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요약

여기에서는 나노디스크를 포함하는 생리활성제의 생산 및 특성화에 대해 설명합니다. 암포테리신 B 나노디스크는 프로토콜을 단계적으로 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초록

나노디스크라는 용어는 이중층 형성 지질, 스캐폴드 단백질 및 통합 생리활성제로 구성된 개별 유형의 나노입자를 의미합니다. 나노 디스크는 디스크 모양의 지질 이중층으로 구성되며, 그 둘레는 스캐 폴드 단백질, 일반적으로 교환 가능한 아포지 단백질 계열의 구성원으로 둘러싸여 있습니다. 수많은 소수성 생리활성제는 입자의 지질 이중층의 소수성 환경에 통합되어 나노디스크에서 효율적으로 용해되어 직경 10-20nm 범위의 대체로 균질한 입자 집단을 생성합니다. 나노 디스크의 제형은 개별 성분의 정확한 비율, 각 성분의 적절한 순차적 첨가, 제형 혼합물의 목욕 초음파 처리가 필요합니다. 양친매성 스캐폴드 단백질은 분산된 이중층 형성 지질/생리활성제 혼합물을 자발적으로 접촉하고 재구성하여 나노디스크 입자의 분리되고 균질한 집단을 형성합니다. 이 과정에서 반응 혼합물은 불투명하고 탁한 모양에서 완전히 최적화되면 원심분리 시 침전물이 생성되지 않는 정제된 샘플로 전환됩니다. 특성화 연구에는 생리활성제 가용화 효율, 전자 현미경, 겔 여과 크로마토그래피, 자외선 가시광선(UV/Vis) 흡광도 분광법 및/또는 형광 분광법의 측정이 포함됩니다. 이것은 일반적으로 배양 된 세포 또는 마우스를 사용하여 생물학적 활성을 조사합니다. 항생제(즉, 마크로라이드 폴리엔 항생제 암포테리신 B)를 함유하는 나노디스크의 경우, 농도 또는 시간의 함수로서 효모 또는 진균의 성장을 억제하는 능력을 측정할 수 있습니다. 제형의 상대적 용이성, 구성 부품에 대한 다양성, 나노 스케일 입자 크기, 고유 안정성 및 수용성은 나노 디스크 기술의 무수한 시험관 내 및 생체 내 응용을 허용합니다. 본 논문에서, 우리는 소수성 생리활성제로서 암포테리신 B를 함유하는 나노디스크를 공식화하고 특성화하는 일반적인 방법론을 설명한다.

서문

초기 원반형 고밀도 지단백질(HDL)은 인간 순환계에 존재하는 훨씬 더 풍부한 구형 HDL의 자연 발생 전구체입니다. pre-ß HDL이라고도 하는 이러한 초기 입자는 독특하고 독특한 구조적 특성을 가지고 있습니다1. 실제로, 초기 HDL은 구상 입자로 존재하는 것이 아니라 디스크 모양입니다. 자연 및 재구성 원반형 HDL에 대한 광범위한 구조적 특성화 연구는 주변이 apoA-I와 같은 양친매성 교환 가능한 아포지단백(apo)으로 둘러싸인 인지질 이중층으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 인간 지단백질 대사에서 순환하는 초기 HDL은 말초 세포에서 지질을 축적하고 ATP 결합 카세트 수송체 A1 및 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼제2를 포함한 주요 단백질 매개체에 의존하는 과정에서 구형 HDL로 성숙합니다. 이 과정은 심장 질환을 예방하는 것으로 간주되는 역 콜레스테롤 수송 경로의 중요한 구성 요소를 나타냅니다. 이러한 지식과 원반형 HDL을 재구성할 수 있는 능력으로 무장한 연구자들은 이러한 입자를 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 치료적 중재로 사용했다3. 본질적으로, 환자에게 재구성 된 HDL (rHDL)을 주입하면 플라크 침전물에서 콜레스테롤 유출을 촉진하고 담즙산으로 전환하고 신체에서 배설하기 위해 간으로 되돌립니다. 여러 생명공학/제약회사들이 이 치료 전략을 추구하고 있다4.

동시에 실험실에서 이러한 입자를 생성하는 능력은 새로운 응용 분야와 새로운 기술로 이어진 연구 활동을 촉발했습니다. 한 가지 두드러진 응용 분야는 rHDL 입자를 미니어처 멤브레인으로 사용하여 네이티브와 같은 환경에서 막횡단 단백질을 수용하는 것입니다5. 현재까지 수백 개의 단백질이 원반형 rHDL에 성공적으로 통합되었으며 연구에 따르면 이러한 단백질은 수용체, 효소, 수송체 등과 같은 기본 형태와 생물학적 활성을 모두 유지합니다. "나노디스크(nanodiscs)"라고 불리는 이 입자들은 종종 고분해능(high resolution)에서 구조적 특성화에 적합한 것으로 나타났다6. 막횡단 단백질 조사에 대한 이러한 접근 방식은 세제 미셀이나 리포솜을 사용한 연구보다 우수한 것으로 인식되고 있으며 그 결과 빠르게 발전하고 있습니다. rHDL을 형성할 수 있는 두 가지 별개의 방법이 보고되었음을 인식하는 것이 중요합니다. "콜레이트 투석" 방법(13 )은 rHDL 이중층(5)에 막횡단 단백질을 혼입시키는 것과 관련된 응용에 널리 사용된다. 본질적으로, 이러한 제형 방법은 세제인 소듐 콜레이트 (또는 소듐 데옥시콜레이트; 4,200 Da의 미셀 분자량 [MW])를 함유하는 완충제에서 이중층 형성 인지질, 스캐폴드 단백질, 및 관심있는 막횡단 단백질을 혼합하는 것을 포함한다. 세제는 다양한 반응 성분을 효과적으로 용해시켜 세제가 부족한 완충액에 대해 시료를 투석할 수 있도록 합니다. 투석 단계에서 세제가 샘플에서 제거됨에 따라 rHDL이 자발적으로 형성됩니다. 이 접근법이 관심 있는 막횡단 단백질을 포획하는 데 사용될 때, 생성물 입자는 나노디스크(nanodisc)5라고 불린다. 그러나 이 방법을 사용하여 소분자 소수성 생리활성제(MW<1,000Da)를 통합하려는 시도는 대체로 성공적이지 못했습니다. 막횡단 단백질과 달리 저분자 생리활성제는 세제와 함께 투석 백에서 빠져나갈 수 있어 rHDL로의 결합 효율을 크게 감소시킵니다. 이 문제는 배합혼합물(14)에서 세제를 생략함으로써 해결되었다. 대신에, 성분들은 지질을 형성하는 이중층으로부터 시작하여, 나노디스크로 지칭되는 rHDL을 함유하는 안정한 생리활성제를 형성하면서, 수성 완충액에 순차적으로 첨가된다. 다른 연구자들은 생체 내 이미징 에이전트의 혼입 및 수송을 위해 rHDL을 사용했다7. 보다 최근에는 아포지단백 스캐폴드와 음이온성 글리세로인지질인 카디오리핀으로 구성된 특수 rHDL이 리간드 결합 연구에 사용되었습니다. 이 입자는 카디오리핀과 칼슘, 시토크롬 c, 항암제인 독소루비신을 포함한 다양한 수용성 리간드의 상호작용을 연구하기 위한 플랫폼을 제공한다8.

본 연구의 초점은 안정적으로 통합된 소수성 생리활성제(즉, 나노디스크)를 보유하는 rHDL의 제형에 있습니다. 원반형 rHDL 입자의 지질 환경에 통합하는 이러한 제제의 능력은 효과적으로 수용성을 부여합니다. 따라서 나노디스크는 생체 내 치료 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 나노디스크를 제조할 때, 분리된 소수성 생리활성제를 제품 입자에 성공적으로 통합하기 위해서는 특정 배양/반응 조건이 필요하며, 이 보고서의 목표는 특정 응용 분야를 위한 새로운 나노디스크 입자를 만들기 위한 기본 템플릿으로 사용할 수 있는 상세한 실용적인 정보를 제공하는 것입니다. 따라서 이 원고의 맥락에서 나노디스크와 나노디스크라는 용어는 서로 바꿔 사용할 수 없습니다. 나노디스크는 그의 지질 이중층(5)에 매립된 막횡단 단백질을 함유하도록 제형화된 rHDL을 의미하는 반면, 나노디스크라는 용어는 암포테리신B14와 같은 저분자량(< 1,000Da) 소수성 생리활성제를 혼입하도록 제형화된 rHDL을 의미한다.

적합한 스캐폴드 단백질의 획득을 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 스캐폴드 단백질을 제조업자로부터 구입할 수 있지만[예를 들어, apoA-I (SRP4693) 또는 apoE4 (A3234)], 그러나 비용이 제한 요인이 될 수 있다. 바람직한 접근법은 대장균에서 재조합 스캐폴드 단백질을 발현하는 것이다. 인간 apoA-I9, apoE410 및 곤충 체액 림프 단백질 apolipophorin-III11에 대한 프로토콜이 발표되었습니다. 본원에 기재된 실험의 목적을 위해, 재조합 인간 apoE4 N-말단 (NT) 도메인 (아미노산 1-183)을 사용하였다. 인간 apoE4-NT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 합성하여 벡터-코딩된 pelB 리더 서열에 직접 인접한 pET-22b(+) 발현 벡터에 삽입하였다. 이러한 구축물은 pelB 리더 서열-apoE4-NT 융합 단백질의 발현을 유도한다. 단백질 합성 후, 박테리아 pelB 리더 서열은 새로 합성된 단백질을 리더 펩티다아제가 pelB 서열을 절단하는 주변세포질 공간으로 유도합니다. 서열 태그 또는 꼬리가 없는 생성된 apoE4-NT 단백질은 이후 박테리아를 빠져나와 배양 배지11,12에 축적되어 다운스트림 처리를 단순화합니다.

프로토콜

1. 스캐폴드 단백질 성분의 형질전환, 발현 및 정제

  1. 플라스미드를 함유하는 apoE4-NT를 이용한 BL21 박테리아 형질전환
    1. BL21(DE3) 유능한 세포 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 해동합니다.
    2. 모든 얼음이 녹으면 50μL의 세포를 얼음 위의 형질 전환 튜브에 부드럽고 조심스럽게 피펫으로 혼합합니다.
    3. 50ng의 플라스미드 DNA를 함유하는 5μL(서열은 보충 표 1 참조)를 세포 혼합물에 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 4-5번 튕겨 섞습니다. 소용돌이치지 마십시오.
    4. 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓습니다.
    5. 혼합물을 정확히 42°C에서 10초 동안 열 충격을 가합니다.
    6. 얼음 위에 5분 동안 둡니다.
    7. 950 μL의 S.O.C. 배지를 실온에서 튜브에 넣습니다.
    8. 튜브를 37°C 진탕 인큐베이터에 넣고 진동을 250rpm으로 설정하여 60분 동안 배치합니다.
    9. 플릭 및 반전으로 세포를 완전히 혼합한 다음 100μL의 세포 용액을 0.1mg/mL 농도의 암피실린으로 처리된 20mL Luria Broth + Agar 선택 플레이트에 뿌립니다.
    10. 37°C에서 하룻밤 동안 또는 눈에 보이는 집락이 자랄 때까지 배양합니다.
  2. 전자 피펫터를 사용하여 25mL의 멸균 NZCYM 배지를 실온에서 멸균된 250mL 원추형 플라스크에 옮기고 암피실린을 최종 작업 농도 0.1mg/mL에 추가합니다.
  3. 멸균 접종 루프를 사용하여 적절하게 형질전환된 박테리아 균주가 들어 있는 선택 플레이트에서 개별 콜로니 1개를 옮기고 NZCYM 배지 + 암피실린 25mL가 들어 있는 플라스크에 직접 추가합니다.
  4. 25 mL의 NZCYM 종자 배양 플라스크를 250 rpm으로 설정된 오비탈 진동과 함께 37°C 진탕 배양기에 넣었다.
    참고: 이 종자 배양은 파장 = 1.5nm로 설정된 분광 광도계를 사용하여 측정할 때 적절한 박테리아 농도(~2.0-600 광학 밀도 단위)에 도달하도록 밤새 재배하는 것이 좋습니다.
  5. 멸균 NZCYM 배지 250mL를 4개의 1L 배플 플라스크에 옮기고 암피실린 항생제를 0.1mg/mL의 작업 농도로 추가합니다.
  6. 무균 조건 하에서, 5 mL의 포화 종자 배양물을 4개의 250 mL 배양물을 함유하는 플라스크 내로 각각 옮기고, 250 rpm으로 설정된 궤도 진동과 함께 37°C 진탕 배양기에 넣는다.
    참고: 이 시점에서 배양을 확장 배양이라고 하며 UV1800 분광 광도계를 사용하여 기하급수적인 성장을 모니터링합니다. 성장은 600 nm에서의 배양 광학 밀도 (OD600)가 0.6-0.8 사이의 값에 도달할 때까지 진행된다.
  7. 확장 배양이 원하는 OD 600 값 0.6-0.8에 도달하면 최종 농도 1mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 59.6mg을 각250ml 배양 플라스크에 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 이때, 팽창 배양을 발현 배양이라고 한다. 5시간 동안 발현을 시작합니다.
  8. 5시간 발현 기간의 끝에서, 4개의 플라스크를 진탕 인큐베이터로부터 꺼내고, 125 mL를 6개의 250 ml 원심분리기 병(총 750 mL)에 피펫팅한다.
  9. 각 원심분리기 병의 균형을 맞춰 총 질량이 서로 ±0.5mg 이내인지 확인합니다.
    알림: 이 단계는 원심분리기 장치의 안전한 작동을 보장하는 데 필수적입니다.
  10. 먼저 전원 스위치를 켜짐 위치로 돌려 원심분리기를 준비합니다. "Set/Actual"이라고 표시된 버튼을 클릭하고 해당 다이얼을 사용하여 매개변수를 "JA-14", "9,400 x g", 20.00분 및 4°C로 조정합니다.
  11. 6개의 균형 잡힌 원심분리기 병을 적절한 크기의 원심분리기 로터에 넣고 특정 안전 매개변수를 준수하도록 원심분리기에 넣습니다.
    참고: 모든 박테리아 세포 배양이 원심분리되고 상층액이 수집될 때까지 이 단계를 계속합니다.
  12. 진공 여과 또는 0.45미크론 필터가 장착된 동등한 장치를 통해 분리된 박테리아 상청액을 여과하여 잔류 파편을 제거합니다.
  13. 재조합 apoE4-NT 스캐폴드 단백질의 헤파린 정제
    참고: 컬럼 정제 절차는 실온에서 수행됩니다.
    1. 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)의 10컬럼 부피(50mL)를 적용하고 5mL/분의 속도로 용리하여 Hi-trap 헤파린 컬럼을 평형화합니다.
    2. apoE4-NT 농축 배지를 전체 1L 부피의 배지가 도포될 때까지 2.5mL/분의 속도로 컬럼에 도포하고 플로우 스루를 버립니다.
    3. 컬럼을 10 mM 소듐 포스페이트 완충액, pH 7.2의 10 컬럼 부피(50 mL)로 세척하고, 플로우 스루를 버린다.
    4. 3개의 컬럼 부피(15mL)의 용출 완충액(10mM 인산나트륨 완충액 + 1.5M NaCl, pH 7.2)을 컬럼에 적용하여 원하는 apoE4-NT 단백질을 용출하고 용출액을 수집합니다.
  14. apoE4-NT 용출액의 투석
    1. 증류수 탈이온수(ddi)에 10분 동안 완전히 담가 투석 튜브의 한 부분(사용된 투석 튜브의 치수는 길이 22cm, 내경 12mm, MWCO 10,000MWCO)을 준비합니다.
    2. 1L 플라스틱 비커 또는 이와 동등한 1L에 1L의 인산염 완충 식염수(PBS)(10mM 인산나트륨 + 150mM NaCl, pH 7.2)를 준비합니다.
    3. 투석 튜브 cl을 사용하여amp, clamp 담근 투석 튜브의 한쪽 끝, cl을 확인하십시오.amp 고정되어 액체가 빠져나갈 수 없습니다.
    4. 좁은 목 깔때기를 투석 튜브의 열린 끝에 삽입하고 15mL의 apoE4-NT 용출액을 투석 튜브에 붓습니다.
      알림: 이 단계에서 누출 여부를 확인하는 것이 중요합니다.
    5. 깔때기를 제거하고 clamp 다른 투석 튜브 cl로 투석 튜브의 끝을 clamp.
    6. 투석 튜브의 밀봉된 끝 중 하나에 폼 투석 플로트를 놓고 조립된 투석 튜브를 1L의 PBS 버퍼가 들어 있는 비커에 넣습니다.
    7. 마그네틱 교반 막대를 비커 바닥에 놓고 교반 제어를 "낮음"으로 조정하여 소용돌이가 형성되지 않도록 합니다.
    8. 투석이 끝나면 잔류물을 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
      알림: 이 투석은 4 °C에서 밤새 수행하는 것이 좋습니다.

2. 나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형

  1. 인지질 분취액의 제조
    1. 적절한 인지질(예: 디미리스토일포스파티딜콜린[DMPC]) 5mg의 무게를 측정하고 유리 시험관으로 옮깁니다.
    2. CHCl300 μL와 CH 3 OH 100 μL를3: 1 v / v의 총 비율로 첨가하여 인지질 5 mg을 용해시킵니다.
    3. 유리 시험관을 10-15분 동안N2 가스의 부드러운 스트림 하에 두어 유기 용매를 증발시키고, 건조된 인지질의 박막이 튜브의 바닥부의 벽을 따라 형성되도록 한다.
  2. 인지질 분취량의 동결건조
    1. 동결건조를 위한 인지질 분취액을 준비하기 위해 유리 시험관 개구부를 파라필름으로 덮습니다.
    2. 24G 바늘을 사용하여 파라필름을 약 10-15회 천공합니다.
    3. 구멍이 뚫린 분취량을 적절한 동결건조 용기에 넣고 고무 뚜껑이 올바르게 밀봉되었는지 확인합니다.
    4. 동결건조 용기를 동결건조 기계 상단에 있는 진공 매니폴드에 부착하고 다른 모든 밸브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.
    5. 전원 스위치를 뒤집고 진공 초기화 버튼을 눌러 동결건조 기계를 켭니다.
    6. 시스템이 전체 진공에 도달한 후 냉동 초기화 버튼을 클릭하여 동결 건조 프로세스를 시작합니다.
      참고: 샘플을 밤새 동결건조하는 것이 좋습니다.
  3. 암포테리신-B(amp-B) 나노디스크의 제형
    1. 동결건조된 인지질 분취액에 PBS 0.45 mL를 피펫팅하고 ~30초 동안 볼텍스하여 지질을 분산시켰다.
      알림: 결과 sample은 불투명하고 탁하게 보입니다.
    2. 20mg/mL 스톡 ampB 용액(20mg의 ampB를 디메틸설폭사이드[DMSO] 1mL에 용해, 밀폐된 호박색 용기에 -20°C에서 보관)의 50μL를 분산된 인지질 샘플에 넣고 소용돌이칩니다.
      참고: 소수성 생리활성제의 원액을 제조할 때 사용할 용매를 선택할 때 가장 중요한 두 가지 고려 사항은 1) 생리활성제의 용해도 및 2) 제형에 사용된 수성 완충액과 용매의 혼화성입니다. DMSO가 자주 사용되는 반면(15,16,17,18,19), 디메틸포름아미드(20,21) 또는 테트라히드로푸란(22)도 성공적으로 사용되었다(23).
    3. 0.5mL의 apoE4-NT 스캐폴드 단백질(농도 ~4mg/mL)을 분산된 인지질과 ampB가 포함된 유리 시험관에 피펫팅합니다. 샘플의 최종 부피는 약 1mL여야 합니다.
    4. 용액이 정화될 때까지 24°C에서 샘플을 초음파 처리합니다(일반적으로 10-15분).
  4. 나노디스크 원심분리
    1. 정화된 ampB-나노디스크 용액을 멸균된 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    2. 튜브를 탁상용 마이크로 원심분리기 로터에 넣고 바로 반대쪽에 밸런스 튜브를 추가합니다.
    3. 로터 캡을 조이고 원심분리기 뚜껑을 닫습니다.
    4. 마이크로 원심분리기 전면에 있는 해당 다이얼을 사용하여 ~10 x g 에서 11,000분 동안 회전하도록 원심분리기를 프로그래밍합니다.
      알림: 이 시점에서 펠릿이 보일 수 있습니다. 이 펠릿은 통합되지 않은 인지질 및/또는 ampB로 구성됩니다.
    5. 상층액을 제거하고 다른 깨끗한 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  5. ampB-nanodisk 샘플의 투석
    1. ddi 물에 10분 동안 완전히 담가 투석 튜브(사용된 투석 튜브의 치수는 길이 3cm, 내경 16mm, MWCO 10,000MWCO)의 일부를 준비합니다.
    2. 1 L 플라스틱 비이커 또는 등가물에 1 L PBS 완충용액(10 mM 인산나트륨 + 150 mM NaCl, pH 7.2)을 준비한다.
    3. 투석 튜브 cl을 사용하여amp, clamp 담근 투석 튜브의 한쪽 끝, cl을 확인하십시오.amp 고정되어 액체가 빠져나갈 수 없습니다.
    4. 좁은 목 깔때기를 투석 튜브의 열린 끝에 삽입하고 ampB-나노디스크 샘플을 투석 튜브로 옮깁니다.
    5. 깔때기를 제거하고 clamp 다른 투석 튜브 cl로 투석 튜브의 끝을 clamp.
    6. 투석 튜브의 밀봉된 끝 중 하나에 폼 투석 플로트를 놓고 조립된 투석 튜브를 1L의 PBS 버퍼가 들어 있는 비커에 넣습니다.
    7. 마그네틱 교반 막대를 비커 바닥에 놓고 교반 제어를 "낮음"으로 조정하여 소용돌이가 형성되지 않도록 합니다. 4 °C에서 밤새 투석을 계속하십시오.

3. ampB-nanodisk 샘플의 스펙트럼 분석

  1. 분광 광도계 초기화 후 자동 블랭크
    1. 전원 스위치를 눌러 분광 광도계를 켜고 "PC Control"이라고 표시된 버튼을 눌러 해당 지원 컴퓨터에 연결합니다.
    2. 지원 컴퓨터에서 "UVProbe 2.61"이라고 표시된 소프트웨어를 열고 왼쪽 하단 모서리에 있는 "연결"이라고 표시된 버튼을 클릭하여 분광 광도계에 연결합니다.
    3. UVProbe 소프트웨어의 상단 도구 모음에서 Spectrum 이라고 표시된 버튼을 클릭합니다.
    4. 위쪽 도구 모음에서 메서드 라고 표시된 단추를 클릭합니다.
    5. 측정 탭을 클릭하고 "파장 범위(nm)" 아래에 있는 시작 텍스트 상자에 "500"을 입력하고 "끝" 텍스트 상자에 "300"을 입력합니다.
    6. Scan Speed(스캔 속도)라고 표시된 탭 옆에 있는 드롭다운 메뉴를 클릭하고 Medium(중간)으로 설정합니다.
    7. 1ml의 DMSO를 두 개의 석영 큐벳(QS 1.000)에 옮겨 샘플 블랭크를 준비합니다.
    8. 두 큐벳을 분광 광도계의 각 샘플에 로드하고 Autoblank를 클릭한 다음 왼쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 300-500nm의 스펙트럼을 기록합니다.
  2. ampB 표준물질의 준비 및 스펙트럼 분석
    1. 전면에서 큐벳을 제거하여 20μg/mL ampB 표준물질을 준비합니다.amp포트 및 1mg/mL ampB 원액 20μL(총 20μg ampB).
    2. 큐벳을 분광 광도계의 샘플 포트에 다시 로드하고 시작을 클릭하여 샘플 흡광도를 기록합니다.
    3. 샘플 포트에서 큐벳을 제거하고 액체 내용물을 적절하게 라벨이 붙은 폐기물 용기에 디캔팅합니다.
    4. 큐벳을 탈 이온수로 3 회 세척 한 후 70 % 에탄올로 3 회 세척합니다.
  3. 파쇄된 ampB-나노디스크 샘플의 준비 및 스펙트럼 분석
    1. 20μL의 1mg/mL ampB-나노디스크 스톡을 1mL의 DMSO에 피펫팅하여 중단된 ampB-나노디스크 샘플(ampB로 20μg/mL 포함)을 준비합니다. 스펙트럼을 기록하기 전에 최소 1분 동안 배양합니다.
    2. 큐벳을 분광 광도계의 전면 샘플 포트에 로드하고 시작을 클릭하여 샘플 흡광도를 기록합니다.
  4. PBS 버퍼블랭크의 제조 및 스펙트럼 분석
    1. 1mL의 PBS 버퍼를 2개의 석영 큐벳(QS 1.000)에 옮겨 PBS 버퍼 블랭크를 준비합니다.
    2. 큐벳을 각 s에 로드amp분광 광도계의 포트에서 Autoblank를 클릭하고 300-500nm의 스펙트럼을 기록합니다.
  5. 중단되지 않은 ampB-나노디스크 샘플의 준비 및 스펙트럼 분석
    1. 전면 샘플 포트에서 큐벳을 제거하고 20μL의 1mg/mL ampB-나노디스크 샘플을 PBS 버퍼에 도입하여 중단되지 않은 ampB-나노디스크 샘플(ampB로 20μg/mL 포함)을 준비합니다.
    2. 큐벳을 분광 광도계의 샘플 포트에 다시 로드하고 시작을 클릭한 다음 샘플 스펙트럼을 기록합니다.
      알림: 모든 화학 폐기물은 승인된 지침에 따라 적절하게 라벨이 부착된 폐기물 용기에 폐기해야 합니다.

4. 효모 생존율 분석

참고: ampB의 생물학적 활성을 평가하고 나노디스크로의 제형 또는 혼입 과정이 효모 성장 억제 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 효모 생존력 분석을 수행했습니다.

  1. 앞서 설명한 방법(2.3-2.4.1)에 따라 DMPC 5mg당 1mg의 ampB 및 DMPC 5mg당 0.1mg의 ampB를 포함하도록 2개의 ampB-나노디스크 샘플(최종 부피 = 1mL)을 공식화합니다.
    참고: DMPC 1mg당 0.1mg/mL 및 5mg/mL ampB를 만들기 위해 DMSO 스톡에 있는 20mg/mL ampB를 각각 50μL 및 20μL로 피펫팅합니다.amp각 샘플 바이알.
  2. 포화 효모 배양액의 제조
    1. 멸균 효모 추출물-펩톤-포도당(YPD) 배지 25mL를 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
    2. 멸균 접종 루프를 사용하여 단일 Saccharomyces cerevisiae (BY4741) 콜로니를 25mL의 YPD 배지로 옮깁니다.
    3. 30°C로 설정된 진탕 배양기에서 효모를 배양하고 18시간 동안 200rpm으로 진동을 설정합니다.
  3. 개별 성장 억제 분석 샘플의 제조
    1. 5mL의 멸균 YPD 배지를 30개의 멸균 13mL 배양 튜브에 옮깁니다.
    2. 각각 20, 10 및 5 μg의 ampB를 나타내는 1 mg/mL ampB-나노디스크 샘플 20, 10 및 5 μL를 추가하여 3세트의 배양 튜브를 처리합니다.
    3. 각각 2, 1 및 0.5μg의 ampB를 나타내는 0.1mg/mL ampB-나노디스크 샘플 20, 10 및 5μl를 추가하여 3세트의 배양 튜브를 처리합니다.
    4. 20 μL의 PBS, DMSO, 대조군 rHDL(암페어 없음) 또는 20 μg의 ampB를 DMSO에 추가하여 4세트의 배양 튜브를 처리합니다.
      참고: 각 배양 튜브 세트는 독립적인 복제물을 나타냅니다. 따라서 이 방법을 따르면 전체 n 값은 n = 3이 됩니다.
  4. 효모 생존도 분석 초기화
    1. 각 샘플에 포화 효모 배양물 100μL(2% vol/vol)를 접종하여 실험을 시작합니다
    2. 최대 18시간 동안 진동을 200rpm으로 설정하여 30°C로 설정된 진탕 배양기를 사용하여 효모를 배양합니다.
  5. 효모 생존력 측정
    1. 전원 스위치를 돌려 분광 광도계를 켠 다음 Go To WL 이라고 표시된 버튼을 클릭하고 값을 600nm로 설정합니다.
    2. 멸균 YPD 배지 1mL를 두 개의 플라스틱 큐벳에 옮기고 분광 광도계의 각 샘플 포트에 로드한 다음 Autoblank를 클릭합니다.
    3. 각 샘플 1mL를 플라스틱 큐벳에 옮기고 매번 큐벳을 교체하고 큐벳을 분광 광도계의 전면 샘플 포트에 로드합니다.
    4. 600nm에서 각 샘플의 광학 밀도를 측정 및 기록하고 소비된 각 큐벳을 적절하게 라벨이 부착된 생물학적 위험 폐기물 용기에 폐기합니다.

결과

생리활성제 나노디스크 제형 공정
설명된 ampB-나노디스크 제형 절차에서 시료 외관이 탁한 상태에서 투명한 상태로 전환되면 반응이 완료된 것으로 간주됩니다(그림 1). 이 변화는 나노 디스크가 형성되고 생리 활성제가 가용화되었음을 나타냅니다. 종종 생리활성제는 가시광선 파장 영역(예: ampB, 커큐민, 루테인, 코엔자임 Q10)의 빛을 흡수하며, 이러?...

토론

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형은 달리 불용성인 소수성 화합물을 가용화하는 편리한 방법을 제공한다. 생성물 생리활성제 나노디스크는 수성 매질에 완전히 용해되기 때문에 광범위한 소수성 분자에 대한 유용한 전달 방법을 제공합니다(표 1). 여기에는 소분자, 천연 및 합성 약물, 식물 영양소, 호르몬 등이 포함됩니다. 제형 전략은 일반적으로 유기 용매에서 생리 활성?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (R37 HL-64159)의 보조금으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BCayman Chemical Company11636ND Formulation & Standard Preparation
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & Expansion
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformation
Baffled FlaskNew Brunswick ScientificN/AExpansion & Expression
BL21 competent E coliNew England BiolabsC2527ITransformation
Centrifuge bottlesNalgene3140-0250Expression
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Formulation
DMSOSigma Aldrich472301Standard Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND Formulation
Erlenmeyer flaskBellco BiotechnologyN/AExpansion & Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubesVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (Software)DotmaticsN/AYeast Viability Assay
Heated Sonication BathVWRN/AND Formulaton
Heating and Nitrogen moduleThermo ScientificTS-18822ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LyophilizerLabconco7755030ND Formulation
MethanolFisher ScientificA452-4ND Formulation
Nitrogen gasPraxairUN1066ND Formulation
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Expansion & Expression
Pet-22B vectorGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation & Expansion
Quartz CuvettesFisher Brand14385 928ASpectral Analysis
Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
Sodium ChlorideFisher ScientificS271Purification
Sodium Phosphate dibasicFisher ScientificS374-500Purification
Sodium Phosphate monobasicFisher ScientificBP329-500Purification
Spectra/POR Weighted ClosuresSpectrum Medical Industries132736Purification
SpectrophotometerShimadzu UV-1800220-92961-01spectral analysis
Tabletop CentrifugeBeckman Coulter366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression & Purification
Vacuum pumpGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & Purification
VortexFisher Scientific12-812ND Formulation
YeastN/ABY4741Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-DextroseBD242820Yeast Viability Assay

참고문헌

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