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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung von bioaktiven Wirkstoffen, die Nanoscheiben enthalten. Amphotericin-B-Nanoscheiben werden als Beispiel genommen, um das Protokoll schrittweise zu beschreiben.

Zusammenfassung

Der Begriff Nanodisk bezieht sich auf eine diskrete Art von Nanopartikeln, die aus einer Doppelschicht, die ein Lipid bildet, einem Gerüstprotein und einem integrierten bioaktiven Wirkstoff besteht. Nanoscheiben sind als scheibenförmige Lipiddoppelschicht organisiert, deren Umfang durch das Gerüstprotein begrenzt wird, das normalerweise zur Familie der austauschbaren Apolipoproteine gehört. Zahlreiche hydrophobe bioaktive Wirkstoffe wurden in Nanoscheiben effizient gelöst, indem sie in das hydrophobe Milieu der Lipiddoppelschicht des Partikels integriert wurden, was zu einer weitgehend homogenen Population von Partikeln im Bereich von 10-20 nm Durchmesser führte. Die Formulierung von Nanoscheiben erfordert ein präzises Verhältnis der einzelnen Komponenten, eine geeignete sequenzielle Zugabe jeder Komponente, gefolgt von einer Badbeschallung der Formulierungsmischung. Das amphipathische Gerüstprotein kontaktiert und reorganisiert spontan die dispergierte Doppelschicht, die ein Lipid/bioaktives Wirkstoffgemisch bildet, um eine diskrete, homogene Population von Nanoscheibenpartikeln zu bilden. Während dieses Prozesses geht das Reaktionsgemisch von einem undurchsichtigen, trüben Aussehen in eine geklärte Probe über, die, wenn sie vollständig optimiert ist, beim Zentrifugieren keinen Niederschlag ergibt. Die Charakterisierungsstudien umfassen die Bestimmung der Solubilisierungseffizienz bioaktiver Wirkstoffe, Elektronenmikroskopie, Gelfiltrationschromatographie, UV/Vis-Absorptionsspektroskopie und/oder Fluoreszenzspektroskopie. Daran schließt sich in der Regel eine Untersuchung der biologischen Aktivität mit kultivierten Zellen oder Mäusen an. Im Falle von Nanodisks, die ein Antibiotikum (d. h. das Makrolid-Polyen-Antibiotikum Amphotericin B) enthalten, kann ihre Fähigkeit, das Wachstum von Hefen oder Pilzen in Abhängigkeit von Konzentration oder Zeit zu hemmen, gemessen werden. Die relativ einfache Formulierung, die Vielseitigkeit in Bezug auf die Komponenten, die nanoskalige Partikelgröße, die inhärente Stabilität und die wässrige Löslichkeit ermöglichen unzählige In-vitro - und In-vivo-Anwendungen der Nanodisk-Technologie . Im vorliegenden Artikel beschreiben wir eine allgemeine Methodik zur Formulierung und Charakterisierung von Nanodisks, die Amphotericin B als hydrophoben bioaktiven Wirkstoff enthalten.

Einleitung

Entstehende diskoidale High-Density-Lipoproteine (HDLs) sind natürlich vorkommende Vorläufer des weitaus häufiger vorkommenden sphärischen HDL, das im menschlichen Kreislaufsystem vorkommt. Diese entstehenden Partikel, die auch als prä-ß-HDL bezeichnet werden, besitzen einzigartige und unverwechselbare strukturelle Eigenschaften1. Tatsächlich existieren die entstehenden HDLs nicht als kugelförmige Partikel, sondern sind scheibenförmig. Umfangreiche strukturelle Charakterisierungsstudien an natürlichen und rekonstituierten diskoidalen HDLs haben gezeigt, dass sie aus einer Phospholipiddoppelschicht bestehen, deren Umfang durch ein amphipathisches austauschbares Apolipoprotein (apo), wie z.B. apoA-I, begrenzt ist. Im humanen Lipoproteinstoffwechsel akkumulieren zirkulierende naszierende HDLs Lipide aus peripheren Zellen und reifen zu kugelförmigen HDLs in einem Prozess, der von wichtigen Proteinmediatoren abhängig ist, darunter der ATP-bindende Kassettentransporter A1 und Lecithin:Cholesterin-Acyltransfers2. Dieser Prozess stellt eine wichtige Komponente des umgekehrten Cholesterintransportwegs dar, der als Schutz vor Herzerkrankungen gilt. Ausgestattet mit diesem Wissen und der Fähigkeit, diskoidale HDLs zu rekonstruieren, haben Forscher diese Partikel als therapeutische Intervention zur Behandlung von Atheroskleroseeingesetzt 3. Im Wesentlichen fördert die Infusion von rekonstituiertem HDL (rHDL) in Patienten den Cholesterinausfluss aus Plaqueablagerungen und gibt es zur Leber zurück, wo es in Gallensäuren umgewandelt und aus dem Körper ausgeschieden wird. Mehrere Biotechnologie-/Pharmaunternehmen verfolgen diese Behandlungsstrategie4.

Gleichzeitig hat die Möglichkeit, diese Partikel im Labor zu erzeugen, eine Flut von Forschungsaktivitäten ausgelöst, die zu neuartigen Anwendungen und neuen Technologien geführt haben. Eine prominente Anwendung ist die Verwendung von rHDL-Partikeln als Miniaturmembran zur Unterbringung von Transmembranproteinen in einer nativen Umgebung5. Bis heute wurden Hunderte von Proteinen erfolgreich in diskoidales rHDL eingebaut, und die Forschung hat gezeigt, dass diese Proteine sowohl die native Konformation als auch die biologische Aktivität als Rezeptoren, Enzyme, Transporter usw. beibehalten. Es hat sich auch gezeigt, dass diese Partikel, die als "Nanodiscs" bezeichnet werden, für eine strukturelle Charakterisierung geeignet sind, oft mit hoher Auflösung6. Dieser Ansatz zur Untersuchung von Transmembranproteinen gilt als überlegen gegenüber Studien mit Detergenzienmizellen oder Liposomen und schreitet daher rasch voran. Es ist wichtig zu erkennen, dass zwei verschiedene Methoden beschrieben wurden, die in der Lage sind, eine rHDL zu bilden. Die "Cholatdialyse"-Methode13 ist beliebt für Anwendungen, die mit dem Einbau von Transmembranproteinen in die rHDL-Doppelschicht5 zusammenhängen. Im Wesentlichen beinhaltet dieses Formulierungsverfahren das Mischen einer Doppelschicht, die ein Phospholipid, ein Gerüstprotein bildet, und das interessierende Transmembranprotein in einem Puffer, der das Detergens Natriumcholat (oder Natriumdesoxycholat; Mizellenmolekulargewicht [MW] von 4.200 Da) enthält. Das Detergens löst die verschiedenen Reaktionskomponenten effektiv auf, so dass die Probe gegen Puffer ohne Detergens dialysiert werden kann. Während des Dialyseschritts, wenn das Detergen aus der Probe entfernt wird, bildet sich spontan ein rHDL. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, um ein Transmembranprotein von Interesse einzufangen, wurden die Produktpartikel als Nanoscheiben5 bezeichnet. Versuche, mit dieser Methode niedermolekulare hydrophobe bioaktive Wirkstoffe (MW <1.000 Da) einzubauen, blieben jedoch weitgehend erfolglos. Im Gegensatz zu Transmembranproteinen sind niedermolekulare bioaktive Wirkstoffe in der Lage, zusammen mit dem Detergens aus dem Dialysebeutel zu entweichen, was ihre Inkorporationseffizienz in rHDLs stark verringert. Dieses Problem wurde gelöst, indem Detergenzien aus der Formulierungsmischung14 weggelassen wurden. Stattdessen werden die Komponenten nacheinander in einen wässrigen Puffer gegeben, beginnend mit der Doppelschicht, die ein Lipid bildet, wodurch ein stabiler bioaktiver Wirkstoff entsteht, der rHDL enthält, der als Nanodisk bezeichnet wird. Andere haben rHDL für den Einbau und Transport von In-vivo-Bildgebungsmitteln verwendet 7. In jüngerer Zeit wurden spezialisierte rHDL, bestehend aus einem Apolipoprotein-Gerüst und dem anionischen Glycerophospholipid Cardiolipin, in Ligandenbindungsstudien eingesetzt. Diese Partikel bieten eine Plattform für Studien zur Wechselwirkung von Cardiolipin mit verschiedenen wasserlöslichen Liganden, darunter Calcium, Cytochrom c und das Krebsmittel Doxorubicin8.

Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf der Formulierung von rHDL, die einen stabil eingebauten hydrophoben bioaktiven Wirkstoff (d.h. Nanodisk) besitzen. Die Fähigkeit dieser Wirkstoffe, sich in das Lipidmilieu von scheibenförmigen rHDL-Partikeln zu integrieren, verleiht ihnen effektiv eine wässrige Löslichkeit. Daher haben Nanoscheiben das Potenzial für therapeutische Anwendungen in vivo . Bei der Formulierung von Nanoscheiben sind bestimmte Inkubations-/Reaktionsbedingungen erforderlich, um diskrete hydrophobe bioaktive Wirkstoffe erfolgreich in das Produktpartikel einzubauen, und das Ziel dieses Berichts ist es, detaillierte praktische Informationen bereitzustellen, die als grundlegende Vorlage für die Herstellung neuartiger Nanoscheibenpartikel für bestimmte Anwendungen verwendet werden können. Daher sind die Begriffe Nanodisc und Nanodisk im Kontext dieses Manuskripts nicht austauschbar. Während sich Nanodisc auf ein rHDL bezieht, das so formuliert ist, dass es ein Transmembranprotein enthält, das in seine Lipiddoppelschicht5 eingebettet ist, bezieht sich der Begriff Nanodisk auf ein rHDL, das so formuliert ist, dass es hydrophobe bioaktive Wirkstoffe mit niedrigem Molekulargewicht (< 1.000 Da), wie z. B. Amphotericin B14, enthält.

Für die Gewinnung geeigneter Gerüstproteine stehen eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung. Es ist möglich, Gerüstproteine von Herstellern zu kaufen [z. B. apoA-I (SRP4693) oder apoE4 (A3234)], jedoch können die Kosten ein limitierender Faktor sein. Ein bevorzugter Ansatz ist die Expression rekombinanter Gerüstproteine in Escherichia coli. Es wurden Protokolle für humane apoA-I9, apoE410 sowie das Insekten-Hämolymphprotein Apolipophorin-III11 veröffentlicht. Für die Zwecke der hierin beschriebenen Experimente wurde eine rekombinante humane apoE4 N-terminale (NT) Domäne (Aminosäuren 1-183) verwendet. Die Nukleotidsequenz, die für humanes apoE4-NT kodiert, wurde synthetisiert und in einen pET-22b (+) Expressionsvektor eingefügt, der direkt an die vektorkodierte pelB-Leader-Sequenz angrenzt. Dieses Konstrukt führt zur Expression eines pelB-Leader-Sequenz-apoE4-NT-Fusionsproteins. Nach der Proteinsynthese leitet die bakterielle pelB-Leader-Sequenz das neu synthetisierte Protein in den periplasmatischen Raum, wo die Leader-Peptidase die pelB-Sequenz spaltet. Das resultierende apoE4-NT-Protein ohne Sequenzmarkierungen oder Schwänze entweicht anschließend den Bakterien und reichert sich im Nährmedium11,12 an, was die nachgelagerte Verarbeitung vereinfacht.

Protokoll

1. Transformation, Expression und Aufreinigung der Gerüstproteinkomponente

  1. BL21 bakterielle Transformation mit apoE4-NT enthaltendem Plasmid
    1. Tauen Sie ein Röhrchen mit BL21 (DE3)-kompetenten Zellen 10 Minuten lang auf Eis auf.
    2. Sobald das gesamte Eis geschmolzen ist, mischen Sie vorsichtig und pipettieren Sie vorsichtig 50 μl der Zellen in ein Transformationsröhrchen auf Eis.
    3. Fügen Sie der Zellmischung 5 μl mit 50 ng Plasmid-DNA (für die Sequenz siehe Ergänzende Tabelle 1) hinzu. Schnippen Sie das Röhrchen vorsichtig vier- oder fünfmal, um es zu mischen. Wirbeln Sie nicht.
    4. Die Mischung für 30 Minuten auf Eis legen.
    5. Hitzeschock der Mischung bei exakt 42 °C für 10 s.
    6. 5 Minuten auf Eis legen.
    7. Pipettieren Sie 950 μl S.O.C.-Medium bei Raumtemperatur in das Röhrchen.
    8. Legen Sie das Röhrchen für 60 min in einen 37 °C heißen Schüttelbrutschrank mit einer Oszillation von 250 U/min.
    9. Mischen Sie die Zellen gründlich durch Schnippen und Invertieren und verteilen Sie dann 100 μl Zelllösung auf einer 20-ml-Luria-Bouillon- + Agar-Auswahlplatte, die mit Ampicillin in einer Konzentration von 0,1 mg/ml behandelt wurde.
    10. Über Nacht bei 37 °C inkubieren oder bis sichtbare Kolonien gewachsen sind.
  2. Übertragen Sie mit einer elektronischen Pipette 25 ml steriles NZCYM-Medium in einen sterilen 250-ml-Erlenmeyerkolben bei Raumtemperatur und fügen Sie Ampicillin bis zu einer endgültigen Arbeitskonzentration von 0,1 mg/ml hinzu.
  3. Übertragen Sie mit einer sterilen Impföse eine einzelne Kolonie von der Selektionsplatte, die den entsprechend transformierten Bakterienstamm enthält, und geben Sie sie direkt in den Kolben mit 25 ml NZCYM-Medium + Ampicillin.
  4. Geben Sie die 25 ml NZCYM-Saatgutkulturkolben in einen 37 °C-Schüttelinkubator mit einer Orbitaloszillation von 250 U/min.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, diese Samenkultur über Nacht zu kultivieren, um eine geeignete Bakterienkonzentration (~1,5-2,0 optische Dichteeinheiten) zu erreichen, die mit einem Spektralphotometer gemessen wird, das auf Wellenlänge = 600 nm eingestellt ist.
  5. 250 ml steriles NZCYM-Medium werden in vier 1-Liter-Kolben mit Leitblech umgefüllt und das Ampicillin-Antibiotikum in einer Arbeitskonzentration von 0,1 mg/ml hinzugefügt.
  6. Unter sterilen Bedingungen werden 5 ml gesättigte Samenkultur in jeden der vier 250-ml-Kulturkolben überführt und in einen 37 °C heißen Schüttelinkubator mit einer auf 250 U/min eingestellten Orbitaloszillation gegeben.
    HINWEIS: An dieser Stelle wird die Kultur als Expansionskultur bezeichnet und das exponentielle Wachstum wird mit einem UV1800-Spektralphotometer überwacht. Das Wachstum wird so lange fortgesetzt, bis die optische Dichte der Kultur bei 600 nm (OD600) einen Wert zwischen 0,6 und 0,8 erreicht.
  7. Sobald die Expansionskultur den gewünschten OD600-Wert von 0,6-0,8 erreicht hat, werden 59,6 mg Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu jeder 250-ml-Kultur, die den Kolben enthält, für eine Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt, um die Proteinexpression zu induzieren. An dieser Stelle wird die Expansionskultur als Ausdruckskultur bezeichnet. Beginnen Sie mit der Expression für einen Zeitraum von 5 Stunden.
  8. Am Ende der 5-stündigen Expressionszeit werden die vier Kolben aus dem Schüttelinkubator genommen und 125 ml in sechs 250-ml-Zentrifugenflaschen (insgesamt 750 ml) pipettiert.
  9. Balancieren Sie jede Zentrifugenflasche aus, um sicherzustellen, dass die Gesamtmasse innerhalb von ±0,5 mg zueinander liegt.
    Anmerkungen: Dieser Schritt ist wichtig, um einen sicheren Betrieb der Zentrifugenvorrichtung zu gewährleisten.
  10. Bereiten Sie das Zentrifugengerät vor, indem Sie zuerst den Netzschalter in die Ein-Position stellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Set/Actual" und stellen Sie die Parameter mit den entsprechenden Reglern auf "JA-14", "9.400 x g", 20,00 min und 4 °C ein.
  11. Laden Sie die sechs ausbalancierten Zentrifugenflaschen in einen Zentrifugenrotor geeigneter Größe und setzen Sie sie in die Zentrifuge ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass alle spezifischen Sicherheitsparameter eingehalten werden.
    Anmerkungen: Fahren Sie mit diesem Schritt fort, bis alle bakteriellen Zellkulturen zentrifugiert und Überstände gesammelt wurden.
  12. Filtern Sie den isolierten Bakterienüberstand durch eine Vakuumfiltration oder ein gleichwertiges Gerät, das mit einem 0,45-Mikron-Filter ausgestattet ist, um alle Rückstände zu entfernen.
  13. Heparin-Aufreinigung des rekombinanten ApoE4-NT-Gerüstproteins
    Anmerkungen: Das Säulenreinigungsverfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
    1. Die Hi-Trap-Heparin-Säule wird durch Auftragen von 10 Säulenvolumina (50 ml) 10 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 und einer Eluierung mit einer Rate von 5 ml/min ausgeglichen.
    2. Tragen Sie das mit apoE4-NT angereicherte Medium mit einer Rate von 2,5 ml/min auf die Säule auf, bis das gesamte 1-Liter-Volumen des Mediums aufgetragen wurde, und verwerfen Sie den Durchfluss.
    3. Waschen Sie die Säule mit 10 Säulenvolumina (50 ml) 10 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 und verwerfen Sie den Durchfluss.
    4. Elutieren Sie das gewünschte apoE4-NT-Protein durch Aufbringen von drei Säulenvolumina (15 ml) Elutionspuffer (10 mM Natriumphosphatpuffer + 1,5 M NaCl, pH 7,2) auf die Säule und sammeln Sie das Eluat.
  14. Dialyse von apoE4-NT-Eluat
    1. Bereiten Sie einen Abschnitt des Dialyseschlauchs vor (Abmessungen des verwendeten Dialyseschlauchs waren 22 cm lang, 12 mm Innendurchmesser und 10.000 MWCO), indem Sie ihn 10 Minuten lang gründlich in destilliertem deionisiertem Wasser (ddi) einweichen.
    2. Bereiten Sie 1 l phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,2) in einem 1-Liter-Kunststoffbecherglas oder einem gleichwertigen Becherglas vor.
    3. Klemmen Sie mit einer Dialyseschlauchklemme ein Ende des getränkten Dialyseschlauchs ab und stellen Sie sicher, dass die Klemme gesichert ist und keine Flüssigkeit austreten kann.
    4. Führen Sie einen schmalen Trichter in das offene Ende des Dialyseschlauchs ein und gießen Sie die 15 ml apoE4-NT-Eluat in den Dialyseschlauch.
      Anmerkungen: Es ist unbedingt erforderlich, in diesem Schritt nach Lecks zu suchen.
    5. Entfernen Sie den Trichter und klemmen Sie das Ende des Dialyseschlauchs mit einer anderen Dialyseschlauchklemme ab.
    6. Setzen Sie einen Schaumstoff-Dialyseschlauch auf eines der verschlossenen Enden des Dialyseschlauchs und legen Sie den zusammengebauten Dialyseschlauch in das Becherglas mit 1 l PBS-Puffer.
    7. Setzen Sie einen magnetischen Rührstab in den Boden des Bechers ein und stellen Sie den Rührregler auf "niedrig", damit sich kein Wirbel bildet.
    8. Nach Abschluss der Dialyse wird das Retentat in ein konisches 50-ml-Röhrchen umgefüllt und bei -20 °C gelagert.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, diese Dialyse bei 4 °C über Nacht durchzuführen.

2. Formulierung eines bioaktiven Wirkstoffs, der Nanoscheiben enthält

  1. Herstellung von Phospholipidaliquot
    1. 5 mg eines geeigneten Phospholipids (z. B. Dimyristoylphosphatidylcholin [DMPC]) wiegen und in ein Glasreagenzglas überführen.
    2. Lösen Sie die 5 mg Phospholipid durch Zugabe von 300 μlCHCl 3 und 100 μlCH3OHfür ein Gesamtverhältnis von 3:1 v/v auf.
    3. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel, indem Sie das Glasreagenzglas 10-15 Minuten lang unter einen sanften Strom vonN2-Gas stellen, so dass sich ein dünner Film aus getrocknetem Phospholipid entlang der Wände des unteren Teils des Röhrchens bildet.
  2. Lyophilisierung von Phospholipidaliquoten
    1. Phospholipidaliquote für die Gefriertrocknung vorbereiten, indem die Glasreagenzglasöffnung mit Parafilm abgedeckt wird.
    2. Perforieren Sie den Parafilm mit einer 24 G Nadel ca. 10-15 Mal.
    3. Legen Sie die perforierten Aliquots in einen geeigneten Gefriertrocknungsbehälter und stellen Sie sicher, dass der Gummideckel richtig verschlossen ist.
    4. Befestigen Sie den Gefriertrocknungsbehälter am Vakuumverteiler an der Oberseite der Gefriertrocknungsmaschine und stellen Sie sicher, dass alle anderen Ventile fest verschlossen sind.
    5. Schalten Sie die Gefriertrocknungsmaschine ein, indem Sie den Netzschalter umlegen und die Vakuuminitialisierungstaste drücken.
    6. Nachdem das System das Gesamtvakuum erreicht hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisierung der Kühlung, um den Gefriertrocknungsprozess zu starten.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Proben über Nacht gefrieren zu lassen.
  3. Formulierung von Amphotericin-B (amp-B) Nanoscheiben
    1. Pipettieren Sie 0,45 ml PBS in das lyophilisierte Phospholipidaliquot und wirbeln Sie ~30 s lang, um das Lipid zu dispergieren.
      HINWEIS: Das resultierende Sample erscheint undurchsichtig und trübe.
    2. Pipettieren Sie 50 μl einer 20 mg/ml ampB-Stammlösung (20 mg ampB gelöst in 1 ml Dimethylsulfoxid [DMSO], gelagert bei -20 °C in einem geschlossenen bernsteinfarbenen Gefäß) in die dispergierte Phospholipidprobe und den Vortex.
      ANMERKUNG: Bei der Auswahl eines Lösungsmittels, das zur Herstellung einer Stammlösung des hydrophoben bioaktiven Mittels verwendet werden soll, sind die beiden übergreifenden Überlegungen 1) die Löslichkeit des bioaktiven Mittels und 2) die Mischbarkeit des Lösungsmittels mit dem in der Formulierung verwendeten wässrigen Puffer. Während DMSO häufig 15,16,17,18,19 verwendet wird, wurden auch Dimethylformamid 20,21 oder Tetrahydrofuran 22 erfolgreich eingesetzt23.
    3. Pipettieren Sie 0,5 ml apoE4-NT-Gerüstprotein (Konzentration von ~4 mg/ml) in das Glasreagenzglas, das das dispergierte Phospholipid und ampB enthält. Das Endvolumen der Probe sollte ca. 1 ml betragen.
    4. Die Probe wird bei 24 °C beschallt, bis sich die Lösung geklärt hat (in der Regel 10-15 Minuten).
  4. Zentrifugation von Nanoscheiben
    1. Die geklärte ampB-Nanodisk-Lösung wird in ein steriles 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
    2. Legen Sie das Röhrchen in einen Tisch-Mikrozentrifugenrotor und fügen Sie ein Ausgleichsröhrchen hinzu, das direkt gegenüber platziert ist.
    3. Ziehen Sie die Rotorkappe fest und schließen Sie den Zentrifugendeckel.
    4. Programmieren Sie die Zentrifuge so, dass sie sich 10 Minuten lang bei ~11.000 x g dreht, indem Sie die entsprechenden Einstellräder an der Vorderseite der Mikrozentrifugeneinheit verwenden.
      Anmerkungen: An dieser Stelle kann ein Pellet sichtbar sein. Dieses Pellet besteht aus nicht eingebautem Phospholipid und/oder ampB.
    5. Entfernen Sie den Überstand und füllen Sie ihn in ein anderes sauberes 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Dialyse der ampB-Nanodisk-Probe
    1. Bereiten Sie einen Abschnitt des Dialyseschlauchs vor (Abmessungen des verwendeten Dialyseschlauchs waren 3 cm lang, 16 mm Innendurchmesser und 10.000 MWCO), indem Sie ihn 10 Minuten lang gründlich in ddi-Wasser einweichen.
    2. Bereiten Sie eine 1-l-PBS-Pufferlösung (10 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,2) in einem 1-l-Kunststoffbecherglas oder einem gleichwertigen Becherglas vor.
    3. Klemmen Sie mit einer Dialyseschlauchklemme ein Ende des getränkten Dialyseschlauchs ab und stellen Sie sicher, dass die Klemme gesichert ist und keine Flüssigkeit austreten kann.
    4. Führen Sie einen schmalen Trichter in das offene Ende des Dialyseschlauchs ein und übertragen Sie die ampB-Nanodisk-Probe in den Dialyseschlauch.
    5. Entfernen Sie den Trichter und klemmen Sie das Ende des Dialyseschlauchs mit einer anderen Dialyseschlauchklemme ab.
    6. Setzen Sie einen Schaumstoff-Dialyseschlauch auf eines der verschlossenen Enden des Dialyseschlauchs und legen Sie den zusammengebauten Dialyseschlauch in das Becherglas mit dem 1-Liter-PBS-Puffer.
    7. Setzen Sie einen magnetischen Rührstab in den Boden des Bechers ein und stellen Sie den Rührregler auf "niedrig", damit sich kein Wirbel bildet. Lassen Sie die Dialyse über Nacht bei 4 °C weiterlaufen.

3. Spektralanalyse von ampB-Nanodisk-Proben

  1. Initialisierung des Spektralphotometers mit anschließender automatischer Leerung
    1. Schalten Sie das Spektralphotometer ein, indem Sie den Netzschalter umlegen, und verbinden Sie sich mit einem entsprechenden Support-Computer, indem Sie die Taste "PC-Steuerung" drücken.
    2. Öffnen Sie auf dem Support-Computer die Software mit der Bezeichnung "UVProbe 2.61" und stellen Sie eine Verbindung zum Spektralphotometer her, indem Sie auf die Schaltfläche "Verbinden" in der unteren linken Ecke klicken.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung Spectrum in der oberen Symbolleiste der UVProbe-Software.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Methode in der oberen Symbolleiste.
    5. Klicken Sie auf die Registerkarte Messung und geben Sie "500" in das Textfeld "Start" unter "Wellenlängenbereich (nm)" und "300" in das Textfeld " Ende" ein.
    6. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü neben der Registerkarte Scangeschwindigkeit und stellen Sie es auf Mittel ein.
    7. Bereiten Sie einen Blindprobenrohling vor, indem Sie 1 ml DMSO in zwei Quarzküvetten (QS 1.000) überführen.
    8. Legen Sie beide Küvetten in die entsprechenden Probenanschlüsse des Spektralphotometers, klicken Sie auf Autoblank und nehmen Sie ein Spektrum von 300-500 nm auf, indem Sie in der unteren linken Ecke auf Start klicken.
  2. Präparation und Spektralanalyse des ampB-Standards
    1. Bereiten Sie 20 μg/ml ampB-Standard vor, indem Sie die Küvette aus dem vorderen Probenanschluss entfernen und 20 μl einer 1 mg/ml ampB-Stammlösung (insgesamt 20 μg ampB) hinzufügen.
    2. Legen Sie die Küvette wieder in den Probenanschluss des Spektralphotometers ein und klicken Sie auf Start , um die Probenabsorption aufzuzeichnen.
    3. Nehmen Sie die Küvette aus dem Probenanschluss und füllen Sie den flüssigen Inhalt in einen entsprechend gekennzeichneten Abfallbehälter um.
    4. Spülen Sie die Küvette gründlich mit drei Waschgängen deionisiertem Wasser aus, gefolgt von drei Waschgängen mit 70% Ethanol.
  3. Präparation und Spektralanalyse einer gestörten ampB-Nanodisk-Probe
    1. Bereiten Sie eine aufgebrochene ampB-Nanodisk-Probe (mit 20 μg/ml als ampB) vor, indem Sie 20 μl eines 1 mg/ml ampB-Nanodisk-Stoffes in 1 ml DMSO pipettieren. Vor der Aufnahme des Spektrums mindestens 1 Minute inkubieren.
    2. Legen Sie die Küvette in den vorderen Probenanschluss des Spektralphotometers ein und klicken Sie auf Start , um die Probenabsorption aufzuzeichnen.
  4. Präparation und Spektralanalyse eines PBS-Pufferrohlings
    1. Bereiten Sie einen PBS-Pufferrohling vor, indem Sie 1 ml PBS-Puffer in zwei Quarzküvetten (QS 1.000) überführen.
    2. Legen Sie die Küvetten in die entsprechenden Probenanschlüsse des Spektralphotometers, klicken Sie auf Autoblank und nehmen Sie das Spektrum von 300-500 nm auf.
  5. Präparation und Spektralanalyse einer ungestörten ampB-Nanodisk-Probe
    1. Bereiten Sie eine ununterbrochene ampB-Nanodisk-Probe (mit 20 μg/ml als ampB) vor, indem Sie die Küvette aus dem vorderen Probenanschluss entfernen und 20 μl einer 1 mg/ml ampB-Nanodisk-Probe in den PBS-Puffer einführen.
    2. Legen Sie die Küvette wieder in den Probenanschluss des Spektralphotometers ein, klicken Sie auf Start und zeichnen Sie das Probenspektrum auf.
      HINWEIS: Alle chemischen Abfälle sollten gemäß den anerkannten Richtlinien in einem entsprechend gekennzeichneten Abfallbehälter entsorgt werden.

4. Analyse der Lebensfähigkeit von Hefen

HINWEIS: Hefe-Viabilitätstests wurden durchgeführt, um die biologische Aktivität von ampB zu bewerten und festzustellen, ob der Prozess der Formulierung oder des Einbaus in Nanodisks die Hemmungsaktivität des Hefewachstums beeinflusst.

  1. Formulierung von zwei ampB-Nanodisk-Proben (Endvolumen = 1 ml) mit 1 mg ampB pro 5 mg DMPC und 0,1 mg ampB pro 5 mg DMPC nach der zuvor beschriebenen Methode (2.3-2.4.1).
    Anmerkungen: Um 1 mg/ml und 0,1 mg/ml ampB pro 5 mg DMPC herzustellen, pipettieren Sie 50 μl bzw. 5 μl eines 20 mg/ml ampB in DMSO-Vorrat in jede Probendurchstechflasche.
  2. Herstellung einer gesättigten Hefekultur
    1. Übertragen Sie 25 ml steriles Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen.
    2. Verwenden Sie eine sterile Impföse, um eine einzelne Kolonie von Saccharomyces cerevisiae (BY4741) in die 25 ml YPD-Medium zu übertragen.
    3. Die Hefe wird in einem Schüttelbrutschrank bei 30 °C kultiviert, wobei die Oszillation 18 h lang auf 200 U/min eingestellt ist.
  3. Aufbereitung von individuellen Wachstumshemmungsproben
    1. Übertragen Sie 5 ml steriles YPD-Medium in 30 sterile 13-ml-Kulturröhrchen.
    2. Behandeln Sie drei Sätze von Kulturröhrchen, indem Sie 20, 10 und 5 μl der 1 mg/ml ampB-Nanodisk-Probe hinzufügen, was 20, 10 bzw. 5 μg ampB entspricht.
    3. Behandeln Sie drei Sätze von Kulturröhrchen, indem Sie 20, 10 und 5 μl der 0,1 mg/ml ampB-Nanodisk-Probe hinzufügen, was 2, 1 bzw. 0,5 μg ampB entspricht.
    4. Behandeln Sie vier Sätze von Kulturröhrchen, indem Sie 20 μl PBS, DMSO, Kontroll-rHDL (kein ampB) oder 20 μg ampB in DMSO hinzufügen.
      HINWEIS: Jeder Satz von Kulturröhrchen stellt ein unabhängiges Replikat dar. Daher führt das Befolgen dieser Methoden zu einem Gesamtwert von n = 3.
  4. Initialisierung des Hefe-Viabilitäts-Assays
    1. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie jede Probe mit 100 μL (2% vol/vol) der gesättigten Hefekultur beimpfen
    2. Die Hefe wird mit einem Schüttelbrutschrank auf 30 °C kultiviert, wobei die Oszillation auf 200 U/min für maximal 18 Stunden eingestellt ist.
  5. Messungen der Lebensfähigkeit von Hefen
    1. Schalten Sie das Spektralfotometer ein, indem Sie den Netzschalter umlegen, klicken Sie dann auf die Schaltfläche Go To WL und stellen Sie den Wert auf 600 nm ein.
    2. Füllen Sie 1 ml steriles YPD-Medium in zwei Kunststoffküvetten, laden Sie es in die entsprechenden Probenanschlüsse des Spektralphotometers und klicken Sie auf Autoblank.
    3. Übertragen Sie 1 ml jeder Probe in eine Kunststoffküvette, achten Sie darauf, jedes Mal die Küvetten zu wechseln und die Küvette in die vordere Probenöffnung des Spektralphotometers zu laden.
    4. Messen und notieren Sie die optische Dichte jeder Probe bei 600 nm und entsorgen Sie jede verbrauchte Küvette in einem ordnungsgemäß gekennzeichneten Behälter für biologisch gefährliche Abfälle.

Ergebnisse

Bioaktiver Wirkstoff Nanodisk-Formulierungsprozess
Bei dem beschriebenen ampB-Nanodisk-Formulierungsverfahren gilt die Reaktion als abgeschlossen, wenn das Erscheinungsbild der Probe von trüb zu klar übergeht (Abbildung 1). Diese Veränderung deutet darauf hin, dass sich Nanoscheiben gebildet haben und der bioaktive Wirkstoff solubilisiert wurde. Häufig absorbieren bioaktive Wirkstoffe Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich (z. B. ampB, Curcumin, Lutein, Coenzym Q

Diskussion

Die Formulierung eines bioaktiven Wirkstoffs, der Nanoscheiben enthält, stellt eine bequeme Methode zur Solubilisierung ansonsten unlöslicher hydrophober Verbindungen dar. Da das Produkt nanoaktive Wirkstoff-Nanoscheiben in wässrigen Medien vollständig löslich sind, bieten sie eine nützliche Verabreichungsmethode für eine Vielzahl von hydrophoben Molekülen (Tabelle 1). Dazu gehören kleine Moleküle, natürliche und synthetische Medikamente, sekundäre Pflanzenstoffe, Hormone usw. Die Formulierun...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health (R37 HL-64159) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BCayman Chemical Company11636ND Formulation & Standard Preparation
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & Expansion
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformation
Baffled FlaskNew Brunswick ScientificN/AExpansion & Expression
BL21 competent E coliNew England BiolabsC2527ITransformation
Centrifuge bottlesNalgene3140-0250Expression
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Formulation
DMSOSigma Aldrich472301Standard Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND Formulation
Erlenmeyer flaskBellco BiotechnologyN/AExpansion & Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubesVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (Software)DotmaticsN/AYeast Viability Assay
Heated Sonication BathVWRN/AND Formulaton
Heating and Nitrogen moduleThermo ScientificTS-18822ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LyophilizerLabconco7755030ND Formulation
MethanolFisher ScientificA452-4ND Formulation
Nitrogen gasPraxairUN1066ND Formulation
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Expansion & Expression
Pet-22B vectorGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation & Expansion
Quartz CuvettesFisher Brand14385 928ASpectral Analysis
Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
Sodium ChlorideFisher ScientificS271Purification
Sodium Phosphate dibasicFisher ScientificS374-500Purification
Sodium Phosphate monobasicFisher ScientificBP329-500Purification
Spectra/POR Weighted ClosuresSpectrum Medical Industries132736Purification
SpectrophotometerShimadzu UV-1800220-92961-01spectral analysis
Tabletop CentrifugeBeckman Coulter366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression & Purification
Vacuum pumpGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & Purification
VortexFisher Scientific12-812ND Formulation
YeastN/ABY4741Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-DextroseBD242820Yeast Viability Assay

Referenzen

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