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여기에서는 나노디스크를 포함하는 생리활성제의 생산 및 특성화에 대해 설명합니다. 암포테리신 B 나노디스크는 프로토콜을 단계적으로 설명하기 위한 예로 사용됩니다.
나노디스크라는 용어는 이중층 형성 지질, 스캐폴드 단백질 및 통합 생리활성제로 구성된 개별 유형의 나노입자를 의미합니다. 나노 디스크는 디스크 모양의 지질 이중층으로 구성되며, 그 둘레는 스캐 폴드 단백질, 일반적으로 교환 가능한 아포지 단백질 계열의 구성원으로 둘러싸여 있습니다. 수많은 소수성 생리활성제는 입자의 지질 이중층의 소수성 환경에 통합되어 나노디스크에서 효율적으로 용해되어 직경 10-20nm 범위의 대체로 균질한 입자 집단을 생성합니다. 나노 디스크의 제형은 개별 성분의 정확한 비율, 각 성분의 적절한 순차적 첨가, 제형 혼합물의 목욕 초음파 처리가 필요합니다. 양친매성 스캐폴드 단백질은 분산된 이중층 형성 지질/생리활성제 혼합물을 자발적으로 접촉하고 재구성하여 나노디스크 입자의 분리되고 균질한 집단을 형성합니다. 이 과정에서 반응 혼합물은 불투명하고 탁한 모양에서 완전히 최적화되면 원심분리 시 침전물이 생성되지 않는 정제된 샘플로 전환됩니다. 특성화 연구에는 생리활성제 가용화 효율, 전자 현미경, 겔 여과 크로마토그래피, 자외선 가시광선(UV/Vis) 흡광도 분광법 및/또는 형광 분광법의 측정이 포함됩니다. 이것은 일반적으로 배양 된 세포 또는 마우스를 사용하여 생물학적 활성을 조사합니다. 항생제(즉, 마크로라이드 폴리엔 항생제 암포테리신 B)를 함유하는 나노디스크의 경우, 농도 또는 시간의 함수로서 효모 또는 진균의 성장을 억제하는 능력을 측정할 수 있습니다. 제형의 상대적 용이성, 구성 부품에 대한 다양성, 나노 스케일 입자 크기, 고유 안정성 및 수용성은 나노 디스크 기술의 무수한 시험관 내 및 생체 내 응용을 허용합니다. 본 논문에서, 우리는 소수성 생리활성제로서 암포테리신 B를 함유하는 나노디스크를 공식화하고 특성화하는 일반적인 방법론을 설명한다.
초기 원반형 고밀도 지단백질(HDL)은 인간 순환계에 존재하는 훨씬 더 풍부한 구형 HDL의 자연 발생 전구체입니다. pre-ß HDL이라고도 하는 이러한 초기 입자는 독특하고 독특한 구조적 특성을 가지고 있습니다1. 실제로, 초기 HDL은 구상 입자로 존재하는 것이 아니라 디스크 모양입니다. 자연 및 재구성 원반형 HDL에 대한 광범위한 구조적 특성화 연구는 주변이 apoA-I와 같은 양친매성 교환 가능한 아포지단백(apo)으로 둘러싸인 인지질 이중층으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 인간 지단백질 대사에서 순환하는 초기 HDL은 말초 세포에서 지질을 축적하고 ATP 결합 카세트 수송체 A1 및 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼제2를 포함한 주요 단백질 매개체에 의존하는 과정에서 구형 HDL로 성숙합니다. 이 과정은 심장 질환을 예방하는 것으로 간주되는 역 콜레스테롤 수송 경로의 중요한 구성 요소를 나타냅니다. 이러한 지식과 원반형 HDL을 재구성할 수 있는 능력으로 무장한 연구자들은 이러한 입자를 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 치료적 중재로 사용했다3. 본질적으로, 환자에게 재구성 된 HDL (rHDL)을 주입하면 플라크 침전물에서 콜레스테롤 유출을 촉진하고 담즙산으....
1. 스캐폴드 단백질 성분의 형질전환, 발현 및 정제
생리활성제 나노디스크 제형 공정
설명된 ampB-나노디스크 제형 절차에서 시료 외관이 탁한 상태에서 투명한 상태로 전환되면 반응이 완료된 것으로 간주됩니다(그림 1). 이 변화는 나노 디스크가 형성되고 생리 활성제가 가용화되었음을 나타냅니다. 종종 생리활성제는 가시광선 파장 영역(예: ampB, 커큐민, 루테인, 코엔자임 Q10)의 빛을 흡수하며, 이러?.......
나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형은 달리 불용성인 소수성 화합물을 가용화하는 편리한 방법을 제공한다. 생성물 생리활성제 나노디스크는 수성 매질에 완전히 용해되기 때문에 광범위한 소수성 분자에 대한 유용한 전달 방법을 제공합니다(표 1). 여기에는 소분자, 천연 및 합성 약물, 식물 영양소, 호르몬 등이 포함됩니다. 제형 전략은 일반적으로 유기 용매에서 생리 활성?.......
저자는 공개 할 것이 없습니다.
이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (R37 HL-64159)의 보조금으로 지원되었습니다.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
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