במאמר זה מתואר פרוטוקול להגברת אות טירמיד ידנית (TSA) מולטיפלקס אימונופלואורסנציה (mIF) בשילוב עם ניתוח תמונה וניתוח מרחבי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם מקטעים משובצי פרפין קבועים פורמלין (FFPE) לצביעה של שניים עד שישה אנטיגנים לכל שקופית, בהתאם לסורק השקופיות הזמין במעבדה.
המיקרו-סביבה של הגידול (TME) מורכבת משפע של סוגי תאים שונים, כגון תאי חיסון ציטוטוקסיים ותאים אימונומודולטוריים. בהתאם להרכבו ולאינטראקציות בין תאים סרטניים לתאים פרי-גידוליים, ה-TME עשוי להשפיע על התקדמות הסרטן. אפיון גידולים והמיקרו-סביבה המורכבת שלהם עשוי לשפר את ההבנה של מחלות סרטן ועשוי לסייע למדענים ולקלינאים לגלות סמנים ביולוגיים חדשים.
לאחרונה פיתחנו מספר לוחות אימונופלואורסנציה (mIF) מרובים המבוססים על הגברת אות טירמיד (TSA) לאפיון TME בסרטן המעי הגס, קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר, מלנומה וסרטן ריאות. לאחר השלמת הצביעה והסריקה של הלוחות המתאימים, הדגימות מנותחות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. המיקום המרחבי והצביעה של כל תא מיוצאים לאחר מכן מתוכנת כימות זו ל-R. פיתחנו סקריפטים R המאפשרים לנו לא רק לנתח את הצפיפות של כל סוג תא בכמה תאי גידול (למשל מרכז הגידול, שולי הגידול והסטרומה), אלא גם לבצע ניתוחים מבוססי מרחק בין סוגי תאים שונים.
תהליך עבודה מסוים זה מוסיף ממד מרחבי לניתוח הצפיפות הקלאסי שכבר בוצע באופן שגרתי עבור מספר סמנים. ניתוח mIF יכול לאפשר למדענים להבין טוב יותר את האינטראקציה המורכבת בין תאים סרטניים לבין TME ולגלות סמנים ביולוגיים מנבאים חדשים של תגובה לטיפולים, כגון מעכבי נקודות בקרה חיסוניות, וטיפולים ממוקדים.
עם התפתחותם של טיפולים ממוקדים ומעכבי בקרה חיסונית, עלתה חשיבות עליונה לאפיון טוב יותר של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין המיקרו-סביבה הגידולית שלהם, וזהו כיום תחום חשוב של מחקר תרגומי. ה- TME מורכב משפע של סוגי תאים שונים, עם איזון של תאים ציטוטוקסיים חיסוניים המכוונים לתאים סרטניים ותאים אימונומודולטוריים שיכולים להעדיף צמיחת גידול ופולשניות 1,2,3,4. אפיון סביבה מורכבת זו עשוי לשפר את ההבנה של מחלות סרטן ועשוי לסייע למדענים ולקלינאים לגלות סמנים ביולוגיים מנבאים ופרוגנוסטיים חדשים על מנת לבחור טוב יותר חולים לטיפול עתידי 5,6. לדוגמה, גלאון וצוותו פיתחו את Immunoscore, שהיא שיטת ניקוד הניתנת לשחזור שיכולה לשמש כסמן ביולוגי מנבא. הדירוג החיסוני מחושב באמצעות צפיפות תאי T CD3+ ו- CD8+ בשוליים הפולשניים ובמרכז הגידול 7,8.
במהלך העשורים האחרונים פותחו פתרונות מסחריים עבור mIF, אך אלה לעתים קרובות יקרים ומיועדים לפאנלים ספציפיים של אנטיגנים. כדי להתגבר על הצורך בפאנלים ספציפיים של אנטיגנים במחקר אקדמי ותרגומי, פיתחנו שיטה חסכונית לביצוע mIF על קטעי גידול FFPE, המאפשרת צביעה של שניים עד שישה אנטיגנים שנוספו לגרעיני התא נגד צביעה על דגימות אדם ועכבר.
לאחר שכל חלקי הרקמה מוכתמים ונסרקים באמצעות סורק שקופיות פלואורסצנטי, ניתן לנתח את הדגימות על ידי מספר תוכנות ניתוח תמונה התומכות במערכי נתונים פירמידליים גדולים. לבסוף, הנתונים הגולמיים יכולים לשמש בסביבה למחשוב סטטיסטי וגרפיקה כמו תוכנת R (v.4.0.2) על מנת לבצע צפיפות וניתוחים מרחביים.
פרוטוקול מותאם לצביעת חמישה סמנים, כמו גם טריקים וטיפים לאופטימיזציה של לוחות חדשים, מוצג בכתב יד זה. יתר על כן, מוסברים שלבים מפורטים של ניתוח התמונה ופונקציות R המשמשות לניתוח סטטיסטי ומרחבי.
כל הדגימות המשמשות בפרוטוקול הנוכחי הגיעו ממחקר שאושר על ידי ועדות האתיקה המקומיות ואושר על ידי הרשות המוסמכת. כל המשתתפים במחקר סיפקו הסכמה מדעת בכתב. גירסת הניסיון רשומה ב-ClinicalTrials.gov (NCT03608046).
1. מולטיפלקס immunofluorescence
2. סריקת שקופיות
3. ניתוח תמונות
4. ביואינפורמטיקה באמצעות R
הערה: סקריפט R המספק פרטים נוספים על השלבים הבאים זמין ב- GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline לניתוח כתמים אימונופלואורסצנטיים מרובים. [github.com])
בעקבות פרוטוקול זה, יש לחקור מספר פרמטרים כדי לוודא שהרקמה מוכתמת כראוי. ראשית, צביעת TSA צריכה להציג טווח דינמי טוב בעת שימוש בזמני חשיפה נמוכים (בדרך כלל 2-100 אלפיות השנייה) במהלך תהליך הסריקה. זמן חשיפה נמוך מרמז על כך שההגברה נעשתה כראוי במהלך התגובה עם HRP. עבור אנטיגנים המוכתמים בנוגדן המשני הצמוד ישירות לפלואורוכרום, זמן החשיפה יכול להיות ארוך בהרבה, מה שעלול להוביל להלבנה (ירידה בעוצמת האות עקב זמן חשיפה ארוך). שנית, חשוב לוודא שכל כתם מציג SNR גבוה. אות רקע גבוה עם אות אנטיגן נמוך יכול להיות אינדיקציה לכך שהנוגדן הראשוני אינו ספציפי מספיק, שהפרוקסידאזות האנדוגניות לא הושבתו כראוי, או ששלב אחד של הפרוטוקול לא נעשה כראוי. שלישית, בהתאם לסורק השקופיות ולערכות המסננים המשמשות לסריקה, ניתן לראות חפיפה בין שני צבעים (לדוגמה, AF555, AF594 ו- AF647). בחירת ערכות הסינון הנכונות בסורק ודילול הנוגדנים הראשוני הנכון הן חיוניות כדי למנוע גילויים צולבים אפשריים. בקרת איכות כוללת זיהוי של תאים מוכתמים בודדים עבור כל סמן בקובץ הסרוק. לבסוף, חשוב גם להוסיף שליטה חיובית ושלילית עבור כל אצווה של צביעה. עבור תאים חיסוניים, השקדים הם שליטה חיובית טובה. תוצאה מייצגת של צביעה אופטימלית מוצגת באיור 1.
איור 1: סרטן רקטלי מתקדם מקומי המוכתם על-ידי אימונופלואורסנציה מרובה. קיצורים: PD-1 = חלבון מוות תאי מתוכנת 1; PD-L1 = ליגנד מוות מתוכנת 1; ROR-γ = גמא קולטן יתום הקשור ל- RAR; CD3 = אשכול של בידול 3; hPanCK = פאן-ציטוקרטין אנושי. כל צביעת אנטיגן נסרקת בגווני אפור, והצבעים המוצגים באיור הם פסאודו-צבעים. סרגל קנה מידה הגדלה נמוכה: 200 מיקרומטר; סרגל קנה מידה הגדלה גבוהה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי גרעינים וכתמים של סרטן רקטלי מתקדם מקומי באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. ללא פרמטר אחוז השלמות מוגדר כראוי, התוכנה מזהה שני תאי CD8+ (עיגול ירוק) מכיוון שהם קרובים זה לזה, אך רק תא אחד מוכתם. שימוש בשלמות של 70% מסייע למנוע זיהוי חיובי כוזב זה. ירוק = hPanCK; צהוב = CD3; כתום = CD8. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח תמונות ושחזור תרשים R של גרורות בסרטן המעי הגס בכבד. על צביעת המרבב (משמאל), pan-cytokeratin אנושי הוא בצהוב, CD3 הוא בירוק, CD8 הוא בכחול בהיר, ו- IDO הוא בכתום. בתרשים הנקודות (מימין), תאי פאן-ציטוקרטין+ אנושיים הם בצהוב, תאי CD3+CD8− בירוק, תאי CD3+CD8+ בכחול, ותאי IDO+ בכתום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח קטע כירורגי של HNSCC. (A) קטע כירורגי של HNSCC. תאים סרטניים נראים בירוק. תאים פרי-גידוליים מוצגים סביב איי הגידול (CD3 בצהוב ו-CD8 בסגול). (B) מרכז הגידול (בצהוב עם גבול שחור) מחושב ביואינפורמטית על ידי אלגוריתם k-nearest-neighbor בהתבסס על המרחק בין איי הגידול מאזור יחיד. סביב אזור זה, שוליים פולשניים (צהוב בהיר עם גבול אפור) מחושבים על בסיס שרירותי של 500 מיקרומטר. (C) תאי T פולשניים מודגשים עם נקודות שחורות במרכז הגידול ונקודות אפורות בשוליים הפולשניים. תאי T אחרים מודגשים בנקודות ירוקות בהירות. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מפת חום של צפיפות סוגי תאים שונים של ביופסיות סרטן רקטלי מתקדם מקומי. מפת החום שורטטה באמצעות אשכולות ללא פיקוח של צפיפויות של סוגי תאים שונים מלוחות מולטיפלקס שונים עם חבילת ComplexHeatmap. קנה מידה ומרכוז שימשו לנורמליזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מרחקים של תאי CD4+ ו-CD8+ לכל תא IDO+ או תא גידולי. תאי פאן-ציטוקרטין + אנושיים הם בצהוב, תאי CD3+CD8 בירוק, תאי CD3+CD8+ בכחול, ותאי IDO+ בכתום. (A) המרחק הקרוב ביותר בין תאי הגידול לבין כל תא CD8+ T. (B) ברשימים של המרחקים בין תאי IDO+ לבין כל תא T CD8+ (כחול) או CD4+ T (ירוק). (C) דוגמה למדגם שנותח על ידי פונקציית G-cross. ציר ה-y מראה את ההסתברות של תא גידול להיתקל בלימפוציטים CD3+ ברדיוס הנע בין 0-200 מיקרומטר סביב התא הסרטני. מוצגות שלוש עקומות; העקומה התיאורטית היא בירוק מנוקד (התפלגות פואסון), העקומה האמפירית המתוקנת עם תיקון ק"מ היא בשחור, והעקומה האמפירית המתוקנת עם תיקון גבול היא באדום מנוקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: איור של ספירת ריבוע. חישוב גבולות וספירת ריבועים בוצעו באמצעות חבילת המרית. ניתן להשתמש בריבועים (נקודות חמות) המסתננים ביותר לסטטיסטיקה במורד הזרם. CD4 הוא בירוק, CD8 הוא באדום, ותאי הגידול הם בצהוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: דילול נוגדנים ואופטימיזציה של שליפת אנטיגן. זיהוי כרומוגני של PD-1 באמצעות שלושה דילולים שונים ושתי תמיסות שליפת אנטיגן שונות של הנוגדן הראשוני (ציטראט pH 6 ו- EDTA pH 9). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
נוגדן ראשוני | דילול | שליפת אנטיגן | נוגדן משני | פלואורוכרום | מיקום |
PD-1 | 1/100 | EDTA (pH 9) | נגד ארנב | AF647 | 1 |
PD-L1 | 1/1000 | EDTA (pH 9) | נגד ארנב | AF488 | 2 |
ROR-γ | 1/200 | EDTA (pH 9) | אנטי-עכבר | ATT0-425 | 3 |
CD3 | 1/100 | ציטראט (pH 6) | נגד ארנב | AF555 | 4 |
hPanCK | 1/50 | ציטראט (pH 6) | אנטי-עכבר בשילוב עם AF750 | 5 |
טבלה 1: דוגמה לחלונית מולטיפלקס ממוטבת. קיצורים: PD-1 = חלבון מוות תאי מתוכנת 1; PD-L1 = ליגנד מוות מתוכנת 1; ROR-γ = גמא קולטן יתום הקשור ל- RAR; CD3 = אשכול של בידול 3; hPanCK = פאן-ציטוקרטין אנושי; AF = AlexaFluor; EDTA = חומצה ethylenediaminetetraacetic. CD3 משמש לזיהוי לימפוציטים מסוג T; PD-1 משמש לאיתור לימפוציטים מותשים; ROR- γ משמש לגילוי Th-17; ו-hPanCK משמש לזיהוי תאים סרטניים. עמודת המיקום מציינת את הסדר שבו יש לבצע את המרבב הרציף.
הפרמטרים החשובים ביותר שיש לקחת בחשבון כדי לייעל את צביעת המרבב הם הדילול, הספציפיות ושליפת האנטיגן המשמשת לכל נוגדן ראשוני. לפני תחילת פרוטוקול מולטיפלקס, יש לבדוק את הדילול האופטימלי של כל נוגדן ראשוני ואת שליפת האפיטופ האופטימלית (pH 6 או pH 9) באמצעות צביעה כרומוגנית (DAB). אנו ממליצים לבדוק שלושה דילולים עבור כל מאגר שליפת אנטיגן: הדילול שמוגדר בדרך כלל על ידי המותג המסחור את הנוגדן, אותו דילול מחולק פי שניים, ואותו דילול מוכפל פי שניים (איור 8). בחירת הדילול הנכון היא צעד חשוב מאוד לאימות ספציפיות הנוגדנים ולאופטימיזציה של יחס אות לרעש (SNR) של הצביעה. לאחר בחירת הדילול הנכון ב- DAB, יש לבדוק את אותו דילול עבור כל נוגדן ראשוני באמצעות Uniplex TSA. לאחר בחירת חיץ הדילול ושליפת האפיטופ עבור כל צביעת אנטיגן, חשוב גם להגדיר נכון את רצף המרבב; באופן ספציפי, אנטיגנים מסוימים מוכתמים טוב יותר במיקום הראשון ואחרים במיקום האחרון. אנו ממליצים לבדוק את התיוג המרובב באמצעות כל תמורות ההזמנה האפשריות כדי לבחור איזה מכתים אנטיגן צריך לבוא ראשון, שני, וכו ' זהו גם צעד חשוב מאוד מכיוון שחלק מהאנטיגנים השבירים יכולים להתפרק לאחר מספר סבבים של שליפת אפיטופים, וחלק מהאנטיגנים מוכתמים טוב יותר לאחר מספר סבבים של שליפת אפיטופים. לדוגמה, SNR הוא תמיד גבוה יותר במיקום האחרון עבור CD3 ובמצב הראשון עבור צביעת PD-1. יתר על כן, הצביעה של מספר אנטיגנים מקומיים יכולים להיות מופרעים על ידי אפקט מטריה (הרוויה של אתרים תגובתיים טירמיד). זה יכול להיות מוחלש על ידי הפחתת ריכוז טירמיד. כאשר ביטוי של אנטיגן אחד מותנה בביטוי של אנטיגן אחר (CD8 קיים רק על תאי T המבטאים CD3), אנו ממליצים לצבוע את האנטיגן בביטוי הרחב ביותר (CD3 במקרה זה) אחרי השני. לבסוף, בחירת הפלואורוכרום הנכון לכל צביעת אנטיגן בהתאם לספציפיות הסורק היא גם צעד חשוב כדי למנוע זיהוי צולב.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם ההגברה ויחס האות לרעש המתקבל. עם זאת, טכניקה זו מגיעה עם מגבלה, והיא כי מכתים הוא רציף, ואת fluorochromes קשורים באופן קוולנטי לרקמה. עם זאת, לאחר ביצוע כל סבבי הגברת אות הטירמיד, ניתן גם להוסיף צביעה אחרונה עם נוגדן משני המשולב ישירות עם פלואורוכרום (ללא TSA). בחלק מהפאנלים השתמשנו בשיטה זו כדי להוסיף צביעה בערוץ 750. זה היה הכרחי מכיוון שאף טירמיד-AF750 לא היה זמין מסחרית באותה תקופה. יש לציין כי זמן החשיפה (במהלך הסריקה) של האנטיגן המוכתם ב-AF750 יהיה ארוך בהרבה מאשר עבור האנטיגנים האחרים המוכתמים ב-TSA. במקרה זה, אנו ממליצים להכתים חלבון בעל ביטוי גבוה כגון cytokeratin או להגדיל את הריכוז של הנוגדן הראשוני. על ידי כך, ניתן להכתים מקסימום חמישה עד שישה אנטיגנים בכל שקופית באצווה אחת, בהתאם לסורק הפלואורסצנטי.
בניגוד לכך, מספר טכניקות מסחריות משתמשות בצביעה סדרתית עם מספר סבבים של צביעה, סריקה והפשטה או הלבנה כדי לשפר את מספר האנטיגנים שניתן להכתים על קטע רקמה אחד בודד. עם זאת, טכניקות אלה הן לעתים קרובות זמן רב, יקר, אין הגברה אותות, דורשים צעדים חישוביים מתקדמים כדי למזג את הסריקות הטוריות כראוי, ומניסיוננו, יכול לגרום נזק בלתי הפיך לרקמות עקב שלבי הליך רבים. עם זאת, דווח כי ניתן להכתים עד 30 אנטיגנים על רקמה אחת בודדת בשיטה זו14.
לסיכום, השיטה שלנו היא טכניקת אימונוהיסטופלואורסנציה חזקה, ניתנת לשחזור, קלה לשימוש וחסכונית שניתן להשתמש בה בכל מעבדה בעלת סורק שקופיות פלואורסצנטי. ניתן להשתמש בכל נוגדן ראשוני מסחרי המתאים ל-IHC, והפאנלים אינם ספציפיים לערכות מסחריות כלשהן. ניתוח התמונה יכול להיעשות על מספר תוכנות שונות, כולל תוכנות קוד פתוח כגון QuPath ו- R. עם זאת, אנו סבורים כי שיטה זו אף יכולה להשתפר בעתיד עבור לוחות אנטיגן גדולים, ולאפשר ביצוע צביעה/סריקה סדרתית של אותה שקופית עם פאנלים שונים של אנטיגנים ועם היתרון של הגברת אותות.
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
המחברים רוצים להודות לד"ר דרואן פ. על עזרתה ותמיכתה. ניקולס הויג הוא עמית מחקר הנתמך על ידי מענק מהקרן הלאומית הבלגית למחקר מדעי (Télévie/FNRS 7460918F).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
ATTO-425 | ATTOtec | ||
Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
HALO software | Indicalabs | ||
Hoescht | Sigma | 14533 | |
Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved