Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

Riepilogo

Qui, descriviamo la produzione e la caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodisk. I nanodischi di amfotericina B sono presi come esempio per descrivere il protocollo in modo graduale.

Abstract

Il termine nanodisco si riferisce a un tipo discreto di nanoparticella composto da un lipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e un agente bioattivo integrato. I nanodischi sono organizzati come un doppio strato lipidico a forma di disco il cui perimetro è circoscritto dalla proteina dell'impalcatura, di solito un membro della famiglia delle apolipoproteine scambiabili. Numerosi agenti bioattivi idrofobici sono stati solubilizzati in modo efficiente in nanodischi mediante la loro integrazione nell'ambiente idrofobico del doppio strato lipidico della particella, producendo una popolazione ampiamente omogenea di particelle nell'intervallo di 10-20 nm di diametro. La formulazione di nanodischi richiede un rapporto preciso dei singoli componenti, un'aggiunta sequenziale appropriata di ciascun componente, seguita dalla sonicazione a bagno della miscela di formulazione. La proteina dello scaffold anfipatico contatta spontaneamente e riorganizza il doppio strato disperso formando una miscela di agenti lipidici / bioattivi per formare una popolazione discreta e omogenea di particelle di nanodischi. Durante questo processo, la miscela di reazione passa da un aspetto opaco e torbido a un campione chiarificato che, quando completamente ottimizzato, non produce precipitato dopo la centrifugazione. Gli studi di caratterizzazione riguardano la determinazione dell'efficienza di solubilizzazione dell'agente bioattivo, la microscopia elettronica, la cromatografia a filtrazione su gel, la spettroscopia di assorbanza ultravioletta visibile (UV/Vis) e/o la spettroscopia di fluorescenza. Questo è normalmente seguito da un'indagine sull'attività biologica utilizzando cellule o topi in coltura. Nel caso di nanodischi che ospitano un antibiotico (cioè l'antibiotico macrolide poliene amfotericina B), è possibile misurare la loro capacità di inibire la crescita di lieviti o funghi in funzione della concentrazione o del tempo. La relativa facilità di formulazione, la versatilità rispetto ai componenti, la dimensione delle particelle su scala nanometrica, la stabilità intrinseca e la solubilità acquosa consentono una miriade di applicazioni in vitro e in vivo della tecnologia dei nanodischi. Nel presente articolo, descriviamo una metodologia generale per formulare e caratterizzare i nanodischi contenenti amfotericina B come agente bioattivo idrofobo.

Introduzione

Le lipoproteine discoidali nascenti ad alta densità (HDL) sono progenitori naturali delle HDL sferiche molto più abbondanti presenti nel sistema circolatorio umano. Queste particelle nascenti, note anche come pre-ß HDL, possiedono proprietà strutturali uniche e distintive¹. Infatti, piuttosto che esistere come particella sferoidale, le HDL nascenti sono a forma di disco. Studi approfonditi di caratterizzazione strutturale su HDL discoidali naturali e ricostituite hanno rivelato che sono costituiti da un doppio strato fosfolipidico il cui perimetro è circoscritto da un'apolipoproteina anfipatica scambiabile (apo), come l'apoA-I. Nel metabolismo delle lipoproteine umane, le HDL nascenti circolanti accumulano lipidi dalle cellule periferiche e maturano in HDL sferiche in un processo che dipende da mediatori proteici chiave, tra cui il trasportatore di cassette leganti ATP A1 e lecitina: colesterolo aciltransfere². Questo processo rappresenta una componente critica della via di trasporto inversa del colesterolo che è considerata protettiva contro le malattie cardiache. Armati di questa conoscenza e della capacità di ricostituire HDL discoidali, i ricercatori hanno impiegato queste particelle come intervento terapeutico per trattare l'aterosclerosi³. In sostanza, l'infusione di HDL ricostituito (rHDL) nei pazienti promuove l'efflusso di colesterolo dai depositi di placca e lo restituisce al fegato per la conversione in acidi biliari e l'escrezione dal corpo. Diverse aziende biotecnologiche/farmaceutiche stanno perseguendo questa strategia di trattamento⁴.

Allo stesso tempo, la capacità di generare queste particelle in laboratorio ha scatenato una raffica di attività di ricerca che hanno portato a nuove applicazioni e nuove tecnologie. Un'applicazione importante riguarda l'uso di particelle rHDL come membrana in miniatura per ospitare proteine transmembrana in un ambiente nativo⁵. Ad oggi, centinaia di proteine sono state incorporate con successo nella rHDL discoidale e la ricerca ha dimostrato che queste proteine mantengono sia la conformazione nativa che l'attività biologica come recettori, enzimi, trasportatori, ecc. Queste particelle, denominate "nanodischi", hanno anche dimostrato di essere suscettibili di caratterizzazione strutturale, spesso ad alta risoluzione⁶. Questo approccio allo studio delle proteine transmembrana è riconosciuto come superiore agli studi con micelle detergenti o liposomi e, di conseguenza, sta rapidamente avanzando. È importante riconoscere che sono stati descritti due metodi distinti che sono in grado di formare un rHDL. Il metodo "dialisi colata"¹³ è popolare per applicazioni relative all'incorporazione di proteine transmembrana nel^{bistrato 5} rHDL. Essenzialmente, questo metodo di formulazione prevede la miscelazione di un fosfolipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e la proteina transmembrana di interesse in un tampone contenente il detergente colato di sodio (o desossicolato di sodio; peso molecolare della micella [MW] di 4.200 Da). Il detergente solubilizza efficacemente i diversi componenti della reazione, consentendo di dializzare il campione contro tampone privo di detergente. Durante la fase di dialisi, quando il detergente viene rimosso dal campione, si forma spontaneamente un rHDL. Quando questo approccio viene utilizzato per intrappolare una proteina transmembrana di interesse, le particelle prodotto sono state definite nanodischi⁵. I tentativi di utilizzare questo metodo per incorporare agenti bioattivi idrofobici a piccole molecole (MW <1.000 Da), tuttavia, sono stati in gran parte infruttuosi. A differenza delle proteine transmembrana, gli agenti bioattivi a piccole molecole sono in grado di fuoriuscire dalla sacca di dialisi insieme al detergente, diminuendo notevolmente la loro efficienza di incorporazione nelle rHDL. Questo problema è stato risolto omettendo i detergenti dalla miscela di formulazione¹⁴. Invece, i componenti vengono aggiunti a un tampone acquoso in sequenza, iniziando con il lipide che forma il doppio strato, formando un agente bioattivo stabile contenente rHDL, indicato come nanodisk. Altri hanno utilizzato rHDL per l'incorporazione e il trasporto di agenti di imaging in vivo ⁷. Più recentemente, rHDL specializzato composto da un'impalcatura di apolipoproteina e il glicerofosfolipide anionico, cardiolipina, sono stati impiegati in studi di legame del ligando. Queste particelle forniscono una piattaforma per studi sull'interazione della cardiolipina con vari ligandi solubili in acqua, tra cui calcio, citocromo c e l'agente antitumorale doxorubicina⁸.

Il focus del presente studio è sulla formulazione di rHDL che possiedono un agente bioattivo idrofobico stabilmente incorporato (cioè nanodisk). La capacità di questi agenti di integrarsi nell'ambiente lipidico delle particelle rHDL discoidali conferisce loro efficacemente la solubilità acquosa. In quanto tali, i nanodischi hanno il potenziale per applicazioni terapeutiche in vivo . Quando si formulano i nanodisk, sono necessarie specifiche condizioni di incubazione / reazione per incorporare con successo agenti bioattivi idrofobici discreti nella particella del prodotto e l'obiettivo di questo rapporto è fornire informazioni pratiche dettagliate che possono essere utilizzate come modello fondamentale per la creazione di nuove particelle di nanodisk per applicazioni specifiche. Pertanto, nel contesto di questo manoscritto i termini nanodisco e nanodisco non sono intercambiabili. Mentre nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per contenere una proteina transmembrana incorporata nel suo doppio strato lipidico⁵, il termine nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per incorporare agenti bioattivi idrofobici a basso peso molecolare (< 1.000 Da), come l'amfotericina B¹⁴.

Sono disponibili vari metodi per l'acquisizione di proteine di scaffold adatte. È possibile acquistare proteine di scaffold da produttori [ad esempio apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], tuttavia, il costo può essere un fattore limitante. Un approccio preferito è quello di esprimere le proteine dello scaffold ricombinante in Escherichia coli. I protocolli sono pubblicati per l'apoA-I⁹, l'apoE4¹⁰ umano e la proteina emolinfatica degli insetti apolipophorin-III¹¹. Ai fini degli esperimenti qui descritti, è stato utilizzato il dominio ricombinante umano apoE4 N-terminale (NT) (amminoacidi 1-183). La sequenza nucleotidica che codifica per l'apoE4-NT umano è stata sintetizzata e inserita in un vettore di espressione pET-22b (+) direttamente adiacente alla sequenza leader pelB codificata da vettori. Questo costrutto porta all'espressione di una proteina di fusione pelB leader sequence-apoE4-NT. Dopo la sintesi proteica, la sequenza leader pelB batterica dirige la proteina appena sintetizzata nello spazio periplasmatico dove la peptidasi leader fende la sequenza pelB. La proteina apoE4-NT risultante, senza tag di sequenza o code, successivamente sfugge ai batteri e si accumula nel terreno di coltura^11,12, semplificando l'elaborazione a valle.

Protocollo

1. Trasformazione, espressione e purificazione della componente proteica dello scaffold

1. Trasformazione batterica BL21 con plasmide contenente apoE4-NT
   1. Scongelare un tubo di cellule competenti BL21 (DE3) sul ghiaccio per 10 minuti.
   2. Una volta che tutto il ghiaccio si è sciolto, mescolare delicatamente e accuratamente pipettare 50 μL delle cellule in un tubo di trasformazione su ghiaccio.
   3. Aggiungere 5 μL contenenti 50 ng di DNA plasmidico (per la sequenza, vedere Tabella supplementare 1) alla miscela cellulare. Passare con attenzione il tubo quattro o cinque volte per mescolare. Non vortice.
   4. Mettere il composto sul ghiaccio per 30 minuti.
   5. Shock termico della miscela esattamente a 42 °C per 10 s.
   6. Mettere in ghiaccio per 5 min.
   7. Pipettare 950 μL di mezzo S.O.C. nel tubo a temperatura ambiente.
   8. Posizionare il tubo in un incubatore di agitazione a 37 °C per 60 minuti con oscillazione impostata a 250 giri/min.
   9. Mescolare accuratamente le cellule sfogliando e capovolgendo, quindi distribuire 100 μL di soluzione cellulare su una piastra di selezione Luria Brodo + Agar da 20 mL trattata con ampicillina ad una concentrazione di 0,1 mg/ml.
   10. Incubare durante la notte a 37 °C, o fino a quando le colonie visibili sono cresciute.
2. Utilizzando un pipettatore elettronico, trasferire 25 mL di terreno sterile NZCYM in un matraccio conico sterile da 250 mL a temperatura ambiente e aggiungere ampicillina ad una concentrazione di lavoro finale di 0,1 mg/ml.
3. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, trasferire una singola colonia dalla piastra di selezione contenente il ceppo batterico opportunamente trasformato e aggiungere direttamente al matraccio contenente 25 ml di NZCYM media + ampicillina.
4. Introdurre i 25 mL di sementi di coltura NZCYM in un incubatore di agitazione a 37 °C con oscillazione orbitale impostata a 250 giri/min.
   NOTA: Si raccomanda di coltivare questa coltura di semi durante la notte per raggiungere una concentrazione batterica adeguata (~ 1,5-2,0 unità di densità ottica), misurata utilizzando uno spettrofotometro impostato su lunghezza d'onda = 600 nm.
5. Trasferire 250 mL di terreno sterile NZCYM in quattro palloni sconcertati da 1 L e aggiungere l'antibiotico ampicillina ad una concentrazione operativa di 0,1 mg/ml.
6. In condizioni sterili, trasferire 5 mL di coltura di semi saturi in ciascuno dei quattro palloni contenenti colture da 250 mL e porli in un incubatore agitatore a 37 °C con oscillazione orbitale impostata a 250 giri/min.
   NOTA: A questo punto, la coltura verrà indicata come coltura di espansione e la crescita esponenziale verrà monitorata utilizzando uno spettrofotometro UV1800. La crescita può procedere fino a quando la densità ottica della coltura a 600 nm (OD₆₀₀) raggiunge un valore compreso tra 0,6-0,8.
7. Una volta che la coltura di espansione ha raggiunto il valore desiderato di OD₆₀₀ di 0,6-0,8, aggiungere 59,6 mg di isopropile β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a ciascuna coltura contenente 250 ml di matraccio per una concentrazione finale di 1 mM per indurre l'espressione proteica. A questo punto, la cultura dell'espansione viene definita cultura dell'espressione. Iniziare l'espressione per un periodo di 5 ore.
8. Al termine del periodo di espressione di 5 ore, prelevare i quattro palloni dall'incubatrice agitatrice e pipettare 125 ml in sei flaconi di centrifuga da 250 ml (750 ml totali).
9. Bilanciare ogni flacone della centrifuga per assicurarsi che la massa totale sia entro ±0,5 mg l'uno dall'altro.
   NOTA: questo passaggio è essenziale per garantire un funzionamento sicuro del dispositivo centrifugo.
10. Preparare il dispositivo centrifugo ruotando prima l'interruttore di alimentazione in posizione accesa. Fare clic sul pulsante "Set/Actual" e regolare i parametri su "JA-14", "9.400 x g", 20,00 min e 4 °C utilizzando i quadranti corrispondenti.
11. Caricare i sei flaconi bilanciati della centrifuga in un rotore di centrifuga di dimensioni appropriate e inserirli nella centrifuga assicurandosi che vengano rispettati tutti i parametri di sicurezza specifici.
    NOTA: Continuare questo passaggio fino a quando tutte le colture cellulari batteriche sono state centrifugate e i surnatanti raccolti.
12. Filtrare il surnatante batterico isolato attraverso una filtrazione sottovuoto o un apparecchio equivalente dotato di un filtro da 0,45 micron per rimuovere eventuali residui residui.
13. Purificazione dell'eparina della proteina scaffold apoE4-NT ricombinante
    NOTA: La procedura di purificazione della colonna viene condotta a temperatura ambiente.
    1. Equilibrare la colonna Hi-trap Eparina applicando 10 volumi di colonna (50 ml) di tampone fosfato di sodio 10 mM, pH 7,2, ed eluendo ad una velocità di 5 mL/min.
    2. Applicare il mezzo arricchito apoE4-NT alla colonna ad una velocità di 2,5 ml/min fino a quando non è stato applicato l'intero volume di 1 L del fluido ed eliminare il flusso continuo.
    3. Lavare la colonna con 10 volumi di colonna (50 ml) di tampone fosfato di sodio da 10 mM, pH 7,2, ed eliminare il flusso passante.
    4. Eluire la proteina apoE4-NT desiderata applicando tre volumi di colonna (15 mL) di tampone di eluizione (10 mM tampone fosfato di sodio + 1,5 M NaCl, pH 7,2) alla colonna e raccogliere l'eluato.
14. Dialisi dell'eluato apoE4-NT
    1. Preparare una sezione di tubi per dialisi (le dimensioni del tubo di dialisi utilizzato erano 22 cm di lunghezza, 12 mm di diametro interno e 10.000 MWCO) immergendo accuratamente in acqua distillata deionizzata (ddi) per 10 minuti.
    2. Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) (10 mM fosfato di sodio + 150 mM NaCl, pH 7,2) in un becher di plastica da 1 L o equivalente.
    3. Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che il morsetto sia fissato e che nessun liquido possa fuoriuscire.
    4. Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e versare i 15 ml di eluato apoE4-NT nel tubo di dialisi.
       NOTA: è imperativo verificare la presenza di eventuali perdite in questa fase.
    5. Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.
    6. Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente 1 L di tampone PBS.
    7. Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione su "basso", assicurandosi che non si formi un vortice.
    8. Al termine della dialisi, decantare il retentato in un tubo conico da 50 mL e conservare a -20 °C.
       NOTA: Si raccomanda di eseguire questa dialisi a 4 °C durante la notte.

2. Formulazione di un agente bioattivo contenente nanofloppy

1. Preparazione di aliquote fosfolipidiche
   1. Pesare 5 mg di un fosfolipide appropriato (ad esempio, dimiristoilfosfatidilcolina [DMPC]) e trasferire in una provetta di vetro.
   2. Sciogliere i 5 mg di fosfolipidi aggiungendo 300 μL di CHCl 3 e 100 μL di CH 3 OH per un rapporto totale di₃:1 v/v.
   3. Evaporare il solvente organico ponendo la provetta di vetro sotto un flusso delicato di gas N₂ per 10-15 minuti, in modo tale che un sottile film di fosfolipidi essiccati si formi lungo le pareti della porzione inferiore della provetta.
2. Liofilizzazione delle aliquote fosfolipidiche
   1. Preparare aliquote fosfolipidiche per la liofilizzazione coprendo l'apertura della provetta di vetro con parafilm.
   2. Forare il parafilm con un ago da 24 G circa 10-15 volte.
   3. Collocare le aliquote perforate in un contenitore di liofilizzazione appropriato e assicurarsi che il coperchio di gomma sia sigillato correttamente.
   4. Collegare il contenitore di liofilizzazione al collettore a vuoto situato nella parte superiore della macchina di liofilizzazione e assicurarsi che tutte le altre valvole siano chiuse ermeticamente.
   5. Accendere la macchina di liofilizzazione ruotando l'interruttore di alimentazione e premendo il pulsante di inizializzazione del vuoto.
   6. Dopo che il sistema ha raggiunto il vuoto totale, fare clic sul pulsante di inizializzazione della refrigerazione per iniziare il processo di liofilizzazione.
      NOTA: Si raccomanda di consentire ai campioni di liofilizzarsi durante la notte.
3. Formulazione di nanodischi di amfotericina-B (amp-B)
   1. Pipettare 0,45 mL di PBS sull'aliquota fosfolipidica liofilizzata e vortice per ~30 s per disperdere il lipide.
      NOTA: il campione risultante apparirà opaco e torbido.
   2. Pipettare 50 μL di una soluzione madre di ampB da 20 mg/mL (20 mg di ampB disciolti in 1 mL di dimetilsolfossido [DMSO], conservati a -20 °C in un recipiente ambrato chiuso) nel campione fosfolipidico disperso e nel vortice.
      NOTA: Quando si seleziona un solvente da utilizzare nella preparazione di una soluzione madre dell'agente bioattivo idrofobo, le due considerazioni generali sono 1) la solubilità dell'agente bioattivo e 2) la miscibilità del solvente con il tampone acquoso utilizzato nella formulazione. Mentre DMSO è spesso usato 15,16,17,18,19, dimetilformammide ^20,21 o tetraidrofurano 22 sono stati impiegati con successo ^{anche 23}.
   3. Pipettare 0,5 mL di proteina scaffold apoE4-NT (concentrazione di ~4 mg/ml) nella provetta di vetro contenente il fosfolipide disperso e ampB. Il volume finale del campione deve essere di circa 1 ml.
   4. Bagno sonicare il campione a 24 °C fino a quando la soluzione non chiarisce (generalmente 10-15 min).
4. Centrifugazione a nanodischi
   1. Trasferire la soluzione chiarificata di ampB-nanodisk in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 ml.
   2. Posizionare il tubo in un rotore di microcentrifuga da tavolo con l'aggiunta di un tubo di bilanciamento posto direttamente di fronte.
   3. Stringere il tappo del rotore e chiudere il coperchio della centrifuga.
   4. Programmare la centrifuga per girare per 10 minuti a ~11.000 x g utilizzando i quadranti corrispondenti situati sulla parte anteriore dell'unità micro-centrifuga.
      NOTA: A questo punto, potrebbe essere visibile un pellet. Questo pellet è costituito da fosfolipidi non incorporati e/o ampB.
   5. Rimuovere il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta da microcentrifuga pulita da 1,7 ml.
5. Dialisi del campione di ampB-nanodisk
   1. Preparare una sezione di tubi per dialisi (le dimensioni del tubo di dialisi utilizzati erano di 3 cm di lunghezza, 16 mm di diametro interno e 10.000 MWCO) immergendo accuratamente in acqua ddi per 10 minuti.
   2. Preparare una soluzione tampone PBS da 1 L (10 mM di fosfato di sodio + 150 mM di NaCl, pH 7,2) in un becher di plastica da 1 L o equivalente.
   3. Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che il morsetto sia fissato e che nessun liquido possa fuoriuscire.
   4. Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e trasferire il campione di ampB-nanodisk nel tubo di dialisi.
   5. Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.
   6. Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente 1 L di tampone PBS.
   7. Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione su "basso", assicurandosi che non si formi un vortice. Lasciare proseguire la dialisi per tutta la notte a 4 °C.

3. Analisi spettrale di campioni di ampB-nanodisk

1. Inizializzazione dello spettrofotometro seguita da spegnimento automatico
   1. Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione e collegarlo a un computer di supporto corrispondente premendo il pulsante "PC Control".
   2. Sul computer di supporto, aprire il software etichettato "UVProbe 2.61" e connettersi allo spettrofotometro facendo clic sul pulsante "Connetti" nell'angolo in basso a sinistra.
   3. Fare clic sul pulsante Spectrum sulla barra degli strumenti in alto all'interno del software UVProbe.
   4. Fare clic sul pulsante con l'etichetta Metodo sulla barra degli strumenti in alto.
   5. Fare clic sulla scheda Misurazione e immettere "500" nella casella di testo Start situata in "Intervallo di lunghezza d'onda (nm)" e "300" nella casella di testo "Fine".
   6. Fare clic sul menu a discesa accanto alla scheda denominata Velocità di scansione e impostarla su Media.
   7. Preparare un campione in bianco trasferendo 1 ml di DMSO in due cuvette di quarzo (QS 1.000).
   8. Caricare entrambe le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro, fare clic su Autoblank e registrare uno spettro compreso tra 300 e 500 nm facendo clic su Start nell'angolo in basso a sinistra.
2. Preparazione e analisi spettrale dello standard ampB
   1. Preparare 20 μg/mL ampB standard rimuovendo la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungendo 20 μL di una soluzione madre da 1 mg/mL di ampB (20 μg di ampB totale).
   2. Caricare nuovamente la cuvetta nella porta del campione dello spettrofotometro e fare clic su Start per registrare l'assorbanza del campione.
   3. Rimuovere la cuvetta dalla porta del campione e decantare il contenuto del liquido in un contenitore dei rifiuti opportunamente etichettato.
   4. Risciacquare accuratamente la cuvetta con tre lavaggi di acqua deionizzata seguiti da tre lavaggi con etanolo al 70%.
3. Preparazione e analisi spettrale di campioni di ampB-nanodisk interrotti
   1. Preparare un campione di ampB-nanodisk interrotto (contenente 20 μg/mL come ampB) pipettando 20 μL di uno stock di nanodisk ampB da 1 mg/mL in 1 mL di DMSO. Incubare per almeno 1 minuto prima di registrare lo spettro.
   2. Caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione dello spettrofotometro e fare clic su Start per registrare l'assorbanza del campione.
4. Preparazione e analisi spettrale di un buffer PBS blank
   1. Preparare un buffer PBS bianco trasferendo 1 mL di tampone PBS in due cuvette al quarzo (QS 1.000).
   2. Caricare le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro, fare clic su Autoblank e registrare lo spettro da 300-500 nm.
5. Preparazione e analisi spettrale di un campione di ampB-nanodisk non interrotto
   1. Preparare un campione di ampB-nanodisk non interrotto (contenente 20 μg/mL come ampB) rimuovendo la cuvetta dalla porta anteriore del campione e introducendo 20 μL di un campione di ampB-nanodisk da 1 mg/mL nel buffer PBS.
   2. Caricare nuovamente la cuvetta nella porta campione dello spettrofotometro, fare clic su Start e registrare lo spettro del campione.
      NOTA: Tutti i rifiuti chimici devono essere smaltiti in un contenitore per rifiuti opportunamente etichettato seguendo le linee guida accettate.

4. Analisi del saggio di vitalità del lievito

NOTA: Sono stati eseguiti saggi di vitalità del lievito al fine di valutare l'attività biologica di ampB e determinare se il processo di formulazione o incorporazione in nanodisk, ha influenzato la sua attività di inibizione della crescita del lievito.

1. Formulare due campioni di ampB-nanodisk (volume finale = 1 mL) per contenere 1 mg di ampB per 5 mg di DMPC e 0,1 mg di ampB per 5 mg di DMPC seguendo il metodo precedentemente descritto (2.3-2.4.1).
   NOTA: Per preparare un ampB da 1 mg/mL e 0,1 mg/mL per 5 mg di DMPC, pipettare rispettivamente 50 μL e 5 μL di un ampB da 20 mg/mL in DMSO in ciascun flaconcino del campione.
2. Preparazione di una coltura di lievito saturo
   1. Trasferire 25 ml di terreno sterile di estratto di lievito-peptone-destrosio (YPD) in un tubo conico sterile da 50 ml.
   2. Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per trasferire una singola colonia di Saccharomyces cerevisiae (BY4741) nei 25 mL di terreno YPD.
   3. Coltivare il lievito in un incubatore agitatore impostato a 30 °C, con oscillazione impostata a 200 giri / min per 18 h.
3. Preparazione di campioni di test individuali di inibizione della crescita
   1. Trasferire 5 ml di terreno YPD sterile in 30 provette sterili da 13 mL.
   2. Trattare tre serie di provette di coltura aggiungendo 20, 10 e 5 μL del campione di ampB-nanodisk da 1 mg/mL, che rappresentano rispettivamente 20, 10 e 5 μg di ampB.
   3. Trattare tre serie di provette di coltura aggiungendo 20, 10 e 5 μl del campione di 0,1 mg/mL ampB-nanodisk, che rappresentano rispettivamente 2, 1 e 0,5 μg di ampB.
   4. Trattare quattro serie di provette di coltura aggiungendo 20 μL di PBS, DMSO, rHDL di controllo (senza ampB) o 20 μg di ampB in DMSO.
      NOTA: ogni set di provette di coltura rappresenta una replica indipendente. Pertanto, seguendo questo metodo si ottiene un valore n complessivo di n = 3.
4. Inizializzazione del saggio di vitalità del lievito
   1. Avviare l'esperimento inoculando ogni campione con 100 μL (2% vol/vol) di coltura di lievito saturo
   2. Coltivare il lievito utilizzando un incubatore agitatore impostato a 30 °C, con oscillazione impostata a 200 rpm per un massimo di 18 h.
5. Misurazioni della vitalità del lievito
   1. Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione, quindi fare clic sul pulsante Go To WL e impostare il valore su 600 nm.
   2. Trasferire 1 mL di terreno YPD sterile in due cuvette di plastica, caricare nelle rispettive porte campione sullo spettrofotometro e fare clic su Autoblank.
   3. Trasferire 1 mL di ciascun campione in una cuvetta di plastica, assicurandosi di cambiare le cuvette ogni volta e caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione dello spettrofotometro.
   4. Misurare e registrare la densità ottica di ciascun campione a 600 nm e smaltire ogni cuvetta consumata in un contenitore per rifiuti a rischio biologico correttamente etichettato.

Risultati

Processo di formulazione di nanodischi di agenti bioattivi
Nella procedura di formulazione ampB-nanodisk descritta, la reazione è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro (Figura 1). Questo cambiamento indica che si sono formati nanofloppy e che l'agente bioattivo è stato solubilizzato. Spesso, gli agenti bioattivi assorbono la luce nella regione della lunghezza d'onda visibile (ad esempio, ampB, curcumina, luteina, coenzima Q_10<...

Discussione

La formulazione di un agente bioattivo contenente nanodischi fornisce un metodo conveniente per solubilizzare composti idrofobici altrimenti insolubili. Poiché i nanodischi dell'agente bioattivo prodotto sono completamente solubili in mezzi acquosi, forniscono un utile metodo di rilascio per un'ampia gamma di molecole idrofobiche (Tabella 1). Questi includono piccole molecole, droghe naturali e sintetiche, fitonutrienti, ormoni, ecc. La strategia di formulazione segue solitamente un protocollo standard ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 competent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifuge bottles	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flask	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath	VWR	N/A	ND Formulaton
Heating and Nitrogen module	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulation
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulation
Nitrogen gas	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vector	GenScript	N/A	Transformation
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes	Fisher Brand	14385 928A	Spectral Analysis
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	68100	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	88243	Purification
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Purification
Sodium Phosphate dibasic	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Sodium Phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	Purification
Spectra/POR Weighted Closures	Spectrum Medical Industries	132736	Purification
Spectrophotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	spectral analysis
Tabletop Centrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spectral Analysis
Vacuum filter	Millipore	9004-70-0	Expression & Purification
Vacuum pump	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purification
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Yeast	N/A	BY4741	Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose	BD	242820	Yeast Viability Assay