JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Özet

Nanodisk terimi, çift katmanlı bir lipit, bir iskele proteini ve entegre bir biyoaktif ajandan oluşan ayrı bir nanopartikül tipini ifade eder. Nanodiskler, çevresi genellikle değiştirilebilir apolipoprotein ailesinin bir üyesi olan iskele proteini tarafından çevrelenen disk şeklinde bir lipit çift katmanı olarak düzenlenir. Çok sayıda hidrofobik biyoaktif ajan, parçacığın lipit çift katmanının hidrofobik ortamına entegrasyonlarıyla nanodisklerde verimli bir şekilde çözünür ve çapı 10-20 nm aralığında büyük ölçüde homojen bir parçacık popülasyonu elde edilir. Nanodisklerin formülasyonu, bireysel bileşenlerin kesin bir oranını, her bir bileşenin uygun bir sıralı ilavesini ve ardından formülasyon karışımının banyo sonikasyonunu gerektirir. Amfipatik iskele proteini, ayrık, homojen bir nanodisk parçacıkları popülasyonu oluşturmak için lipit / biyoaktif ajan karışımı oluşturan dağınık çift katmanlı ile kendiliğinden temas eder ve yeniden düzenler. Bu proses sırasında, reaksiyon karışımı opak, bulanık bir görünümden, tamamen optimize edildiğinde santrifüjleme sırasında çökelti vermeyen berraklaştırılmış bir numuneye geçer. Karakterizasyon çalışmaları, biyoaktif madde çözünürlük verimliliği, elektron mikroskobu, jel filtrasyon kromatografisi, ultraviyole görünür (UV / Vis) absorbans spektroskopisi ve / veya floresan spektroskopisinin belirlenmesini içerir. Bunu normalde kültürlenmiş hücreler veya fareler kullanılarak biyolojik aktivitenin araştırılması izler. Bir antibiyotik barındıran nanodiskler (yani, makrolid polien antibiyotik amfoterisin B) durumunda, maya veya mantarların büyümesini konsantrasyon veya zamanın bir fonksiyonu olarak inhibe etme yetenekleri ölçülebilir. Formülasyonun göreceli kolaylığı, bileşen parçalarına göre çok yönlülük, nano ölçekli parçacık boyutu, doğal stabilite ve sulu çözünürlük, nanodisk teknolojisinin sayısız in vitro ve in vivo uygulamasına izin verir. Bu makalede, hidrofobik biyoaktif ajan olarak amfoterisin B içeren nanodiskleri formüle etmek ve karakterize etmek için genel bir metodoloji açıklanmaktadır.

Giriş

Yeni ortaya çıkan diskoidal yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL'ler), insan dolaşım sisteminde bulunan çok daha bol küresel HDL'nin doğal olarak oluşan progenitörleridir. Pre-ß HDL olarak da adlandırılan bu yeni ortaya çıkan parçacıklar, benzersiz ve ayırt edici yapısal özelliklere sahiptir1. Aslında, küresel bir parçacık olarak var olmak yerine, yeni ortaya çıkan HDL'ler disk şeklindedir. Doğal ve yeniden yapılandırılmış diskoidal HDL'ler üzerine yapılan kapsamlı yapısal karakterizasyon çalışmaları, çevresi apoA-I gibi bir amfipatik değiştirilebilir apolipoprotein (apo) ile çevrelenmiş bir fosfolipid çift katmandan oluştuğunu ortaya koymuştur. İnsan lipoprotein metabolizmasında, dolaşımdaki yeni ortaya çıkan HDL'ler, periferik hücrelerden lipitler tahakkuk ettirir ve ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı A1 ve lesitin: kolesterol asiltransferse2 dahil olmak üzere anahtar protein aracılarına bağlı bir süreçte küresel HDL'lere olgunlaşır. Bu süreç, kalp hastalığına karşı koruyucu olduğu düşünülen ters kolesterol taşıma yolunun kritik bir bileşenini temsil eder. Bu bilgi ve diskoidal HDL'leri yeniden oluşturma yeteneği ile donanmış olan araştırmacılar, bu parçacıkları aterosklerozu tedavi etmek için terapötik bir müdahale olarak kullandılar3. Temel olarak, yeniden yapılandırılmış HDL'nin (rHDL) hastalara infüzyonu, plak birikintilerinden kolesterol efflüksünü teşvik eder ve safra asitlerine dönüşüm ve vücuttan atılım için karaciğere geri döndürür. Birçok biyoteknoloji/ilaç şirketi bu tedavi stratejisini izlemektedir4.

Aynı zamanda, bu parçacıkları laboratuvarda üretme yeteneği, yeni uygulamalara ve yeni teknolojilere yol açan bir araştırma faaliyetleri telaşını tetiklemiştir. Öne çıkan bir uygulama, rHDL parçacıklarının, transmembran proteinlerini doğal benzeri bir ortamda barındırmak için minyatür bir membran olarak kullanılmasını içerir5. Bugüne kadar, yüzlerce protein diskoidal rHDL'ye başarıyla dahil edilmiştir ve araştırmalar, bu proteinlerin reseptörler, enzimler, taşıyıcılar vb. Olarak hem doğal konformasyonu hem de biyolojik aktiviteyi koruduğunu göstermiştir. "Nanodiskler" olarak adlandırılan bu parçacıkların, genellikle yüksek çözünürlükte6'da yapısal karakterizasyona uygun olduğu gösterilmiştir. Transmembran proteinlerinin araştırılmasına yönelik bu yaklaşım, deterjan miselleri veya lipozomlarla yapılan çalışmalardan daha üstün olarak kabul edilmektedir ve sonuç olarak hızla ilerlemektedir. Bir rHDL oluşturabilen iki farklı yöntemin bildirildiğini bilmek önemlidir. "Kolat diyalizi" yöntemi13 , transmembran proteinlerinin rHDL çift katmanlı5'e dahil edilmesiyle ilgili uygulamalar için popülerdir. Temel olarak, bu formülasyon yöntemi, fosfolipit oluşturan bir çift katmanlı, bir iskele proteini ve ilgilenilen transmembran proteininin, deterjan sodyum kolatı (veya sodyum deoksikolat; misel moleküler ağırlığı [MW] 4.200 Da) içeren bir tamponda karıştırılmasını içerir. Deterjan, farklı reaksiyon bileşenlerini etkili bir şekilde çözündürür ve numunenin deterjan içermeyen tamponlara karşı diyalize edilmesine izin verir. Diyaliz adımı sırasında, deterjan numuneden çıkarılırken, kendiliğinden bir rHDL oluşur. Bu yaklaşım, ilgilenilen bir transmembran proteinini yakalamak için kullanıldığında, ürün parçacıkları nanodiskler5 olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte, küçük moleküllü hidrofobik biyoaktif ajanları (MW <1.000 Da) dahil etmek için bu yöntemi kullanma girişimleri büyük ölçüde başarısız olmuştur. Transmembran proteinlerinin aksine, küçük moleküllü biyoaktif ajanlar, deterjanla birlikte diyaliz torbasından kaçabilir, bu da rHDL'lere dahil edilme verimliliklerini büyük ölçüde azaltır. Bu sorun, deterjanların formülasyon karışımı14'ten çıkarılmasıyla çözüldü. Bunun yerine, bileşenler sulu bir tampona sırayla eklenir, lipit oluşturan çift katmandan başlayarak, nanodisk olarak adlandırılan rHDL içeren kararlı bir biyoaktif ajan oluşturur. Diğerleri, in vivo görüntüleme ajanlarının dahil edilmesi ve taşınması için rHDL'yi kullanmıştır7. Daha yakın zamanlarda, ligand bağlama çalışmalarında bir apolipoprotein iskelesi ve anyonik gliserofosfolipid, kardiyolipinden oluşan özel rHDL kullanılmıştır. Bu parçacıklar, kardiyolipinin kalsiyum, sitokrom c ve antikanser ajanı doksorubisin8 dahil olmak üzere suda çözünür çeşitli ligandlarla etkileşiminin incelenmesi için bir platform sağlar.

Bu çalışmanın odak noktası, istikrarlı bir şekilde dahil edilmiş hidrofobik biyoaktif ajana (yani nanodisk) sahip olan rHDL'nin formülasyonu üzerinedir. Bu ajanların diskoidal rHDL partiküllerinin lipit ortamına entegre olma yeteneği, onlara etkili bir şekilde sulu çözünürlük kazandırır. Bu nedenle, nanodiskler in vivo terapötik uygulamalar için potansiyele sahiptir. Nanodiskleri formüle ederken, ayrık hidrofobik biyoaktif ajanları ürün parçacığına başarılı bir şekilde dahil etmek için spesifik inkübasyon / reaksiyon koşulları gereklidir ve bu raporun amacı, belirli uygulamalar için yeni nanodisk parçacıkları oluşturmak için temel bir şablon olarak kullanılabilecek ayrıntılı pratik bilgiler sağlamaktır. Bu nedenle, bu makale bağlamında, nanodisk ve nanodisk terimleri birbirinin yerine kullanılamaz. Nanodisk, lipit çift katmanlı5'e gömülü bir transmembran proteini içerecek şekilde formüle edilmiş bir rHDL'yi ifade ederken, nanodisk terimi, amfoterisin B14 gibi düşük moleküler ağırlıklı (< 1.000 Da) hidrofobik biyoaktif ajanları içerecek şekilde formüle edilmiş bir rHDL'yi ifade eder.

Uygun iskele proteinlerinin elde edilmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. İskele proteinlerini üreticilerden [örneğin apoA-I (SRP4693) veya apoE4 (A3234)] satın almak mümkündür, ancak maliyet sınırlayıcı bir faktör olabilir. Tercih edilen bir yaklaşım, Escherichia coli'deki rekombinant iskele proteinlerini eksprese etmektir. İnsan apoA-I9, apoE410 ve böcek hemolenf proteini apolipophorin-III11 için protokoller yayınlanmıştır. Burada açıklanan deneylerin amacı doğrultusunda, rekombinant insan apoE4 N-terminal (NT) alanı (amino asitler 1-183) kullanılmıştır. İnsan apoE4-NT'yi kodlayan nükleotid dizisi sentezlendi ve vektör kodlu pelB lider dizisine doğrudan bitişik bir pET-22b (+) ekspresyon vektörüne yerleştirildi. Bu yapı bir pelB lider dizisi-apoE4-NT füzyon proteininin ekspresyonuna yol açar. Protein sentezini takiben, bakteriyel pelB lider dizisi, yeni sentezlenen proteini, lider peptidazın pelB dizisini parçaladığı periplazmik boşluğa yönlendirir. Ortaya çıkan apoE4-NT proteini, hiçbir dizi etiketi veya kuyruğu olmadan, daha sonra bakterilerden kaçar ve11,12 kültür ortamında birikerek aşağı akış işlemeyi basitleştirir.

Protokol

1. İskele protein bileşeninin dönüşümü, ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Plazmid içeren apoE4-NT ile BL21 bakteriyel transformasyonu
    1. BL21 (DE3) yetkin hücrelerden oluşan bir tüpü buz üzerinde 10 dakika boyunca çözün.
    2. Tüm buzlar eridikten sonra, 50 μL hücreyi buz üzerindeki bir dönüşüm tüpüne nazikçe ve dikkatlice karıştırın.
    3. Hücre karışımına 50 ng plazmid DNA'sı içeren 5 μL ekleyin (dizi için Ek Tablo 1'e bakınız). Karıştırmak için tüpü dört veya beş kez dikkatlice hareket ettirin. Vorteks yapmayın.
    4. Karışımı 30 dakika boyunca buz üzerine koyun.
    5. Isı, karışımı 10 s boyunca tam olarak 42 ° C'de şoklayın.
    6. 5 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
    7. 950 μL S.O.C. pipetini oda sıcaklığında tüpe yerleştirin.
    8. Tüpü, salınımı 250 rpm'ye ayarlanmış olarak 60 dakika boyunca 37 ° C çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin.
    9. Hücreleri hafifçe vurarak ve ters çevirerek iyice karıştırın, ardından 100 μL hücre çözeltisini, 0.1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda ampisilin ile muamele edilmiş 20 mL'lik bir Luria Suyu + Agar seçim plakasına yayın.
    10. Gece boyunca 37 ° C'de veya görünür koloniler büyüyene kadar inkübe edin.
  2. Elektronik pipetleyici kullanarak, 25 mL steril, NZCYM ortamını oda sıcaklığında steril 250 mL konik şişeye aktarın ve 0,1 mg/mL'lik son çalışma konsantrasyonuna ampisilin ekleyin.
  3. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, uygun şekilde dönüştürülmüş bakteri suşunu içeren seçim plakasından bir bireysel koloni aktarın ve doğrudan 25 mL NZCYM ortamı + ampisilin içeren şişeye ekleyin.
  4. 25 mL'lik NZCYM tohum kültürü şişesini, orbital salınımı 250 rpm'ye ayarlanmış 37 ° C çalkalayıcı bir inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Bu tohum kültürünün, dalga boyu = 600 nm olarak ayarlanmış bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen uygun bir bakteri konsantrasyonuna (~ 1.5-2.0 optik yoğunluk birimleri) ulaşmak için gece boyunca yetiştirilmesi önerilir.
  5. 250 mL steril NZCYM ortamını dört adet 1 L şaşkın şişeye aktarın ve 0.1 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna ampisilin antibiyotik ekleyin.
  6. Steril koşullar altında, şişe içeren dört 250 mL kültürün her birine 5 mL doymuş tohum kültürü aktarın ve orbital salınımı 250 rpm'ye ayarlanmış 37 ° C çalkalayıcı bir inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Bu noktada, kültür bir genleşme kültürü olarak adlandırılacak ve üstel büyüme bir UV1800 spektrofotometresi kullanılarak izlenecektir. 600 nm'deki (OD600) kültür optik yoğunluğu 0.6-0.8 arasında bir değere ulaşana kadar büyümenin devam etmesine izin verilir.
  7. Genleşme kültürü istenen OD600 değeri olan 0.6-0.8'e ulaştığında, protein ekspresyonunu indüklemek için 1 mM'lik nihai bir konsantrasyon için şişe içeren her 250 ml'lik kültüre 59.6 mg izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin. Bu noktada genişleme kültürü, kültür ifadesi olarak adlandırılmaktadır. 5 saatlik bir süre için ifadeye başlayın.
  8. 5 saatlik ekspresyon süresinin sonunda, dört şişeyi çalkalayan inkübatörden çıkarın ve 125 mL'lik pipet'i altı adet 250 ml'lik santrifüj şişesine (toplam 750 mL) yerleştirin.
  9. Toplam kütlenin birbirinden ±0,5 mg uzakta olduğundan emin olmak için her bir santrifüj şişesini dengeleyin.
    NOT: Bu adım, santrifüj cihazının güvenli çalışmasını sağlamak için gereklidir.
  10. Önce güç düğmesini açık konuma getirerek santrifüj cihazını hazırlayın. "Set/Actual" etiketli düğmeye tıklayın ve ilgili kadranları kullanarak parametreleri "JA-14", "9,400 x g", 20,00 min ve 4 °C olarak ayarlayın.
  11. Altı dengeli santrifüj şişesini uygun boyutta bir santrifüj rotoruna yükleyin ve belirli güvenlik parametrelerinin takip edildiğinden emin olmak için santrifüje yerleştirin.
    NOT: Tüm bakteri hücre kültürü santrifüj edilene ve süpernatanlar toplanana kadar bu adıma devam edin.
  12. İzole edilmiş bakteri süpernatantını, artık kalıntıları gidermek için bir vakum filtrasyonu veya 0,45 mikron filtre ile donatılmış eşdeğer bir aparat ile filtreleyin.
  13. Rekombinant apoE4-NT iskele proteininin heparin saflaştırılması
    NOT: Kolon saflaştırma prosedürü oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
    1. Hi-trap Heparin kolonunu, 10 sütun hacmi (50 mL) 10 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.2 uygulayarak ve 5 mL/dak hızında salınım yaparak dengeleyin.
    2. ApoE4-NT ile zenginleştirilmiş ortamı, 1 L hacimli ortamın tamamı uygulanana kadar kolona 2,5 mL/dak hızında uygulayın ve akışı atın.
    3. Kolonu 10 sütun hacmi (50 mL) 10 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.2 ile yıkayın ve akışı atın.
    4. Kolona üç sütun hacmi (15 mL) elüsyon tamponu (10 mM sodyum fosfat tamponu + 1.5 M NaCl, pH 7.2) uygulayarak istenen apoE4-NT proteinini elute edin ve elüatı toplayın.
  14. apoE4-NT diyalizi elüat
    1. Diyaliz tüpünün bir bölümünü (kullanılan diyaliz tüpünün boyutları 22 cm uzunluğunda, 12 mm iç çapı ve 10.000 MWCO idi) damıtılmış deiyonize (ddi) suda 10 dakika boyunca iyice ıslatarak hazırlayın.
    2. 1 L plastik beherde veya eşdeğeri içinde 1 L fosfat tamponlu salin (PBS) (10 mM sodyum fosfat + 150 mM NaCl, pH 7.2) hazırlayın.
    3. Bir diyaliz tüpü kelepçesi kullanarak, ıslatılmış diyaliz tüpünün bir ucunu kelepçeleyin, kelepçenin sabitlenmesini ve hiçbir sıvının kaçamamasını sağlayın.
    4. Diyaliz tüpünün açık ucuna dar bir boyun hunisi yerleştirin ve 15 mL apoE4-NT elüatını diyaliz tüpüne dökün.
      NOT: Bu adımda herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol etmek zorunludur.
    5. Huni çıkarın ve diyaliz tüpünün ucunu başka bir diyaliz tüpü kelepçesi ile kelepçeleyin.
    6. Diyaliz tüpünün kapalı uçlarından birine bir köpük diyaliz şamandırası yerleştirin ve monte edilmiş diyaliz tüpünü 1 L PBS tamponu içeren beherin içine yerleştirin.
    7. Beherin altına manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırma kontrolünü "düşük" olarak ayarlayarak bir girdap oluşmamasını sağlayın.
    8. Diyaliz bittikten sonra, retentatı 50 mL'lik bir konik tüpe boşaltın ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu diyalizin gece boyunca 4 °C'de yapılması önerilir.

2. Nanodiskler içeren biyoaktif ajanın formülasyonu

  1. Fosfolipid aliquot hazırlanması
    1. 5 mg uygun fosfolipit (örneğin, dimiristoylphosphatidylcholine [DMPC]) tartın ve bir cam test tüpüne aktarın.
    2. Toplam 3:1 v/v oranında 300 μL CHCl 3 ve 100 μL CH3 OH ekleyerek 5 mg fosfolipidi çözün.
    3. Cam test tüpünü 10-15 dakika boyunca yumuşak birN2 gaz akışının altına yerleştirerek organik çözücüyü buharlaştırın, böylece tüpün alt kısmının duvarları boyunca ince bir kurutulmuş fosfolipit filmi oluşur.
  2. Fosfolipid alikotlarının liyofilizasyonu
    1. Cam test tüpü açıklığını parafilm ile kaplayarak liyofilizasyon için fosfolipid alikotları hazırlayın.
    2. Parafilmi 24 G'lik bir iğne kullanarak yaklaşık 10-15 kez delin.
    3. Delikli alikotları uygun bir liyofilizasyon kabına yerleştirin ve kauçuk kapağın doğru şekilde kapatıldığından emin olun.
    4. Liyofilizasyon kabını, liyofilizasyon makinesinin üst kısmında bulunan vakum manifolduna takın ve diğer tüm vanaların sıkıca kapatıldığından emin olun.
    5. Güç anahtarını çevirerek ve vakum başlatma düğmesine basarak liyofilizasyon makinesini açın.
    6. Sistem toplam vakuma ulaştıktan sonra, dondurarak kurutma prosesine başlamak için soğutma başlatma düğmesine tıklayın.
      NOT: Numunelerin gece boyunca liyofilize olmasına izin verilmesi önerilir.
  3. Amfoterisin-B (amp-B) nanodisklerinin formülasyonu
    1. Lipidi dağıtmak için liyofilize fosfolipid aliquot ve vortekse 0.45 mL PBS pipet verin.
      NOT: Elde edilen örnek opak ve bulanık görünecektir.
    2. Pipet 50 μL 20 mg/mL stok ampB çözeltisi (20 mg ampB, 1 mL dimetil sülfoksit [DMSO] içinde çözülür, kapalı bir kehribar kapta -20 °C'de depolanır) dağılmış fosfolipid numunesine ve vortekse yerleştirin.
      NOT: Hidrofobik biyoaktif maddenin stok çözeltisinin hazırlanmasında kullanılacak bir çözücü seçerken, iki kapsayıcı husus 1) biyoaktif maddenin çözünürlüğü ve 2) çözücünün formülasyonda kullanılan sulu tampon ile karışabilirliğidir. DMSO sıklıkla 15,16,17,18,19 kullanılırken, dimetilformamid 20,21 veya tetrahidrofuran 22 de başarıyla kullanılmıştır 23.
    3. Pipet, 0.5 mL apoE4-NT iskele proteini (konsantrasyon ~4 mg/mL), dispersiyon fosfolipid ve ampB içeren cam test tüpüne ekleyin. Numunenin son hacmi yaklaşık 1 mL olmalıdır.
    4. Banyo, çözelti netleşene kadar numuneyi 24 ° C'de sonikleştirin (genellikle 10-15 dakika).
  4. Nanodisk santrifüjleme
    1. Arıtılmış ampB-nanodisk çözeltisini steril bir 1,7 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın.
    2. Tüpü, doğrudan karşısına yerleştirilmiş bir denge tüpü ilavesiyle masa üstü mikro santrifüj rotoruna yerleştirin.
    3. Rotor kapağını sıkın ve santrifüj kapağını kapatın.
    4. Mikro santrifüj ünitesinin ön tarafında bulunan ilgili kadranları kullanarak santrifüjü ~ 11.000 x g'de 10 dakika boyunca dönecek şekilde programlayın.
      NOT: Bu noktada, bir pelet görülebilir. Bu pelet dahil edilmemiş fosfolipid ve / veya ampB'den oluşur.
    5. Süpernatantı çıkarın ve başka bir temiz 1,7 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın.
  5. ampB-nanodisk örneğinin diyalizi
    1. Diyaliz tüpünün bir bölümünü (kullanılan diyaliz tüpünün boyutları 3 cm uzunluğunda, 16 mm iç çapı ve 10.000 MWCO idi) 10 dakika boyunca ddi suyuna iyice batırarak hazırlayın.
    2. 1 L plastik beher veya eşdeğeri içinde 1 L PBS tampon çözeltisi (10 mM sodyum fosfat + 150 mM NaCl, pH 7.2) hazırlayın.
    3. Bir diyaliz tüpü kelepçesi kullanarak, ıslatılmış diyaliz tüpünün bir ucunu kelepçeleyin, kelepçenin sabitlenmesini ve hiçbir sıvının kaçamamasını sağlayın.
    4. Diyaliz tüpünün açık ucuna dar bir boyun hunisi yerleştirin ve ampB-nanodisk örneğini diyaliz tüpüne aktarın.
    5. Huni çıkarın ve diyaliz tüpünün ucunu başka bir diyaliz tüpü kelepçesi ile kelepçeleyin.
    6. Diyaliz tüpünün kapalı uçlarından birine bir köpük diyaliz şamandırası yerleştirin ve monte edilmiş diyaliz tüpünü 1 L PBS tamponunu içeren beherin içine yerleştirin.
    7. Beherin altına manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırma kontrolünü "düşük" olarak ayarlayarak bir girdap oluşmamasını sağlayın. Diyalizin gece boyunca 4 °C'de devam etmesine izin verin.

3. ampB-nanodisk örneklerinin spektral analizi

  1. Spektrofotometre başlatma ve ardından otomatik boşluk
    1. Güç düğmesini çevirerek spektrofotometreyi açın ve "PC Kontrolü" etiketli düğmeye basarak ilgili bir destek bilgisayarına bağlanın.
    2. Destek bilgisayarında, "UVProbe 2.61" etiketli yazılımı açın ve sol alt köşedeki "Bağlan" etiketli düğmeye tıklayarak spektrofotometreye bağlanın.
    3. UVProbe yazılımındaki üst araç çubuğundaki Spectrum etiketli düğmeye tıklayın.
    4. Üst araç çubuğundaki Yöntem etiketli düğmeyi tıklatın.
    5. Ölçüm sekmesine tıklayın ve "Dalga Boyu Aralığı (nm)" altında bulunan Başlat metin kutusuna "500" ve "Son" metin kutusuna "300" yazın.
    6. Tarama Hızı etiketli sekmenin yanındaki açılır menüyü tıklayın ve Orta olarak ayarlayın.
    7. 1 ml DMSO'yu iki kuvars küvete (QS 1.000) aktararak boş bir numune hazırlayın.
    8. Her iki küveti de spektrofotometrenin ilgili örnek bağlantı noktalarına yükleyin, Otomatik Boşal'a tıklayın ve sol alt köşedeki Başlat'a tıklayarak 300-500 nm arasında bir spektrum kaydedin.
  2. ampB standardının hazırlanması ve spektral analizi
    1. Küveti ön numune portundan çıkararak ve 20 μL 1 mg/mL ampB stok çözeltisinden 20 μL (toplam 20 μg ampB) ekleyerek 20 μg/mL ampB standardı hazırlayın.
    2. Küveti spektrofotometrenin numune portuna geri yükleyin ve numune emilimini kaydetmek için Başlat'a tıklayın.
    3. Küveti numune portundan çıkarın ve sıvı içeriğini uygun şekilde etiketlenmiş bir atık kabına boşaltın.
    4. Küveti üç yıkama deiyonize su ile iyice durulayın, ardından %70 etanol ile üç yıkama yapın.
  3. Bozulmuş ampB-nanodisk örneğinin hazırlanması ve spektral analizi
    1. 1 mg/mL ampB-nanodisk stoğunun 20 μL'sini 1 mL DMSO'ya pipetleyerek bozulmuş bir ampB-nanodisk örneği (ampB olarak 20 μg/mL içeren) hazırlayın. Spektrumu kaydetmeden önce en az 1 dakika inkübe edin.
    2. Küveti spektrofotometrenin ön numune portuna yükleyin ve numune emilimini kaydetmek için Başlat'a tıklayın.
  4. PBS tampon boşluğunun hazırlanması ve spektral analizi
    1. 1 mL PBS tamponunu iki kuvars küvete (QS 1.000) aktararak boş bir PBS tamponu hazırlayın.
    2. Küvetleri spektrofotometrenin ilgili numune portlarına yükleyin, Autoblank (Otomatik Boşal) seçeneğine tıklayın ve spektrumu 300-500 nm arasında kaydedin.
  5. Bozulmamış bir ampB-nanodisk örneğinin hazırlanması ve spektral analizi
    1. Küvetin ön numune portundan çıkarılması ve PBS tamponuna 1 mg/mL ampB-nanodisk numunesinin 20 μL'sini sokarak bozulmamış bir ampB-nanodisk numunesi (ampB olarak 20 μg/mL içeren) hazırlayın.
    2. Küveti spektrofotometrenin numune portuna geri yükleyin, Başlat'a tıklayın ve numune spektrumunu kaydedin.
      NOT: Tüm kimyasal atıklar, kabul edilen kurallara uygun olarak etiketlenmiş bir atık kabına atılmalıdır.

4. Maya canlılık testi analizi

NOT: Maya canlılık testleri, ampB'nin biyolojik aktivitesini değerlendirmek ve formülasyon veya nanodisklere dahil etme işleminin maya büyüme inhibisyon aktivitesini etkileyip etkilemediğini belirlemek için yapılmıştır.

  1. Daha önce tarif edilen yöntemi izleyerek 5 mg DMPC başına 1 mg ampB ve 5 mg DMPC başına 0.1 mg ampB içerecek şekilde iki ampB-nanodisk örneğini (son hacim = 1 mL) formüle edin (2.3-2.4.1).
    NOT: 5 mg DMPC başına 1 mg/mL ve 0,1 mg/mL ampB yapmak için, her bir numune şişesine DMSO stoğunda 20 mg/mL ampB'lik pipet sırasıyla 50 μL ve 5 μL pipet ekleyin.
  2. Doymuş maya kültürünün hazırlanması
    1. 25 mL steril Maya Ekstrakt-Pepton-Dekstroz (YPD) ortamını steril 50 mL konik tüpe aktarın.
    2. Tek bir Saccharomyces cerevisiae (BY4741) kolonisini 25 mL YPD ortamına aktarmak için steril bir aşılama döngüsü kullanın.
    3. Mayayı, 30 ° C'ye ayarlanmış bir sallama inkübatöründe, salınım 18 saat boyunca 200 rpm'ye ayarlanmış olarak kültürleyin.
  3. Bireysel büyüme inhibisyon testi numunelerinin hazırlanması
    1. 5 mL steril YPD ortamını 30 steril 13 mL kültür tüpüne aktarın.
    2. Üç kültür tüpü setini, sırasıyla 20, 10 ve 5 μg ampB'yi temsil eden 1 mg / mL ampB-nanodisk örneğinin 20, 10 ve 5 μL'sini ekleyerek tedavi edin.
    3. Üç kültür tüpü setini, sırasıyla 2, 1 ve 0.5 μg ampB'yi temsil eden 0.1 mg / mL ampB-nanodisk örneğinin 20, 10 ve 5 μl'sini ekleyerek tedavi edin.
    4. DMSO'da 20 μL PBS, DMSO, kontrol rHDL (ampB yok) veya 20 μg ampB ekleyerek dört kültür tüpü setini tedavi edin.
      NOT: Her kültür tüpü seti bağımsız bir kopyayı temsil eder. Bu nedenle, bu yöntemleri izlemek, n = 3'lük bir genel n değeri ile sonuçlanır.
  4. Maya canlılık testi başlatma
    1. Her numuneyi 100 μL (% 2 hacim / hacim) doymuş maya kültürü ile aşılayarak deneyi başlatın
    2. Mayayı, maksimum 18 saat boyunca 200 rpm'ye ayarlanmış salınımla 30 ° C'ye ayarlanmış bir sallama inkübatörü kullanarak kültürleyin.
  5. Maya canlılık ölçümleri
    1. Güç düğmesini çevirerek spektrofotometreyi açın, ardından WL'ye Git etiketli düğmeyi tıklayın ve değeri 600 nm olarak ayarlayın.
    2. 1 mL steril YPD ortamını iki plastik küvete aktarın, spektrofotometredeki ilgili numune portlarına yükleyin ve Otomatik Boşalt'a tıklayın.
    3. Her numuneden 1 mL'sini plastik bir küvete aktarın, her seferinde küvetleri değiştirdiğinizden ve küveti spektrofotometrenin ön numune portuna yüklediğinizden emin olun.
    4. Her numunenin optik yoğunluğunu 600 nm'de ölçün ve kaydedin ve harcanan her küvetin uygun şekilde etiketlenmiş bir biyolojik tehlike atık kabına atın.

Sonuçlar

Biyoaktif ajan nanodisk formülasyon prosesi
Tarif edilen ampB-nanodisk formülasyon prosedüründe, numune görünümü bulanıktan berraklığa geçtiğinde reaksiyon tamamlanmış sayılır (Şekil 1). Bu değişiklik, nanodisklerin oluştuğunu ve biyoaktif maddenin çözünür hale geldiğini gösterir. Çoğu zaman, biyoaktif ajanlar görünür dalga boyu bölgesindeki ışığı emer (örneğin, ampB, kurkumin, lutein, koenzim Q10) ve bu durumlarda numun...

Tartışmalar

Nanodiskler içeren bir biyoaktif maddenin formülasyonu, aksi takdirde çözünmeyen hidrofobik bileşikleri çözmek için uygun bir yöntem sağlar. Ürün biyoaktif ajan nanodiskleri sulu ortamda tamamen çözünür olduğundan, çok çeşitli hidrofobik moleküller için yararlı bir dağıtım yöntemi sağlarlar (Tablo 1). Bunlar arasında küçük moleküller, doğal ve sentetik ilaçlar, bitkisel besinler, hormonlar vb. Bulunur. Formülasyon stratejisi genellikle biyoaktif maddenin organik çöz...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R37 HL-64159) bir hibe ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BCayman Chemical Company11636ND Formulation & Standard Preparation
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & Expansion
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformation
Baffled FlaskNew Brunswick ScientificN/AExpansion & Expression
BL21 competent E coliNew England BiolabsC2527ITransformation
Centrifuge bottlesNalgene3140-0250Expression
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Formulation
DMSOSigma Aldrich472301Standard Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND Formulation
Erlenmeyer flaskBellco BiotechnologyN/AExpansion & Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubesVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (Software)DotmaticsN/AYeast Viability Assay
Heated Sonication BathVWRN/AND Formulaton
Heating and Nitrogen moduleThermo ScientificTS-18822ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LyophilizerLabconco7755030ND Formulation
MethanolFisher ScientificA452-4ND Formulation
Nitrogen gasPraxairUN1066ND Formulation
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Expansion & Expression
Pet-22B vectorGenScriptN/ATransformation
Petri dishFisher ScientificFB0875718Transformation & Expansion
Quartz CuvettesFisher Brand14385 928ASpectral Analysis
Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific68100Purification
SnakeSkin Dialysis TubingThermo Scientific88243Purification
Sodium ChlorideFisher ScientificS271Purification
Sodium Phosphate dibasicFisher ScientificS374-500Purification
Sodium Phosphate monobasicFisher ScientificBP329-500Purification
Spectra/POR Weighted ClosuresSpectrum Medical Industries132736Purification
SpectrophotometerShimadzu UV-1800220-92961-01spectral analysis
Tabletop CentrifugeBeckman Coulter366816ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)ShimadzuN/ASpectral Analysis
Vacuum filterMillipore9004-70-0Expression & Purification
Vacuum pumpGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & Purification
VortexFisher Scientific12-812ND Formulation
YeastN/ABY4741Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-DextroseBD242820Yeast Viability Assay

Referanslar

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 193nanodiskleramfoterisin Bfosfolipidapolipoproteinyeniden yap land r lm y ksek yo unluklu lipoproteinbiyoaktif ajan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır