אתחול הוואקום.
    6. לאחר שהמערכת הגיעה לריק מוחלט, לחץ על לחצן אתחול הקירור כדי להתחיל בתהליך הייבוש בהקפאה.
      הערה: מומלץ לאפשר לדגימות לעבור ליופיליזציה למשך הלילה.
  3. ניסוח ננו-דיסקים של אמפוטריצין-B (amp-B)
    1. פיפטה 0.45 מ"ל של PBS כדי aliquot phospholipid lyophilized ומערבולת עבור ~ 30 s כדי לפזר את השומנים.
      הערה: הדגימה המתקבלת תיראה אטומה ועכורה.
    2. פיפטה 50 μL של תמיסת ampB מלאי 20 מ"ג/מ"ל (20 מ"ג ampB מומס ב-1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד [DMSO], מאוחסן ב-20°C בכלי ענבר סגור) לתוך דגימת הפוספוליפידים המפוזרת והמערבולת.
      הערה: בעת בחירת ממס לשימוש בהכנת תמיסת מלאי של החומר הביו-אקטיבי ההידרופובי, שני שיקולי העל הם: 1) מסיסות החומר הביו-אקטיבי ו-2) ערבוב הממס עם החיץ המימי המשמש בניסוח. בעוד DMSO משמש לעתים קרובות 15,16,17,18,19, dimethylformamide 20,21 או tetrahydrofuran 22 שימשו בהצלחהגם 23.
    3. פיפטה 0.5 מ"ל של חלבון פיגום apoE4-NT (ריכוז של ~4 מ"ג / מ"ל) למבחנה זכוכית המכילה את הפוספוליפידים המפוזרים ו- ampB. הנפח הסופי של המדגם צריך להיות כ 1 מ"ל.
    4. יש להסוניק את הדגימה בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס עד להתבהרות התמיסה (בדרך כלל 10-15 דקות).
  4. צנטריפוגת ננו-דיסק
    1. העבר את תמיסת ampB-nanodisk המזוקקת לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי בנפח 1.7 מ"ל.
    2. הכניסו את הצינור לרוטור מיקרו-צנטריפוגה שולחני בתוספת צינור איזון הממוקם ממש ממול.
    3. הדקו את מכסה הרוטור וסגרו את מכסה הצנטריפוגה.
    4. תכנת את הצנטריפוגה להסתובב במשך 10 דקות ב~ 11,000 x g באמצעות החוגות המתאימות הממוקמות בחזית יחידת המיקרו-צנטריפוגה.
      הערה: בשלב זה, גלולה עשויה להיות גלויה. גלולה זו מורכבת מפוספוליפידים ו/או ampB לא מאוגדים.
    5. מוציאים את הסופרנאטנט ומעבירים אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי אחר בנפח 1.7 מ"ל.
  5. דיאליזה של דגימת ampB-nanodisk
    1. הכינו קטע של צינורות דיאליזה (מידות צינורות הדיאליזה בהן נעשה שימוש היו 3 ס"מ אורך, 16 מ"מ קוטר פנימי ו-10,000 MWCO) על ידי השריה יסודית במי DDI למשך 10 דקות.
    2. הכינו תמיסת חיץ 1 ליטר PBS (10 מ"מ נתרן פוספט + 150 מ"מ NaCl, pH 7.2) בכוס פלסטיק 1 ליטר או שווה ערך.
    3. באמצעות מהדק צינורות דיאליזה, הדקו קצה אחד של צינור הדיאליזה הספוג, וודאו שהמהדק מאובטח ושום נוזל לא יכול לברוח.
    4. הכנס משפך צוואר צר לקצה הפתוח של צינור הדיאליזה והעבר את דגימת ampB-nanodisk לתוך צינורות הדיאליזה.
    5. הסר את המשפך ומהדק את קצה צינור הדיאליזה עם מהדק צינור דיאליזה נוסף.
    6. מניחים דיאליזה מוקצף על אחד הקצוות האטומים של צינורות הדיאליזה ומניחים את צינור הדיאליזה המורכב לתוך הכד המכיל את 1 L של חיץ PBS.
    7. הניחו מוט ערבוב מגנטי בתחתית הכד והתאימו את בקרת הערבוב ל"נמוכה", כדי להבטיח שלא תיווצר מערבולת. אפשר דיאליזה להמשיך לילה ב 4 °C (75 °F).

3. אנליזה ספקטרלית של דגימות ampB-nanodisk

  1. אתחול ספקטרופוטומטר ואחריו ריק אוטומטי
    1. הפעל את הספקטרופוטומטר על-ידי היפוך מתג ההפעלה והתחבר למחשב תמיכה מתאים על-ידי לחיצה על הלחצן שכותרתו "PC Control".
    2. במחשב התמיכה, פתח את התוכנה שכותרתה "UVProbe 2.61" והתחבר לספקטרופוטומטר על ידי לחיצה על הלחצן שכותרתו "התחבר" בפינה השמאלית התחתונה.
    3. לחץ על הלחצן שכותרתו Spectrum בסרגל הכלים העליון בתוך תוכנת UVProbe.
    4. לחץ על הלחצן שכותרתו שיטה בסרגל הכלים העליון.
    5. לחץ על הכרטיסייה מדידה והזן "500" בתיבת הטקסט התחל הממוקמת תחת "טווח אורך גל (nm)" ו- "300" בתיבת הטקסט "סיום".
    6. לחץ על התפריט הנפתח לצד הכרטיסיה שכותרתה מהירות סריקה והגדר אותה לבינונית.
    7. הכן דגימה ריקה על ידי העברת 1 מ"ל של DMSO לתוך שתי קוביות קוורץ (QS 1.000).
    8. טען את שתי הקוביטות ליציאות הדגימה המתאימות של הספקטרופוטומטר, לחץ על Autoblank והקלט ספקטרום בין 300-500 ננומטר על-ידי לחיצה על התחל בפינה הימנית התחתונה.
  2. הכנה וניתוח ספקטרלי של תקן ampB
    1. הכינו תקן אמפB של 20 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הסרת הקובט מיציאת הדגימה הקדמית והוספת 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אמפB של 1 מ"ג/מ"ל (20 מיקרוגרם של אמפר B בסך הכל).
    2. טען את הקובט בחזרה ליציאת הדגימה של הספקטרופוטומטר ולחץ על התחל כדי להקליט את ספיגת הדגימה.
    3. הסר את הקובט מפתח הדגימה ורוקן את תכולת הנוזל למיכל פסולת המסומן כראוי.
    4. שטפו היטב את הקובטה בשלוש שטיפות של מים נטולי יונים, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם אתנול 70%.
  3. הכנה וניתוח ספקטרלי של דגימת ampB-nanodisk משובשת
    1. הכן דגימת ampB-nanodisk משובשת (המכילה 20 מיקרוגרם/מ"ל כ-ampB) על-ידי פיפטציה של 20 μL של מלאי ampB-nanodisk של 1 מ"ג/מ"ל לתוך 1 מ"ל של DMSO. יש לדגור לפחות דקה אחת לפני הקלטת הספקטרום.
    2. טען את הקובט ליציאת הדגימה הקדמית של הספקטרופוטומטר ולחץ על התחל כדי להקליט את ספיגת הדגימה.
  4. הכנה וניתוח ספקטרלי של מאגר PBS ריק
    1. הכן מאגר PBS ריק על-ידי העברת 1 מ"ל של מאגר PBS לשתי קוביות קוורץ (QS 1.000).
    2. טען את הקוביטות ליציאות הדגימה המתאימות של הספקטרופוטומטר, לחץ על Autoblank והקלט את הספקטרום בין 300-500 ננומטר.
  5. הכנה וניתוח ספקטרלי של דגימת ampB-nanodisk ללא הפרעה
    1. הכן דגימת ampB-nanodisk ללא הפרעות (המכילה 20 מיקרוגרם/מ"ל כ-ampB) על-ידי הסרת הקובט מיציאת הדגימה הקדמית והכנסת 20 μL של דגימת 1 מ"ג/מ"ל ampB-nanodisk למאגר PBS.
    2. טען את הקובט בחזרה ליציאת הדגימה של הספקטרופוטומטר, לחץ על התחל והקלט את ספקטרום הדגימה.
      הערה: יש להשליך את כל הפסולת הכימית למכל פסולת המסומן כראוי בהתאם להנחיות המקובלות.

4. ניתוח בדיקת כדאיות שמרים

הערה: בדיקות כדאיות שמרים בוצעו על מנת להעריך את הפעילות הביולוגית של ampB ולקבוע אם תהליך הניסוח או השילוב בננו-דיסקים, השפיע על פעילות עיכוב צמיחת השמרים שלו.

  1. ניסוח שתי דגימות ampB-nanodisk (נפח סופי = 1 מ"ל) שיכילו 1 מ"ג ampB לכל 5 מ"ג DMPC ו- 0.1 מ"ג ampB לכל 5 מ"ג DMPC בהתאם לשיטה שתוארה קודם לכן (2.3-2.4.1).
    הערה: כדי ליצור 1 מ"ג/מ"ל ו-0.1 מ"ג/מ"ל אמפר לכל 5 מ"ג DMPC, פיפטה 50 μL ו-5 μL, בהתאמה, של 20 מ"ג/מ"ל אמפר במלאי DMSO לכל בקבוקון דגימה.
  2. הכנת תרבית שמרים רוויה
    1. מעבירים 25 מ"ל של תמצית שמרים סטרילית-פפטון-דקסטרוז (YPD) בינונית לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
    2. השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי להעביר מושבה בודדת של Saccharomyces cerevisiae (BY4741) לתוך 25 מ"ל של תווך YPD.
    3. תרבית את השמרים באינקובטור רועד שנקבע על 30 מעלות צלזיוס, עם תנודה מוגדרת ל -200 סל"ד למשך 18 שעות.
  3. הכנת דגימות בדיקת עיכוב גדילה בודדות
    1. מעבירים 5 מ"ל של מדיום YPD סטרילי ל-30 צינורות תרבית סטריליים של 13 מ"ל.
    2. טפל בשלוש קבוצות של צינורות תרבית על ידי הוספת 20, 10 ו- 5 μL של דגימת 1 מ"ג/מ"ל ampB-nanodisk, המייצגים 20, 10 ו- 5 מיקרוגרם של ampB, בהתאמה.
    3. טפל בשלוש קבוצות של צינורות תרבית על ידי הוספת 20, 10 ו- 5 μl של דגימת 0.1 מ"ג/מ"ל ampB-nanodisk, המייצגים 2, 1 ו- 0.5 מיקרוגרם של ampB, בהתאמה.
    4. טפל בארבע קבוצות של צינורות תרבית על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של PBS, DMSO, בקרת rHDL (ללא ampB), או 20 מיקרוגרם של ampB ב- DMSO.
      הערה: כל קבוצה של צינורות תרבית מייצגת העתק עצמאי. לכן, ביצוע שיטה זו מביא לערך n כולל של n = 3.
  4. אתחול בדיקת כדאיות שמרים
    1. התחל את הניסוי על ידי חיסון כל דגימה עם 100 μL (2% vol/vol) של תרבית שמרים רוויים
    2. תרבית את השמרים באמצעות אינקובטור רועד המוגדר ל -30 מעלות צלזיוס, עם תנודה מוגדרת ל -200 סל"ד למשך מקסימום של 18 שעות.
  5. מדידות כדאיות שמרים
    1. הפעל את הספקטרופוטומטר על-ידי היפוך מתג ההפעלה, ולאחר מכן לחץ על הלחצן שכותרתו Go To WL והגדר את הערך ל- 600 nm.
    2. העבר 1 מ"ל של מדיום YPD סטרילי לשתי קוביות פלסטיק, טען ליציאות הדגימה המתאימות בספקטרופוטומטר ולחץ על Autoblank.
    3. מעבירים 1 מ"ל מכל דגימה לקובט פלסטיק, מקפידים להחליף קובטות בכל פעם ולטעון את הקובטה ליציאת הדגימה הקדמית של הספקטרופוטומטר.
    4. מדוד ורשום את הצפיפות האופטית של כל דגימה ב- 600 ננומטר והשלך מכל קובטה שהוצאה למיכל פסולת מסומן כראוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תהליך ניסוח ננודיסק סוכן ביו-אקטיבי
בהליך ניסוח ampB-nanodisk המתואר, התגובה נחשבת לשלמה כאשר מראה הדגימה משתנה מעכירות לצלולה (איור 1). שינוי זה מצביע על כך שננו-דיסקים נוצרו וכי הסוכן הביו-אקטיבי היה מסיס. לעתים קרובות, חומרים ביו-אקטיביים בולעים אור באזור אורך הגל הנ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ניסוח של חומר ביו-אקטיבי המכיל ננו-דיסקים מספק שיטה נוחה להמיס תרכובות הידרופוביות בלתי מסיסות אחרת. מאחר שהננו-דיסקים של הסוכן הביו-אקטיבי של המוצר מסיסים לחלוטין במדיה מימית, הם מספקים שיטת העברה שימושית למגוון רחב של מולקולות הידרופוביות (טבלה 1). אלה כוללים מולקולות קטנות, תרו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (R37 HL-64159).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BCayman Chemical Company11636ND Formulation & Standard Preparation
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & Expansion
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformation
Baffled FlaskNew Brunswick ScientificN/AExpansion & Expression
BL21 competent E coliNew England BiolabsC2527ITransformation
Centrifuge bottlesNalgene3140-0250Expression
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Formulation
DMSOSigma Aldrich472301Standard Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND Formulation
Erlenmeyer flaskBellco BiotechnologyN/AExpansion & Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubesVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (Software)DotmaticsN/AYeast Viability Assay
Heated Sonication BathVWRN/AND Formulaton
Heating and Nitrogen moduleThermo ScientificTS-18822ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LyophilizerLabconco7755030ND Formulation
MethanolFisher ScientificA452-4ND Formulation
Nitrogen gasPraxairUN1066ND Formulation
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Expansion & Expression
Pet-22B vectorGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation & Expansion
Quartz CuvettesFisher Brand14385 928ASpectral Analysis
Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
Sodium ChlorideFisher ScientificS271Purification
Sodium Phosphate dibasicFisher ScientificS374-500Purification
Sodium Phosphate monobasicFisher ScientificBP329-500Purification
Spectra/POR Weighted ClosuresSpectrum Medical Industries132736Purification
SpectrophotometerShimadzu UV-1800220-92961-01spectral analysis
Tabletop CentrifugeBeckman Coulter366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression & Purification
Vacuum pumpGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & Purification
VortexFisher Scientific12-812ND Formulation
YeastN/ABY4741Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-DextroseBD242820Yeast Viability Assay

References

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119(2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704(2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195(2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454(2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022(2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777(2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065(2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28(2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66(2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722(2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617(2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE193B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved