JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем производство и характеристику биологически активных агентов, содержащих нанодиски. Нанодиски амфотерицина B взяты в качестве примера для поэтапного описания протокола.

Аннотация

Термин нанодиск относится к дискретному типу наночастицы, состоящей из двухслойного липида, белка каркаса и интегрированного биологически активного агента. Нанодиски организованы в виде дискообразного липидного бислоя, периметр которого ограничен каркасным белком, обычно входящим в семейство обменных аполипопротеинов. Многочисленные гидрофобные биологически активные агенты были эффективно растворены в нанодисках путем их интеграции в гидрофобную среду липидного бислоя частицы, в результате чего образовалась в значительной степени однородная популяция частиц в диапазоне диаметром 10-20 нм. Составление нанодисков требует точного соотношения отдельных компонентов, соответствующего последовательного добавления каждого компонента с последующим ультразвуком в ванне смеси состава. Амфипатический каркасный белок спонтанно контактирует и реорганизует дисперсный бислой, образуя смесь липидов и биологически активных веществ, образуя дискретную однородную популяцию частиц нанодиска. Во время этого процесса реакционная смесь переходит от непрозрачного, мутного вида к осветленному образцу, который при полной оптимизации не дает осадка при центрифугировании. Характеризирующие исследования включают определение эффективности солюбилизации биологически активных веществ, электронную микроскопию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафиолетовую видимую (УФ/Vis) спектроскопию поглощения и/или флуоресцентную спектроскопию. Обычно за этим следует исследование биологической активности с использованием культивируемых клеток или мышей. В случае нанодисков, содержащих антибиотик (т.е. макролидный полиеновый антибиотик амфотерицин В), их способность ингибировать рост дрожжей или грибков в зависимости от концентрации или времени может быть измерена. Относительная простота составления, универсальность по отношению к составным частям, наноразмерный размер частиц, присущая стабильность и растворимость в воде позволяют применять технологию нанодисков in vitro и in vivo . В настоящей статье мы описываем общую методологию формулирования и характеристики нанодисков, содержащих амфотерицин B, в качестве гидрофобного биологически активного агента.

Введение

Зарождающиеся дискоидальные липопротеины высокой плотности (ЛПВП) являются естественными предшественниками гораздо более распространенных сферических ЛПВП, присутствующих в системе кровообращения человека. Эти зарождающиеся частицы, также называемые пре-ß ЛПВП, обладают уникальными и отличительными структурными свойствами1. Действительно, вместо того, чтобы существовать как сфероидальная частица, зарождающиеся ЛПВП имеют форму диска. Обширные исследования структурных характеристик естественных и восстановленных дискоидальных ЛПВП показали, что они состоят из фосфолипидного бислоя, периметр которого ограничен амфипатическим обменным аполипопротеином (апо), таким как апоА-I. В метаболизме липопротеинов человека циркулирующие зарождающиеся ЛПВП накапливают липиды из периферических клеток и созревают в сферические ЛПВП в процессе, который зависит от ключевых белковых медиаторов, включая кассетный транспортер A1, связывающий АТФ, и лецитин: холестерин ацилтрансферс2. Этот процесс представляет собой важнейший компонент обратного пути транспорта холестерина, который считается защитным от сердечных заболеваний. Вооружившись этими знаниями и способностью восстанавливать дискоидальные ЛПВП, исследователи использовали эти частицы в качестве терапевтического вмешательства для лечения атеросклероза3. По сути, вливание восстановленного ЛПВП (рЛПВП) пациентам способствует оттоку холестерина из отложений бляшек и возвращает его в печень для превращения в желчные кислоты и выведения из организма. Несколько биотехнологических/фармацевтических компаний придерживаются этой стратегии лечения4.

В то же время способность генерировать эти частицы в лаборатории вызвала шквал исследовательской деятельности, которая привела к новым приложениям и новым технологиям. Одно из известных применений включает использование частиц рЛПВП в качестве миниатюрной мембраны для размещения трансмембранных белков в нативной среде5. На сегодняшний день сотни белков были успешно включены в дискоидальный рЛПВП, и исследования показали, что эти белки сохраняют как нативную конформацию, так и биологическую активность в качестве рецепторов, ферментов, транспортеров и т. д. Также было показано, что эти частицы, называемые «нанодисками», поддаются структурной характеристике, часто с высоким разрешением6. Этот подход к исследованиям трансмембранных белков признан превосходящим исследования с моющими мицеллами или липосомами и, как следствие, быстро развивается. Важно признать, что сообщалось о двух различных методах, способных формировать рЛПВП. Метод «холатного диализа»13 популярен для применений, связанных с включением трансмембранных белков в бислой5 рЛПВП. По существу, этот способ приготовления включает смешивание двухслойного фосфолипида, белка каркаса и трансмембранного белка, представляющего интерес, в буфере, содержащем детергент холат натрия (или дезоксихолат натрия; молекулярная масса мицеллы [MW] 4,200 Да). Моющее средство эффективно растворяет различные компоненты реакции, позволяя диализовать образец против буфера, в котором отсутствует моющее средство. На этапе диализа, когда моющее средство удаляется из образца, спонтанно образуется рЛПВП. Когда этот подход используется для захвата интересующего трансмембранного белка, частицы продукта были названы нанодисками5. Однако попытки использовать этот метод для включения низкомолекулярных гидрофобных биологически активных агентов (MW <1000 Da) были в значительной степени безуспешными. В отличие от трансмембранных белков, низкомолекулярные биологически активные агенты способны выходить из диализного мешка вместе с детергентом, что значительно снижает эффективность их включения в рЛПВП. Эта проблема была решена путем исключения моющих средств из рецептурной смеси14. Вместо этого компоненты добавляют в водный буфер последовательно, начиная с бислоя, образующего липид, образуя стабильный биологически активный агент, содержащий рЛПВП, называемый нанодиском. Другие использовали рЛПВП для включения и транспортировки агентов визуализации in vivo 7. Совсем недавно специализированные рЛПВП, состоящие из каркаса аполипопротеина и анионного глицерофосфолипида, кардиолипина, использовались в исследованиях связывания лигандов. Эти частицы обеспечивают платформу для исследований взаимодействия кардиолипина с различными водорастворимыми лигандами, включая кальций, цитохром с и противоопухолевый агент доксорубицин8.

Основное внимание в настоящем исследовании уделяется составлению рЛПВП, которые обладают стабильно включенным гидрофобным биологически активным агентом (т.е. нанодиском). Способность этих агентов интегрироваться в липидную среду дискоидальных частиц рЛПВП эффективно придает им растворимость в воде. Таким образом, нанодиски имеют потенциал для терапевтического применения in vivo . При разработке нанодисков требуются определенные условия инкубации/реакции для успешного включения дискретных гидрофобных биологически активных агентов в частицу продукта, и целью этого отчета является предоставление подробной практической информации, которая может быть использована в качестве основополагающего шаблона для создания новых частиц нанодисков для конкретных применений. Таким образом, в контексте данной рукописи термины «нанодиск» и «нанодиск» не являются взаимозаменяемыми. В то время как нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для содержания трансмембранного белка, встроенного в его липидный бислой5, термин нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для включения низкомолекулярных (< 1000 Да) гидрофобных биологически активных агентов, таких как амфотерицин В14.

Существует множество методов получения подходящих белков каркаса. Можно приобрести каркасные белки у производителей [например, apoA-I (SRP4693) или apoE4 (A3234)], однако стоимость может быть ограничивающим фактором. Предпочтительным подходом является экспрессия рекомбинантных белков каркаса в Escherichia coli. Опубликованы протоколы для человека apoA-I9, apoE410, а также белка гемолимфы насекомых аполипофорина-III11. Для целей экспериментов, описанных в настоящем описании, использовали рекомбинантный N-концевой (NT) домен человека apoE4 (аминокислоты 1-183). Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий apoE4-NT, была синтезирована и вставлена в вектор экспрессии pET-22b (+), непосредственно примыкающий к векторно-кодируемой лидерной последовательности pelB. Эта конструкция приводит к экспрессии белка слияния лидерной последовательности pelB - apoE4-NT. После синтеза белка бактериальная лидерная последовательность pelB направляет вновь синтезированный белок в периплазматическое пространство, где пептидаза-лидер расщепляет последовательность pelB. Полученный белок apoE4-NT без меток последовательности или хвостов впоследствии ускользает от бактерий и накапливается в питательной среде11,12, упрощая последующую обработку.

протокол

1. Трансформация, экспрессия и очистка белкового компонента каркаса

  1. Бактериальная трансформация BL21 с помощью плазмиды, содержащей apoE4-NT
    1. Разморозьте пробирку с компетентными ячейками BL21 (DE3) на льду в течение 10 мин.
    2. Как только весь лед растает, аккуратно и осторожно перемешайте пипеткой 50 мкл клеток в трансформационную пробирку на льду.
    3. Добавьте в клеточную смесь 5 мкл, содержащих 50 нг плазмидной ДНК (последовательность см. в дополнительной таблице 1). Осторожно переверните тюбик четыре или пять раз, чтобы перемешать. Не вихревые.
    4. Поместите смесь на лед на 30 минут.
    5. Тепловой шок смеси при температуре ровно 42 °C в течение 10 с.
    6. Выложить на лед на 5 минут.
    7. Пипетка 950 мкл среды S.O.C. в пробирку при комнатной температуре.
    8. Поместите пробирку в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C на 60 минут с колебаниями, установленными на 250 об/мин.
    9. Тщательно перемешайте клетки, щелкнув и инвертировав, затем нанесите 100 мкл клеточного раствора на 20 мл бульона Лурия + агар, обработанную ампициллином в концентрации 0,1 мг / мл.
    10. Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 ° C или до тех пор, пока не вырастут видимые колонии.
  2. С помощью электронного пипеттора перенесите 25 мл стерильной среды NZCYM в стерильную коническую колбу объемом 250 мл при комнатной температуре и добавьте ампициллин до конечной рабочей концентрации 0,1 мг/мл.
  3. Используя стерильную инокуляционную петлю, перенесите одну отдельную колонию из отборочной пластины, содержащей соответствующим образом преобразованный бактериальный штамм, и добавьте непосредственно в колбу, содержащую 25 мл среды NZCYM + ампициллин.
  4. Поместите 25 мл колбы с семенной культурой NZCYM в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C с орбитальными колебаниями, установленными на 250 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выращивать эту семенную культуру в течение ночи до достижения подходящей бактериальной концентрации (~ 1,5-2,0 единицы оптической плотности), измеренной с помощью спектрофотометра, установленного на длину волны = 600 нм.
  5. Перелейте 250 мл стерильной среды NZCYM в четыре флаконы по 1 л и добавьте антибиотик ампициллин до рабочей концентрации 0,1 мг/мл.
  6. В стерильных условиях перенесите 5 мл насыщенной семенной культуры в каждую из четырех колб объемом 250 мл и поместите в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C с орбитальными колебаниями, установленными на 250 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе культура будет называться культурой расширения, и экспоненциальный рост будет контролироваться с помощью спектрофотометра UV1800. Рост допускается до тех пор, пока оптическая плотность культивирования при 600 нм (OD600) не достигнет значения в пределах 0,6-0,8.
  7. После того, как культура расширения достигла желаемого значения OD600 0,6-0,8, добавьте 59,6 мг изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в каждую 250 мл культуры, содержащей колбу, для конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать экспрессию белка. На этом этапе язык и региональные параметры расширения называются языком и региональными параметрами выражения. Начинают сцеживание в течение 5 часов.
  8. В конце 5-часового периода экспрессии извлеките четыре колбы из встряхивающего инкубатора и разлейте пипеткой 125 мл в шесть центрифужных флаконов по 250 мл (всего 750 мл).
  9. Сбалансируйте каждую бутылку центрифуги, чтобы убедиться, что общая масса находится в пределах ±0,5 мг друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для обеспечения безопасной работы центрифужного устройства.
  10. Подготовьте центрифужное устройство, сначала переведя выключатель питания во включенное положение. Нажмите кнопку с надписью «Set/Actual» и отрегулируйте параметры на «JA-14», «9 400 x g», 20,00 мин и 4 °C с помощью соответствующих циферблатов.
  11. Загрузите шесть сбалансированных бутылок центрифуги в ротор центрифуги соответствующего размера и поместите в центрифугу, обеспечив соблюдение любых конкретных параметров безопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте этот шаг до тех пор, пока вся культура бактериальных клеток не будет центрифугирована и супернатанты не будут собраны.
  12. Отфильтруйте изолированную бактериальную надосадочную жидкость с помощью вакуумной фильтрации или аналогичного устройства, оснащенного фильтром 0,45 микрона, для удаления остатков мусора.
  13. Гепариновая очистка рекомбинантного белка-каркаса apoE4-NT
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура очистки колонны проводится при комнатной температуре.
    1. Уравновесьте колонку гепарина Hi-trap, применив 10 объемов колонки (50 мл) 10 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7,2 и элюируя со скоростью 5 мл / мин.
    2. Наносите среду, обогащенную апоЕ4-НТ, на колонку со скоростью 2,5 мл/мин до тех пор, пока не будет нанесен весь объем среды объемом 1 л, и откажитесь от проточной среды.
    3. Промойте колонку 10 объемами колонны (50 мл) 10 мМ натрий-фосфатного буфера с pH 7,2 и выбросьте проточный.
    4. Элютируют желаемый белок apoE4-NT, применяя три объема колонки (15 мл) элюирующего буфера (10 мМ буфер фосфата натрия + 1,5 М NaCl, рН 7,2) в колонку и собирают элюат.
  14. Диализ элюата apoE4-NT
    1. Подготовьте секцию диализной трубки (размеры используемой диализной трубки составляли 22 см в длину, внутренний диаметр 12 мм и 10 000 MWCO) путем тщательного замачивания в дистиллированной деионизированной воде (ddi) в течение 10 минут.
    2. Приготовьте 1 л фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) (10 мМ фосфата натрия + 150 мМ NaCl, pH 7,2) в пластиковом стакане объемом 1 л или эквиваленте.
    3. Используя зажим для диализной трубки, зажмите один конец пропитанной диализной трубки, убедившись, что зажим надежно закреплен и жидкость не может выйти.
    4. Вставьте воронку с узким горлышком в открытый конец диализной трубки и налейте 15 мл элюата apoE4-NT в диализную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе обязательно проверьте наличие утечек.
    5. Снимите воронку и зажмите конец диализной трубки другим зажимом для диализной трубки.
    6. Поместите поплавок для пенного диализа на один из герметичных концов диализной трубки и поместите собранную диализную трубку в стакан, содержащий 1 л буфера PBS.
    7. Поместите магнитную мешалку в нижнюю часть стакана и отрегулируйте регулятор перемешивания на «низкий», чтобы не образовывался вихрь.
    8. После завершения диализа декантируйте ретентат в коническую пробирку объемом 50 мл и храните при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить диализ при температуре 4 °C в течение ночи.

2. Рецептура биологически активного вещества, содержащего нанодиски

  1. Препарат фосфолипида аликвоты
    1. Взвесьте 5 мг соответствующего фосфолипида (например,.димиристоилфосфатидилхолин [DMPC]) и переложите в стеклянную пробирку.
    2. Растворите 5 мг фосфолипида, добавив 300 мклCHCl 3 и 100 мкл CH 3 OH для общего соотношения3: 1 об. / об.
    3. Выпарить органический растворитель, поместив стеклянную пробирку под слабую струю газа N2 на 10-15 мин, так что вдоль стенок нижней части пробирки образуется тонкая пленка высушенного фосфолипида.
  2. Лиофилизация фосфолипидных аликвот
    1. Подготовьте фосфолипидные аликвоты для лиофилизации, накрыв отверстие стеклянной пробирки парапленкой.
    2. Перфорируйте парапленку с помощью иглы 24 G примерно 10-15 раз.
    3. Поместите перфорированные аликвоты в соответствующий контейнер для лиофилизации и убедитесь, что резиновая крышка правильно закрыта.
    4. Прикрепите контейнер для лиофилизации к вакуумному коллектору, расположенному в верхней части лиофилизационного аппарата, и убедитесь, что все остальные клапаны плотно закрыты.
    5. Включите лиофилизационный аппарат, щелкнув выключателем питания и нажав кнопку инициализации вакуума.
    6. После того, как система достигнет полного вакуума, нажмите кнопку инициализации охлаждения, чтобы начать процесс сублимационной сушки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы образцы были лиофилизированы в течение ночи.
  3. Рецептура нанодисков амфотерицина-В (амп-В)
    1. Пипеткой 0,45 мл PBS к лиофилизированному фосфолипиду аликвоте и вихрю в течение ~ 30 с для диспергирования липида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный образец будет выглядеть непрозрачным и мутным.
    2. Пипетка 50 мкл 20 мг/мл исходного раствора ампВ (20 мг ампВ, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида [ДМСО], хранящегося при -20 °С в закрытом янтарном сосуде) в дисперсный образец фосфолипидов и вихрь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе растворителя для использования при приготовлении исходного раствора гидрофобного биологически активного агента необходимо учитывать два основных соображения: 1) растворимость биологически активного агента и 2) смешиваемость растворителя с водным буфером, используемым в составе. В то время как часто используется ДМСО 15,16,17,18,19, диметилформамид 20,21 или тетрагидрофуран 22 также успешно используются 23.
    3. Пипеткой 0,5 мл каркасного белка apoE4-NT (концентрация ~4 мг/мл) в стеклянную пробирку, содержащую дисперсный фосфолипид и ампВ. Конечный объем образца должен составлять примерно 1 мл.
    4. Ванну обрабатывают ультразвуком при 24 °C до тех пор, пока раствор не осветлится (обычно 10-15 мин).
  4. Нанодисковое центрифугирование
    1. Перенесите осветленный раствор ampB-нанодиска в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
    2. Поместите трубку в ротор настольной микроцентрифуги с добавлением балансировочной трубки, расположенной прямо напротив.
    3. Затяните крышку ротора и закройте крышку центрифуги.
    4. Запрограммируйте центрифугу на вращение в течение 10 минут при ~ 11 000 x g с помощью соответствующих циферблатов, расположенных на передней панели микроцентрифужного блока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент может быть видна гранула. Эта гранула состоит из неинкорпорированного фосфолипида и/или ампВ.
    5. Извлеките надосадочную жидкость и перенесите ее в другую чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
  5. Диализ образца ampB-нанодиска
    1. Подготовьте секцию диализной трубки (размеры используемой диализной трубки составляли 3 см в длину, внутренний диаметр 16 мм и 10 000 MWCO), тщательно замочив в воде ddi в течение 10 минут.
    2. Приготовьте буферный раствор PBS объемом 1 л (10 мМ фосфата натрия + 150 мМ NaCl, pH 7,2) в пластиковом стакане объемом 1 л или аналогичном.
    3. Используя зажим для диализной трубки, зажмите один конец пропитанной диализной трубки, убедившись, что зажим надежно закреплен и жидкость не может выйти.
    4. Вставьте воронку с узким горлышком в открытый конец диализной трубки и перенесите образец ампВ-нанодиска в диализную трубку.
    5. Снимите воронку и зажмите конец диализной трубки другим зажимом для диализной трубки.
    6. Поместите поплавок для пенного диализа на один из герметичных концов диализной трубки и поместите собранную диализную трубку в стакан, содержащий 1 л буфера PBS.
    7. Поместите магнитную мешалку в нижнюю часть стакана и отрегулируйте регулятор перемешивания на «низкий», чтобы не образовывался вихрь. Дайте диализу продолжаться в течение ночи при 4 ° C.

3. Спектральный анализ образцов ампВ-нанодисков

  1. Инициализация спектрофотометра с последующим автоматическим гашением
    1. Включите спектрофотометр, щелкнув выключателем питания, и подключитесь к соответствующему вспомогательному компьютеру, нажав кнопку с надписью «Управление ПК».
    2. На компьютере поддержки откройте программное обеспечение с надписью «UVProbe 2.61» и подключитесь к спектрофотометру, нажав кнопку с надписью «Подключить» в левом нижнем углу.
    3. Нажмите кнопку с надписью « Спектр» на верхней панели инструментов программного обеспечения UVProbe.
    4. Нажмите кнопку с надписью « Метод » на верхней панели инструментов.
    5. Перейдите на вкладку « Измерение » и введите «500» в текстовое поле « Пуск », расположенное в разделе «Диапазон длин волн (нм)», и «300» в текстовое поле «Конец».
    6. Щелкните раскрывающееся меню рядом с вкладкой «Скорость сканирования» и установите для нее значение «Средний».
    7. Подготовьте заготовку для образца, перелив 1 мл ДМСО в две кварцевые кюветы (QS 1.000).
    8. Загрузите обе кюветы в соответствующие порты спектрофотометра, нажмите « Автопустой» и запишите спектр от 300 до 500 нм, нажав « Пуск » в левом нижнем углу.
  2. Подготовка и спектральный анализ стандарта ампВ
    1. Приготовьте стандарт ампВ 20 мкг/мл, вынув кювету из переднего отверстия для образца и добавив 20 мкл исходного раствора ампВ 1 мг/мл (всего 20 мкг ампВ).
    2. Загрузите кювету обратно в порт образца спектрофотометра и нажмите « Пуск », чтобы записать поглощение образца.
    3. Извлеките кювету из отверстия для образцов и сцедите жидкое содержимое в контейнер для отходов с соответствующей маркировкой.
    4. Тщательно промойте кювету тремя промывками деионизированной водой, а затем тремя промывками с 70% этанолом.
  3. Подготовка и спектральный анализ образца нарушенного ампВ-нанодиска
    1. Подготовьте разрушенный образец ампВ-нанодиска (содержащий 20 мкг/мл в качестве ампВ) путем пипетирования 20 мкл 1 мг/мл ампВ-нанодиска в 1 мл ДМСО. Инкубируйте не менее 1 минуты перед записью спектра.
    2. Загрузите кювету в передний порт спектрофотометра и нажмите « Пуск», чтобы записать поглощение образца.
  4. Подготовка и спектральный анализ заготовки буфера PBS
    1. Подготовьте заготовку буфера PBS, перелив 1 мл буфера PBS в две кварцевые кюветы (QS 1.000).
    2. Загрузите кюветы в соответствующие порты спектрофотометра, нажмите « Автопусто» и запишите спектр от 300 до 500 нм.
  5. Подготовка и спектральный анализ образца неразрушенного ампВ-нанодиска
    1. Подготовьте неразрушенный образец ампВ-нанодиска (содержащий 20 мкг/мл в качестве ампВ), удалив кювету из переднего порта образца и введя 20 мкл образца ампВ-нанодиска 1 мг/мл в буфер PBS.
    2. Загрузите кювету обратно в порт образца спектрофотометра, нажмите кнопку «Пуск» и запишите спектр образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все химические отходы следует утилизировать в контейнер для отходов с соответствующей маркировкой в соответствии с принятыми рекомендациями.

4. Анализ жизнеспособности дрожжей

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы жизнеспособности дрожжей были проведены для того, чтобы оценить биологическую активность ampB и определить, влияет ли процесс приготовления или включения в нанодиски на его активность ингибирования роста дрожжей.

  1. В соответствии с ранее описанным способом (2.3-2.4.1) составьте два образца ампВ-нанодисков (конечный объем = 1 мл), чтобы они содержали 1 мг ампВ на 5 мг ДМПК и 0,1 мг ампВ на 5 мг ДМПК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать ампВ 1 мг/мл и 0,1 мг/мл ампВ на 5 мг ДМПК, пипетку 50 мкл и 5 мкл соответственно ампВ 20 мг/мл в запасе ДМСО в каждый флакон с образцом.
  2. Приготовление насыщенной дрожжевой культуры
    1. Перенесите 25 мл стерильной среды дрожжевого экстракта-пептон-декстрозы (YPD) в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
    2. Используйте стерильную инокуляционную петлю для переноса одной колонии Saccharomyces cerevisiae (BY4741) в 25 мл среды YPD.
    3. Культивируют дрожжи в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 °C с колебаниями до 200 об/мин в течение 18 часов.
  3. Подготовка индивидуальных образцов для ингибирования роста
    1. Перелейте 5 мл стерильной среды YPD в 30 стерильных пробирок для культивирования по 13 мл.
    2. Обработайте три набора культуральных пробирок, добавив 20, 10 и 5 мкл образца ампВ-нанодиска 1 мг/мл, что составляет 20, 10 и 5 мкг ампВ, соответственно.
    3. Обрабатывают три набора культуральных пробирок, добавляя 20, 10 и 5 мкл образца ампВ-нанодиска 0,1 мг/мл, что составляет 2, 1 и 0,5 мкг ампВ соответственно.
    4. Обработайте четыре набора культуральных пробирок, добавив 20 мкл PBS, DMSO, контрольный рЛПВП (без ампВП) или 20 мкг ампВ в ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор культуральных пробирок представляет собой независимую копию. Следовательно, следование этим методам приводит к общему значению n n = 3.
  4. Инициализация анализа жизнеспособности дрожжей
    1. Начните эксперимент с инокуляции каждого образца 100 мкл (2% об./об.) насыщенной культуры дрожжей
    2. Культивируйте дрожжи с помощью встряхивающего инкубатора, настроенного на 30 °C, с колебаниями, установленными на 200 об/мин, в течение максимум 18 часов.
  5. Измерение жизнеспособности дрожжей
    1. Включите спектрофотометр, щелкнув выключателем питания, затем нажмите кнопку с надписью Go To WL и установите значение 600 нм.
    2. Перелейте 1 мл стерильной среды YPD в две пластиковые кюветы, загрузите в соответствующие отверстия для образцов на спектрофотометре и нажмите «Автопусто».
    3. Перенесите 1 мл каждого образца в пластиковую кювету, каждый раз меняя кюветы, и загрузите кювету в переднее отверстие спектрофотометра.
    4. Измерьте и запишите оптическую плотность каждого образца на длине волны 600 нм и утилизируйте каждую использованную кювету в контейнер для биологически опасных отходов с надлежащей маркировкой.

Результаты

Процесс создания нанодисков с биологически активными веществами
В описанной процедуре приготовления ampB-нанодиска реакция считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному (рис. 1). Это изменение указывает на то, что образова...

Обсуждение

Рецептура биологически активного агента, содержащего нанодиски, обеспечивает удобный метод растворения нерастворимых гидрофобных соединений. Поскольку нанодиски биологически активного агента продукта полностью растворимы в водных средах, они обеспечивают полезный способ доставки...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения (R37 HL-64159).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BCayman Chemical Company11636ND Formulation & Standard Preparation
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & Expansion
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformation
Baffled FlaskNew Brunswick ScientificN/AExpansion & Expression
BL21 competent E coliNew England BiolabsC2527ITransformation
Centrifuge bottlesNalgene3140-0250Expression
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Formulation
DMSOSigma Aldrich472301Standard Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND Formulation
Erlenmeyer flaskBellco BiotechnologyN/AExpansion & Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubesVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (Software)DotmaticsN/AYeast Viability Assay
Heated Sonication BathVWRN/AND Formulaton
Heating and Nitrogen moduleThermo ScientificTS-18822ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LyophilizerLabconco7755030ND Formulation
MethanolFisher ScientificA452-4ND Formulation
Nitrogen gasPraxairUN1066ND Formulation
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Expansion & Expression
Pet-22B vectorGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation & Expansion
Quartz CuvettesFisher Brand14385 928ASpectral Analysis
Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
Sodium ChlorideFisher ScientificS271Purification
Sodium Phosphate dibasicFisher ScientificS374-500Purification
Sodium Phosphate monobasicFisher ScientificBP329-500Purification
Spectra/POR Weighted ClosuresSpectrum Medical Industries132736Purification
SpectrophotometerShimadzu UV-1800220-92961-01spectral analysis
Tabletop CentrifugeBeckman Coulter366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression & Purification
Vacuum pumpGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & Purification
VortexFisher Scientific12-812ND Formulation
YeastN/ABY4741Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-DextroseBD242820Yeast Viability Assay

Ссылки

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены