JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons ici la production et la caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques. Les nanodisques d’amphotéricine B sont pris comme exemple pour décrire le protocole de manière progressive.

Résumé

Le terme nanodisque fait référence à un type discret de nanoparticule composé d’un lipide formant une bicouche, d’une protéine d’échafaudage et d’un agent bioactif intégré. Les nanodisques sont organisés comme une bicouche lipidique en forme de disque dont le périmètre est circonscrit par la protéine d’échafaudage, généralement un membre de la famille des apolipoprotéines échangeables. De nombreux agents bioactifs hydrophobes ont été efficacement solubilisés dans des nanodisques par leur intégration dans le milieu hydrophobe de la bicouche lipidique de la particule, ce qui donne une population largement homogène de particules de l’ordre de 10 à 20 nm de diamètre. La formulation de nanodisques nécessite un rapport précis de composants individuels, une addition séquentielle appropriée de chaque composant, suivie d’une sonication en bain du mélange de formulation. La protéine d’échafaudage amphipathique entre spontanément en contact et réorganise le mélange bicouche dispersé formant des lipides et des agents bioactifs pour former une population discrète et homogène de particules de nanodisques. Au cours de ce processus, le mélange réactionnel passe d’un aspect opaque et trouble à un échantillon clarifié qui, lorsqu’il est entièrement optimisé, ne produit aucun précipité lors de la centrifugation. Les études de caractérisation comprennent la détermination de l’efficacité de la solubilisation des agents bioactifs, la microscopie électronique, la chromatographie par filtration sur gel, la spectroscopie d’absorbance ultraviolette visible (UV/Vis) et/ou la spectroscopie de fluorescence. Ceci est normalement suivi d’une étude de l’activité biologique utilisant des cellules ou des souris en culture. Dans le cas des nanodisques hébergeant un antibiotique (c.-à-d. l’amphotéricine B antibiotique polyène macrolide), leur capacité à inhiber la croissance de levures ou de champignons en fonction de la concentration ou du temps peut être mesurée. La relative facilité de formulation, la polyvalence en ce qui concerne les composants, la taille des particules à l’échelle nanométrique, la stabilité inhérente et la solubilité aqueuse permettent une myriade d’applications in vitro et in vivo de la technologie des nanodisques. Dans le présent article, nous décrivons une méthodologie générale pour formuler et caractériser les nanodisques contenant de l’amphotéricine B en tant qu’agent bioactif hydrophobe.

Introduction

Les lipoprotéines discoïdales naissantes de haute densité (HDL) sont des progéniteurs naturels du HDL sphérique beaucoup plus abondant présent dans le système circulatoire humain. Ces particules naissantes, également appelées pré-ß HDL, possèdent des propriétés structurelles uniques et distinctives1. En effet, plutôt que d’exister sous forme de particule sphéroïdale, les HDL naissants sont en forme de disque. Des études approfondies de caractérisation structurale sur les HDL discoïdaux naturels et reconstitués ont révélé qu’ils sont constitués d’une bicouche phospholipide dont le périmètre est circonscrit par une apolipoprotéine échangeable amphipathique (apo), telle que l’apoA-I. Dans le métabolisme des lipoprotéines humaines, les HDL naissants circulants accumulent des lipides des cellules périphériques et mûrissent en HDL sphériques dans un processus qui dépend de médiateurs protéiques clés, y compris le transporteur de cassette de liaison ATP A1 et l’acyltransférse lécithine:cholestérol2. Ce processus représente un élément essentiel de la voie de transport inverse du cholestérol qui est considérée comme protectrice contre les maladies cardiaques. Forts de ces connaissances et de la capacité de reconstituer les HDL discoïdaux, les chercheurs ont utilisé ces particules comme intervention thérapeutique pour traiter l’athérosclérose3. En substance, la perfusion de HDL reconstitué (rHDL) chez les patients favorise l’efflux de cholestérol des dépôts de plaque et le renvoie au foie pour la conversion en acides biliaires et l’excrétion du corps. Plusieurs sociétés biotechnologiques/pharmaceutiques poursuivent cette stratégie de traitement4.

Dans le même temps, la capacité de générer ces particules en laboratoire a déclenché une vague d’activités de recherche qui ont conduit à de nouvelles applications et à de nouvelles technologies. Une application importante implique l’utilisation de particules rHDL comme membrane miniature pour abriter des protéines transmembranaires dans un environnement de type natif5. À ce jour, des centaines de protéines ont été incorporées avec succès dans le rHDL discoïdal, et la recherche a démontré que ces protéines conservent à la fois la conformation native et l’activité biologique en tant que récepteurs, enzymes, transporteurs, etc. Ces particules, appelées « nanodisques », se sont également révélées se prêtant à une caractérisation structurale, souvent à haute résolution6. Cette approche des recherches sur les protéines transmembranaires est reconnue comme supérieure aux études sur les micelles ou les liposomes de détergent et, par conséquent, progresse rapidement. Il est important de reconnaître que deux méthodes distinctes ont été rapportées qui sont capables de former un rHDL. La méthode de « dialyse au cholate »13 est populaire pour les applications liées à l’incorporation de protéines transmembranaires dans la bicoucherHDL 5. Essentiellement, cette méthode de formulation consiste à mélanger un phospholipide formant une bicouche, une protéine d’échafaudage et la protéine transmembranaire d’intérêt dans un tampon contenant le détergent cholate de sodium (ou désoxycholate de sodium; masse moléculaire micelle [MW] de 4 200 Da). Le détergent solubilise efficacement les différents composants de la réaction, ce qui permet de dialyser l’échantillon contre un tampon détergent. Pendant l’étape de dialyse, lorsque le détergent est retiré de l’échantillon, un rHDL se forme spontanément. Lorsque cette approche est utilisée pour piéger une protéine transmembranaire d’intérêt, les particules de produit ont été appelées nanodisques5. Les tentatives d’utilisation de cette méthode pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes à petites molécules (MW <1 000 Da), cependant, ont été largement infructueuses. Contrairement aux protéines transmembranaires, les agents bioactifs à petites molécules sont capables de s’échapper du sac de dialyse avec le détergent, ce qui diminue considérablement leur efficacité d’incorporation dans les rHDL. Ce problème a été résolu en omettant les détergents du mélange de formulation14. Au lieu de cela, les composants sont ajoutés séquentiellement à un tampon aqueux, en commençant par la bicouche formant un lipide, formant un agent bioactif stable contenant du rHDL, appelé nanodisque. D’autres ont utilisé le rHDL pour l’incorporation et le transport d’agents d’imagerie in vivo 7. Plus récemment, des rHDL spécialisés composés d’un échafaudage d’apolipoprotéines et du glycérophospholipide anionique, la cardiolipine, ont été utilisés dans des études de liaison aux ligands. Ces particules fournissent une plate-forme pour des études de l’interaction de la cardiolipine avec divers ligands solubles dans l’eau, y compris le calcium, le cytochrome c et l’agent anticancéreux doxorubicine8.

La présente étude est axée sur la formulation de rHDL qui possèdent un agent bioactif hydrophobe incorporé de manière stable (c.-à-d. nanodisque). La capacité de ces agents à s’intégrer dans le milieu lipidique des particules discoïdales de rHDL leur confère efficacement une solubilité aqueuse. En tant que tels, les nanodisques ont le potentiel pour des applications thérapeutiques in vivo . Lors de la formulation de nanodisques, des conditions d’incubation / réaction spécifiques sont nécessaires pour incorporer avec succès des agents bioactifs hydrophobes discrets dans la particule du produit, et l’objectif de ce rapport est de fournir des informations pratiques détaillées qui peuvent être utilisées comme modèle fondamental pour la création de nouvelles particules de nanodisques pour des applications spécifiques. Ainsi, dans le contexte de ce manuscrit, les termes nanodisque et nanodisque ne sont pas interchangeables. Alors que nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour contenir une protéine transmembranaire intégrée dans sa bicouche lipidique5, le terme nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes de faible poids moléculaire (< 1 000 Da), tels que l’amphotéricine B14.

Diverses méthodes sont disponibles pour l’acquisition de protéines d’échafaudage appropriées. Il est possible d’acheter des protéines d’échafaudage auprès de fabricants [par exemple, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], mais le coût peut être un facteur limitant. Une approche privilégiée consiste à exprimer des protéines d’échafaudage recombinantes dans Escherichia coli. Des protocoles sont publiés pour l’apoA-I 99, l’apoE410 humaine, ainsi que pour la protéine d’hémolymphe d’insecte apolipophorin-III11. Pour les besoins des expériences décrites ici, le domaine N-terminal (NT) apoE4 humain recombinant (acides aminés 1-183) a été utilisé. La séquence nucléotidique codant pour l’apoE4-NT humain a été synthétisée et insérée dans un vecteur d’expression pET-22b (+) directement adjacent à la séquence de tête pelB codée par le vecteur. Cette construction conduit à l’expression d’une protéine de fusion pelB leader-apoE4-NT. Après la synthèse des protéines, la séquence de tête pelB bactérienne dirige la protéine nouvellement synthétisée vers l’espace périplasmique où la peptidase leader clive la séquence pelB. La protéine apoE4-NT résultante, sans marqueurs de séquence ni queues, échappe ensuite aux bactéries et s’accumule dans le milieude culture 11,12, simplifiant le traitement en aval.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Transformation, expression et purification du composant protéique d’échafaudage

  1. Transformation bactérienne BL21 avec plasmide contenant de l’apoE4-NT
    1. Décongeler un tube de cellules compétentes BL21 (DE3) sur de la glace pendant 10 min.
    2. Une fois que toute la glace a fondu, mélanger doucement et soigneusement pipeter 50 μL des cellules dans un tube de transformation sur de la glace.
    3. Ajouter 5 μL contenant 50 ng d’ADN plasmidique (pour la séquence, voir le tableau supplémentaire 1) au mélange cellulaire. Agitez soigneusement le tube quatre ou cinq fois pour mélanger. Ne pas vortex.
    4. Placer le mélange sur la glace pendant 30 min.
    5. Choc thermique du mélange à exactement 42 °C pendant 10 s.
    6. Placer sur la glace pendant 5 min.
    7. Introduire à la pipette 950 μL de milieu S.O.C. dans le tube à température ambiante.
    8. Placer le tube dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant 60 min avec une oscillation réglée à 250 tr/min.
    9. Bien mélanger les cellules en les effleurant et en les retournant, puis étaler 100 μL de solution cellulaire sur une plaque de sélection de bouillon de Luria + gélose de 20 ml traitée à l’ampicilline à une concentration de 0,1 mg/mL.
    10. Incuber pendant la nuit à 37 °C ou jusqu’à ce que les colonies visibles se soient développées.
  2. À l’aide d’un pipeteur électronique, transférer 25 mL de milieu NZCYM stérile dans une fiole conique stérile de 250 mL à température ambiante et ajouter l’ampicilline à une concentration finale de 0,1 mg/mL.
  3. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, transférer une colonie individuelle de la plaque de sélection contenant la souche bactérienne transformée de manière appropriée et l’ajouter directement dans le ballon contenant 25 ml de milieu NZCYM + ampicilline.
  4. Placer les 25 mL de culture de graines NZCYM dans un incubateur à agitation à 37 °C avec oscillation orbitale réglée à 250 tr/min.
    REMARQUE : Il est recommandé de cultiver cette culture de graines pendant la nuit pour atteindre une concentration bactérienne appropriée (~1,5-2,0 unités de densité optique), mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre réglé sur la longueur d’onde = 600 nm.
  5. Transférer 250 mL de milieu NZCYM stérile dans quatre flacons défroulés de 1 L et ajouter l’antibiotique ampicilline à une concentration utile de 0,1 mg/mL.
  6. Dans des conditions stériles, transférer 5 mL de culture de graines saturées dans chacune des quatre cultures de 250 mL contenant des flacons et placer dans un incubateur à agitation à 37 °C avec une oscillation orbitale réglée à 250 tr/min.
    REMARQUE: À ce stade, la culture sera appelée culture d’expansion et la croissance exponentielle sera surveillée à l’aide d’un spectrophotomètre UV1800. On laisse la croissance se poursuivre jusqu’à ce que la densité optique de culture à 600 nm (OD600) atteigne une valeur comprise entre 0,6 et 0,8.
  7. Une fois que la culture d’expansion a atteint la valeur OD600 souhaitée de 0,6-0,8, ajouter 59,6 mg d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à chaque culture de 250 ml contenant une fiole pour obtenir une concentration finale de 1 mM pour induire l’expression des protéines. À ce stade, la culture d’expansion est appelée culture d’expression. Commencer l’expression pendant une période de 5 h.
  8. À la fin de la période d’expression de 5 h, retirer les quatre flacons de l’incubateur à agiter et pipeter 125 mL dans six flacons centrifugés de 250 ml (750 ml au total).
  9. Équilibrez chaque flacon de centrifugeuse pour vous assurer que la masse totale se trouve à moins de ±0,5 mg l’un de l’autre.
    REMARQUE: Cette étape est essentielle pour assurer le fonctionnement sûr du dispositif de centrifugeuse.
  10. Préparez le dispositif de centrifugation en tournant d’abord l’interrupteur d’alimentation sur la position marche. Cliquez sur le bouton intitulé « Set/Actual » et réglez les paramètres sur « JA-14 », « 9,400 x g », 20.00 min et 4 °C à l’aide des cadrans correspondants.
  11. Chargez les six bouteilles de centrifugeuses équilibrées dans un rotor de centrifugeuse de taille appropriée et placez-les dans la centrifugeuse en veillant à ce que tous les paramètres de sécurité spécifiques soient respectés.
    REMARQUE : Continuez cette étape jusqu’à ce que toutes les cultures cellulaires bactériennes aient été centrifugées et que les surnageants aient été collectés.
  12. Filtrer le surnageant bactérien isolé à l’aide d’une filtration sous vide ou d’un appareil équivalent muni d’un filtre de 0,45 micron pour éliminer tout débris résiduel.
  13. Purification à l’héparine de la protéine d’échafaudage apoE4-NT recombinante
    REMARQUE: La procédure de purification de la colonne est effectuée à température ambiante.
    1. Équilibrer la colonne d’héparine Hi-trap en appliquant 10 volumes de colonne (50 mL) de tampon de phosphate de sodium de 10 mM, pH 7,2, et en éluant à un débit de 5 mL/min.
    2. Appliquer le milieu enrichi en apoE4-NT sur la colonne à un débit de 2,5 mL/min jusqu’à ce que tout le volume de 1 L de milieu ait été appliqué et éliminer le fluide.
    3. Lavez la colonne avec 10 volumes de colonne (50 mL) de tampon de phosphate de sodium de 10 mM, pH 7,2, et jetez l’écoulement.
    4. Éluer la protéine apoE4-NT désirée en appliquant trois volumes de colonne (15 mL) de tampon d’élution (tampon phosphate de sodium 10 mM + 1,5 M NaCl, pH 7,2) sur la colonne et recueillir l’éluat.
  14. Dialyse de l’éluat apoE4-NT
    1. Préparer une section de tubulure de dialyse (les dimensions de la tubulure de dialyse utilisée étaient de 22 cm de longueur, 12 mm de diamètre intérieur et 10 000 MWCO) en faisant tremper soigneusement dans de l’eau distillée désionisée (ddi) pendant 10 minutes.
    2. Préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (10 mM de phosphate de sodium + 150 mM de NaCl, pH 7,2) dans un bécher en plastique de 1 L ou équivalent.
    3. À l’aide d’une pince de tuyau de dialyse, serrez une extrémité du tube de dialyse trempé, en vous assurant que la pince est fixée et qu’aucun liquide ne peut s’échapper.
    4. Insérez un entonnoir de cou étroit dans l’extrémité ouverte de la tubulure de dialyse et versez les 15 mL d’éluat d’apoE4-NT dans le tube de dialyse.
      REMARQUE: Il est impératif de vérifier s’il y a des fuites à cette étape.
    5. Retirez l’entonnoir et serrez l’extrémité du tube de dialyse avec une autre pince de tube de dialyse.
    6. Placez un flotteur de dialyse en mousse sur l’une des extrémités scellées du tube de dialyse et placez le tube de dialyse assemblé dans le bécher contenant 1 L de tampon PBS.
    7. Placez une barre d’agitation magnétique dans le fond du bécher et réglez la commande d’agitation à « bas », en veillant à ce qu’un vortex ne se forme pas.
    8. Une fois la dialyse terminée, décanter le rétentat dans un tube conique de 50 ml et conserver à -20 °C.
      REMARQUE : Il est recommandé que cette dialyse soit effectuée à 4 °C pendant la nuit.

2. Formulation d’un agent bioactif contenant des nanodisques

  1. Préparation de phospholipides aliquotes
    1. Peser 5 mg d’un phospholipide approprié (par ex. dimyristoylphosphatidylcholine [DMPC]) et transférer dans un tube à essai en verre.
    2. Dissoudre les 5 mg de phospholipides en ajoutant 300 μL deCHCl3 et 100 μL deCH3OHpour un rapport total de 3:1 v/v.
    3. Évaporer le solvant organique en plaçant le tube à essai en verre sous un léger courant de gazN2 pendant 10-15 min, de sorte qu’une fine pellicule de phospholipides séchés se forme le long des parois de la partie inférieure du tube.
  2. Lyophilisation des aliquotes phospholipides
    1. Préparer les aliquotes phospholipidiques pour la lyophilisation en recouvrant l’ouverture du tube à essai en verre avec un parafilm.
    2. Perforer le parafilm à l’aide d’une aiguille de 24 G environ 10 à 15 fois.
    3. Placez les aliquotes perforées dans un récipient de lyophilisation approprié et assurez-vous que le couvercle en caoutchouc est scellé correctement.
    4. Fixez le récipient de lyophilisation au collecteur à vide situé au sommet de la machine de lyophilisation et assurez-vous que toutes les autres vannes sont bien fermées.
    5. Allumez la machine de lyophilisation en appuyant sur l’interrupteur d’alimentation et en appuyant sur le bouton d’initialisation du vide.
    6. Une fois que le système a atteint le vide total, cliquez sur le bouton d’initialisation de la réfrigération pour commencer le processus de lyophilisation.
      REMARQUE : Il est recommandé de laisser les échantillons se lyophiliser pendant la nuit.
  3. Formulation de nanodisques d’amphotéricine-B (amp-B)
    1. Pipeter 0,45 mL de PBS sur l’aliquote et le vortex phosphophilisés phospholipides lyophilisés pendant ~30 s pour disperser le lipide.
      Remarque : L’échantillon résultant apparaîtra opaque et trouble.
    2. Pipeter 50 μL d’une solution mère ampB à 20 mg/mL (20 mg d’ampB dissous dans 1 mL de diméthylsulfoxyde [DMSO], stockée à -20 °C dans un récipient ambré fermé) dans l’échantillon de phospholipides dispersés et le vortex.
      NOTA : Lors du choix d’un solvant à utiliser dans la préparation d’une solution mère de l’agent bioactif hydrophobe, les deux considérations primordiales sont 1) la solubilité de l’agent bioactif et 2) la miscibilité du solvant avec le tampon aqueux utilisé dans la formulation. Alors que le DMSO est souvent utilisé 15,16,17,18,19, le diméthylformamide 20,21 ou le tétrahydrofurane 22 ont également été utilisés avec succès 23.
    3. Pipeter 0,5 mL de protéine d’échafaudage apoE4-NT (concentration de ~4 mg/mL) dans le tube à essai en verre contenant le phospholipide dispersé et l’ampB. Le volume final de l’échantillon doit être d’environ 1 mL.
    4. Soniquer l’échantillon au bain à 24 °C jusqu’à ce que la solution se clarifie (généralement 10-15 min).
  4. Centrifugation de nanodisques
    1. Transférer la solution clarifiée ampB-nanodisque dans un tube microcentrifuge stérile de 1,7 mL.
    2. Placez le tube dans un rotor de microcentrifugation de table avec l’ajout d’un tube d’équilibrage placé directement en face.
    3. Serrez le capuchon du rotor et fermez le couvercle de la centrifugeuse.
    4. Programmez la centrifugeuse pour qu’elle tourne pendant 10 min à ~11 000 x g à l’aide des cadrans correspondants situés à l’avant de l’unité de microcentrifugeuse.
      REMARQUE: À ce stade, une pastille peut être visible. Cette pastille est constituée de phospholipides et/ou d’ampB non incorporés.
    5. Retirez le surnageant et transférez-le dans un autre tube microcentrifuge propre de 1,7 mL.
  5. Dialyse de l’échantillon ampB-nanodisque
    1. Préparer une section de tubulure de dialyse (les dimensions de la tubulure de dialyse utilisée étaient de 3 cm de longueur, 16 mm de diamètre intérieur et 10 000 MWCO) en faisant tremper soigneusement dans de l’eau DDI pendant 10 minutes.
    2. Préparer une solution tampon PBS de 1 L (phosphate de sodium 10 mM + 150 mM de NaCl, pH 7,2) dans un bécher en plastique de 1 L ou équivalent.
    3. À l’aide d’une pince de tuyau de dialyse, serrez une extrémité du tube de dialyse trempé, en vous assurant que la pince est fixée et qu’aucun liquide ne peut s’échapper.
    4. Insérez un entonnoir de cou étroit dans l’extrémité ouverte du tube de dialyse et transférez l’échantillon ampB-nanodisque dans le tube de dialyse.
    5. Retirez l’entonnoir et serrez l’extrémité du tube de dialyse avec une autre pince de tube de dialyse.
    6. Placez un flotteur de dialyse en mousse sur l’une des extrémités scellées du tube de dialyse et placez le tube de dialyse assemblé dans le bécher contenant le tampon PBS de 1 L.
    7. Placez une barre d’agitation magnétique dans le fond du bécher et réglez la commande d’agitation à « bas », en veillant à ce qu’un vortex ne se forme pas. Laisser la dialyse se poursuivre toute la nuit à 4 °C.

3. Analyse spectrale d’échantillons ampB-nanodisk

  1. Initialisation du spectrophotomètre suivie d’un blanc automatique
    1. Allumez le spectrophotomètre en actionnant l’interrupteur d’alimentation et connectez-vous à un ordinateur de support correspondant en appuyant sur le bouton intitulé « PC Control ».
    2. Sur l’ordinateur de support, ouvrez le logiciel intitulé « UVProbe 2.61 » et connectez-vous au spectrophotomètre en cliquant sur le bouton intitulé « Connecter » dans le coin inférieur gauche.
    3. Cliquez sur le bouton intitulé Spectrum dans la barre d’outils supérieure du logiciel UVProbe.
    4. Cliquez sur le bouton intitulé Méthode dans la barre d’outils supérieure.
    5. Cliquez sur l’onglet Mesure et entrez « 500 » dans la zone de texte Début située sous « Gamme de longueurs d’onde (nm) » et « 300 » dans la zone de texte « Fin ».
    6. Cliquez sur le menu déroulant à côté de l’onglet intitulé Vitesse d’analyse et définissez-le sur Moyen.
    7. Préparer un blanc d’échantillon en transférant 1 ml de DMSO dans deux cuvettes de quartz (QS 1.000).
    8. Chargez les deux cuvettes dans les ports d’échantillonnage respectifs du spectrophotomètre, cliquez sur Autoblank et enregistrez un spectre de 300 à 500 nm en cliquant sur Démarrer dans le coin inférieur gauche.
  2. Préparation et analyse spectrale de l’étalon ampB
    1. Préparer 20 μg/mL ampB étalon en retirant la cuvette de l’orifice d’échantillonnage avant et en ajoutant 20 μL d’une solution mère ampB de 1 mg/mL (20 μg d’ampB au total).
    2. Rechargez la cuvette dans l’orifice d’échantillonnage du spectrophotomètre et cliquez sur Démarrer pour enregistrer l’absorbance de l’échantillon.
    3. Retirez la cuvette de l’orifice d’échantillonnage et décantez le contenu liquide dans un conteneur à déchets étiqueté de manière appropriée.
    4. Rincer soigneusement la cuvette avec trois lavages à l’eau désionisée suivis de trois lavages à l’éthanol à 70%.
  3. Préparation et analyse spectrale d’un échantillon ampB-nanodisque perturbé
    1. Préparer un échantillon de nanodisque ampB perturbé (contenant 20 μg/mL sous forme d’ampB) en pipetant 20 μL d’un stock de nanodisque ampB de 1 mg/mL dans 1 mL de DMSO. Incuber pendant au moins 1 min avant d’enregistrer le spectre.
    2. Chargez la cuvette dans l’orifice d’échantillonnage avant du spectrophotomètre et cliquez sur Démarrer pour enregistrer l’absorbance de l’échantillon.
  4. Préparation et analyse spectrale d’un blanc tampon PBS
    1. Préparer un blanc tampon PBS en transférant 1 mL de tampon PBS dans deux cuvettes de quartz (QS 1.000).
    2. Chargez les cuvettes dans les ports d’échantillonnage respectifs du spectrophotomètre, cliquez sur Autoblank et enregistrez le spectre de 300 à 500 nm.
  5. Préparation et analyse spectrale d’un échantillon ampB-nanodisque non perturbé
    1. Préparer un échantillon de nanodisque ampB non perturbé (contenant 20 μg/mL en ampB) en retirant la cuvette de l’orifice d’échantillonnage avant et en introduisant 20 μL d’un échantillon ampB-nanodisque de 1 mg/mL dans le tampon PBS.
    2. Rechargez la cuvette dans le port d’échantillonnage du spectrophotomètre, cliquez sur Démarrer et enregistrez le spectre de l’échantillon.
      REMARQUE : Tous les déchets chimiques doivent être éliminés dans un conteneur à déchets étiqueté de manière appropriée conformément aux directives acceptées.

4. Analyse de viabilité de la levure

NOTE: Des tests de viabilité de la levure ont été effectués afin d’évaluer l’activité biologique de l’ampB et de déterminer si le processus de formulation ou d’incorporation dans les nanodisques affectait son activité d’inhibition de la croissance de la levure.

  1. Formuler deux échantillons ampB-nanodisques (volume final = 1 mL) pour contenir 1 mg d’ampB par 5 mg de DMPC et 0,1 mg d’ampB par 5 mg de DMPC en suivant la méthode décrite précédemment (2.3-2.4.1).
    REMARQUE : Pour fabriquer un ampB de 1 mg/mL et 0,1 mg/mL par 5 mg de DMPC, pipeter 50 μL et 5 μL, respectivement, d’un ampB de 20 mg/mL en DMSO dans chaque flacon d’échantillon.
  2. Préparation d’une culture de levure saturée
    1. Transférer 25 mL de milieu stérile d’extrait de levure-peptone-dextrose (YPD) dans un tube conique stérile de 50 mL.
    2. Utiliser une boucle d’inoculation stérile pour transférer une seule colonie de Saccharomyces cerevisiae (BY4741) dans le milieu YPD de 25 mL.
    3. Culture de la levure dans un incubateur à agitation réglé à 30 °C, avec une oscillation réglée à 200 tr/min pendant 18 h.
  3. Préparation d’échantillons individuels d’inhibition de la croissance
    1. Transférer 5 mL de milieu YPD stérile dans 30 tubes de culture stériles de 13 mL.
    2. Traiter trois ensembles de tubes de culture en ajoutant 20, 10 et 5 μL de l’échantillon ampB-nanodisque de 1 mg/mL, représentant respectivement 20, 10 et 5 μg d’ampB.
    3. Traiter trois ensembles de tubes de culture en ajoutant 20, 10 et 5 μl de l’échantillon ampB-nanodisque de 0,1 mg/mL, représentant respectivement 2, 1 et 0,5 μg d’ampB.
    4. Traiter quatre ensembles de tubes de culture en ajoutant 20 μL de PBS, DMSO, rHDL de contrôle (sans ampB) ou 20 μg d’ampB dans du DMSO.
      REMARQUE : Chaque jeu de tubes de culture représente une réplique indépendante. Par conséquent, en suivant cette méthode, on obtient une valeur globale n de n = 3.
  4. Initialisation du test de viabilité de la levure
    1. Initier l’expérience en inoculant à chaque échantillon 100 μL (2% vol/vol) de la culture de levure saturée
    2. Culture de la levure à l’aide d’un incubateur à agitation réglé à 30 °C, avec une oscillation réglée à 200 tr/min pendant 18 h maximum.
  5. Mesures de viabilité de la levure
    1. Allumez le spectrophotomètre en actionnant l’interrupteur d’alimentation, puis cliquez sur le bouton intitulé Aller à WL et définissez la valeur sur 600 nm.
    2. Transférer 1 mL de milieu YPD stérile dans deux cuvettes en plastique, charger dans les orifices d’échantillonnage respectifs du spectrophotomètre, puis cliquer sur Autoblank.
    3. Transférer 1 mL de chaque échantillon dans une cuvette en plastique, en veillant à changer de cuvette à chaque fois et charger la cuvette dans le port d’échantillon avant du spectrophotomètre.
    4. Mesurer et enregistrer la densité optique de chaque échantillon à 600 nm et jeter chaque cuvette épuisée dans un conteneur à déchets présentant un risque biologique correctement étiqueté.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Procédé de formulation de nanodisques d’agent bioactif
Dans la procédure de formulation ampB-nanodisque décrite, la réaction est considérée comme terminée lorsque l’aspect de l’échantillon passe de trouble à clair (Figure 1). Ce changement indique que des nanodisques se sont formés et que l’agent bioactif a été solubilisé. Souvent, les agents bioactifs absorbent la lumière dans la région de longueur d’onde visible (par exemple, ampB, curcumine, l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

La formulation d’un agent bioactif contenant des nanodisques fournit une méthode pratique pour solubiliser des composés hydrophobes autrement insolubles. Étant donné que les nanodisques d’agents bioactifs du produit sont entièrement solubles dans les milieux aqueux, ils constituent une méthode d’administration utile pour un large éventail de molécules hydrophobes (tableau 1). Il s’agit notamment des petites molécules, des drogues naturelles et synthétiques, des phytonutriments, des horm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (R37 HL-64159).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BCayman Chemical Company11636ND Formulation & Standard Preparation
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & Expansion
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformation
Baffled FlaskNew Brunswick ScientificN/AExpansion & Expression
BL21 competent E coliNew England BiolabsC2527ITransformation
Centrifuge bottlesNalgene3140-0250Expression
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Formulation
DMSOSigma Aldrich472301Standard Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND Formulation
Erlenmeyer flaskBellco BiotechnologyN/AExpansion & Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubesVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (Software)DotmaticsN/AYeast Viability Assay
Heated Sonication BathVWRN/AND Formulaton
Heating and Nitrogen moduleThermo ScientificTS-18822ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LyophilizerLabconco7755030ND Formulation
MethanolFisher ScientificA452-4ND Formulation
Nitrogen gasPraxairUN1066ND Formulation
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Expansion & Expression
Pet-22B vectorGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation & Expansion
Quartz CuvettesFisher Brand14385 928ASpectral Analysis
Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
Sodium ChlorideFisher ScientificS271Purification
Sodium Phosphate dibasicFisher ScientificS374-500Purification
Sodium Phosphate monobasicFisher ScientificBP329-500Purification
Spectra/POR Weighted ClosuresSpectrum Medical Industries132736Purification
SpectrophotometerShimadzu UV-1800220-92961-01spectral analysis
Tabletop CentrifugeBeckman Coulter366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression & Purification
Vacuum pumpGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & Purification
VortexFisher Scientific12-812ND Formulation
YeastN/ABY4741Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-DextroseBD242820Yeast Viability Assay

Références

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119(2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704(2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195(2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454(2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022(2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777(2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065(2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28(2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66(2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722(2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617(2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Ce mois ci dans JoVEnum ro 193nanodisquesamphot ricine Bphospholipideapolipoprot inelipoprot ine de haute densit reconstitu eagent bioactif

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.